Analyse du phénotype squelettique d’un modèle murin de suppression conditionnelle de Stat3

Les modèles de souris génétiquement modifiés sont des outils puissants pour étudier les mécanismes de la maladie humaine in vivo. L’analyse du phénotype squelettique des souris est à la base de la recherche squelettique. Cette particule décrit certaines techniques typiques d’analyse du phénotype squelettique qui peuvent être intéressantes pour ceux qui débutent dans la recherche sur les tissus squelettiques.

Lorsque vous essayez cette particule, gardez à l’esprit que les expériences sur les animaux prennent du temps, alors collectez autant d’échantillons de haute qualité que possible au cours de chaque expérience, même si vous n’en avez pas besoin à court terme. Commencez par placer une souris euthanasiée en position couchée et disloquez doucement les articulations bilatérales de la hanche à la main. À l’aide de ciseaux ophtalmiques, coupez verticalement la peau du tibia distal, puis retirez toute la peau du membre postérieur.

Coupez le ligament articulaire de l’articulation de la hanche droite et de l’articulation du genou avec des ciseaux pour séparer le membre postérieur. Coupez ensuite l’os aux deux extrémités pour l’immerger complètement dans 4 % de PFA. Coupez le trochanter et la jonction du péroné.

Immergez le membre postérieur dans 4 % de PFA, en gardant le membre postérieur droit pour la section en paraffine. Coupez les ligaments articulaires des articulations de la hanche gauche et du genou avec des ciseaux et retirez doucement les tissus mous. Séparez le tibia et le fémur et plongez-les séparément dans de l’éthanol à 75 %.

Conservez le fémur pour la microtomodensitométrie et les tibias pour le double marquage en rouge de calcéine et d’alizarine. Pour préparer les sections de paraffine, lavez doucement le membre postérieur droit fixé trois fois avec du PBS pendant 10 minutes par lavage. Ensuite, détartrez-le à 15 % d’EDTA avec un détartrant à ultrasons pendant trois à quatre semaines jusqu’à ce que les os puissent être pliés, en remplaçant le liquide détartrant tous les deux jours.

Après le détartrage, lavez les échantillons trois fois avec du PBS et plongez-les dans de l’éthanol à 75 % à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le deuxième jour, immergez séquentiellement les échantillons dans de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 100 % et du xylène pendant une heure chacun. Immergez les échantillons dans moitié du xylène et moitié de la paraffine pendant 30 minutes, puis dans de la parexposition à 65 degrés Celsius pendant la nuit.

Pour enfoncer l’échantillon, immergez-le dans de la paraffine, en plaçant le fémur et le tibia à un angle de 90 degrés. Lorsque la paraffine a complètement refroidi, retirez les échantillons du réservoir d’enrobage. Numérotez-les et conservez-les à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit.

Faites cuire les sections de paraffine à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis faites-les cirer en les immergeant dans du xylène pendant 10 minutes. Immergez les sections trois fois avec du xylène frais à chaque fois. Réhydratez les sections en les immergeant séquentiellement dans 100 % d’éthanol, 95 % d’éthanol, 70 % d’éthanol et de l’eau distillée pendant cinq minutes chacune.

Préparez la solution de coloration à l’aide du kit de coloration TRAP et réchauffez-la à 37 degrés Celsius. Ajoutez 50 à 100 microlitres de solution de coloration à chaque section et incubez-les dans une chambre humide à 37 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes. Vérifiez l’état de coloration des ostéoclastes au microscope optique toutes les cinq minutes jusqu’à ce que l’on puisse voir des ostéoclastes multinucléés rouges.

Terminez ensuite la réaction avec de l’eau. Contre-colorez les sections dans une solution d’hématoxyline pendant 30 secondes et créez une couleur bleue stable en les immergeant dans une solution d’ammoniac à 1 % pendant une minute. Ensuite, rincez-les à l’eau du robinet qui coule lentement.

Montez les sections à l’aide de lamelles de protection avec du baume neutre et séchez-les pendant la nuit. Capturez trois à cinq champs de vision avec un microscope et analysez le périmètre trabéculaire avec l’image J.Utilisez l’outil en ligne droite pour mesurer la longueur de la barre d’échelle en L1. Utilisez ensuite l’outil de ligne segmentée pour mesurer la longueur du périmètre trabéculaire en tant que L2. Calculez la longueur physique et comptez le nombre de cellules positives à TRAP avec plus de trois noyaux. Après la fixation, lavez doucement les tibias trois fois avec du PBS et plongez séquentiellement les échantillons dans de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 100 % et du xylène pendant cinq minutes chacun.

Immergez les échantillons dans de l’acétone pendant 12 heures, moitié dans de l’acétone et moitié dans de la résine pendant deux heures, puis dans de la résine pure dans une étuve de séchage pendant la nuit. Ajoutez de la résine pure dans un réservoir d’enrobage de gel de silice approprié et placez les échantillons dans le réservoir en évitant les bulles. Polymériser la résine dans une étuve de séchage à 60 degrés Celsius pendant 48 heures.

Coupez les échantillons en sections de cinq micromètres d’épaisseur en continu avec un microtome rotatif et stockez le reste des échantillons avec un dessiccant à température ambiante. Collez les sections avec une pince à épiler dans une goutte d’éthanol à 75 % et fixez-les avec des lamelles de recouvrement à l’aide de baume neutre. Capturez le marquage de fluorescence rouge et vert à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Des souris de délétion Stat3 spécifiques aux ostéoclastes ont été générées pour étudier l’influence de la délétion de Stat3 sur la différenciation des ostéoclastes. La reconstruction fémorale et l’analyse quantitative par micro-tomodensitométrie ont indiqué que la masse osseuse des souris Stat3 Ctsk était augmentée par rapport aux souris de type sauvage. La morphologie histologique des fémurs de souris de type sauvage et Stat3 Ctsk a été examinée par coloration H et E.

L’activité ostéoclastogène a été détectée à l’aide de la coloration TRAP. Les ostéoclastes sont de grandes cellules positives au TRAP avec plusieurs noyaux. Le nombre d’ostéoclastes positifs à TRAP était plus faible chez les souris Stat3 Ctsk, par rapport aux souris de type sauvage, ce qui indique que le déficit en Stat3 a altéré la formation d’ostéoclastes.

L’ostéogenèse a été mesurée par double marquage à la calcéine et au rouge d’alizarine. La zone entre la calcéine et la fluorescence rouge d’alizarine représente l’os nouvellement formé. La suppression de Stat3 dans les ostéoclastes n’a pas influencé l’anabolisme osseux.

Des coupes de paraffine sagittale dans lesquelles le cartilage était plus tard symétrique et qui ont montré que la ligne claire en forme de M a été utilisée ici. Pour les études, nous inclurons plus de caractéristiques du système squelettique, telles que les propriétés mécaniques.