Name: Analyse du phénotype squelettique d’un modèle murin de suppression conditionnelle de Stat3 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Découvrez l'analyse phénotypique squelettique chez des souris transgéniques Stat3 Ctsk par micro CT, coloration TRAP et marquage double. Cette méthode révèle le rôle de Stat3 dans la différenciation des ostéoclastes et la régulation de la masse osseuse.

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Nous remercions le Professeur Weiguo Zou et S. Kato pour les réactifs et les souris et les membres du laboratoire Zou pour leurs discussions utiles. Nous remercions également le Laboratoire de stomatologie numérisée et le Centre de recherche sur les anomalies craniofaciales du neuvième hôpital populaire de Shanghai pour son aide. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit &Plateau Disciplines, du fonds SHIPM-mu de l’Institut de médecine de précision de Shanghai, du Neuvième Hôpital populaire de Shanghai, de l’École de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai [JC201809], du projet d’incitation de l’équipe d’innovation de haut niveau pour l’École de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai , le Fonds de recherche interdisciplinaire du neuvième hôpital populaire de Shanghai, École de médecine de l’université JiaoTong de Shanghai [JYJC201902]. Et L.J. est un chercheur du programme de développement des jeunes talents médicaux exceptionnels, du programme de développement des jeunes « Rising Stars of Medical Talent » de Shanghai et du projet « Chen Xing » de l’Université Jiaotong de Shanghai.

Toutes les méthodes relatives aux animaux décrits ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’École de médecine de l’Université Jiaotong de Shanghai.
1. Élevage de souris de délétion Stat3 spécifiques à l’ostéoclaste
REMARQUE: Les souris Stat3fl/fl ont été obtenues commercialement. Les souris Ctsk-Cre ont été fournies par S. Kato (Université de Tokyo, Tokyo, Japon12). Les souris ont été élevées et maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes (FPS) dans l’établissement pour animaux de l’établissement dans des conditions normalisées.
<ol><li>Associez une souris mâle sexuellement mature à deux souris femelles du même âge. Après 18 jours, vérifiez les contrôles quotidiens pour les nouveau-nés. Séparez les souris femelles gravides et gardez-les seules si nécessaire. Changer les souris mâles entre différentes cages de reproduction si les souris femelles n’étaient pas enceintes dans les 1 mois suivant l’appariement.</li>
	<li>Croiser lessourisStat3 fl/fl aux souris Ctsk-Cre (F0). Coupez les queues pour le génotypage et gardez le mâle Stat3fl/+; Les souris Ctsk-Cre jusqu’à ce qu’elles soient sexuellement matures, soit environ 6 semaines (F1). Utilisez les amorces suivantes : Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC.</li>
	<li>Cross mâle de 6 semaines Stat3fl/+; Souris Ctsk-Cre avec des souris femelles Stat3fl/fl. Coupez les queues pour le génotypage et gardez le mâle Stat3 fl /fl; Les souris Ctsk-Cre jusqu’à ce qu’elles soient sexuellement matures, soit environ 6 semaines (F2).</li>
	<li>Cross mâle de 6 semaines Stat3 fl/fl; Souris Ctsk-Cre avec des souris stat3femelles fl/fl (F3). Coupez les queues pour le génotypage et remplacez les vieilles souris reproductrices par des souris plus jeunes à temps (F3+N).</li>
</ol>2. Prélèvement de spécimens
<ol><li>Euthanasier six paires de souris mâles Stat3fl/fl et Stat3Ctsk mâles de 8 semaines séparément avec asphyxie au dioxyde de carbone. NOTA : Le débit de CO2 déplace 30 % du volume de la cage par minute (p. ex., pour une cage de 45 cm x 30 cm x 30 cm, le débit de CO2 est de 40 L/min).</li>
	<li>Placez les souris en décubitus dorsal. Disloquer doucement les articulations bilatérales de la hanche à la main. Utilisez des ciseaux ophtalmiques pour couper la peau verticalement du tibia distal, puis disséquer toute la peau du membre postérieur.</li>
	<li>Couper le ligament articulaire de l’articulation droite de la hanche et de l’articulation du genou avec des ciseaux pour séparer le membre postérieur. Couper le trochanter et la jonction du péroné puis immerger le membre postérieur dans du paraformaldéhyde à 4%. Conservez les membres postérieurs droits pour l’étape 3. Couper de manière appropriée l’os aux deux extrémités pour immerger complètement et fixer la moelle osseuse avec du paraformaldéhyde à 4%.</li>
	<li>Coupez le ligament articulaire de l’articulation de la hanche gauche et de l’articulation du genou avec des ciseaux, retirez doucement les tissus mous et séparez soigneusement le tibia et le fémur. Plongez le tibia et le fémur séparément dans de l’éthanol à 75%. Conservez les fémurs pour l’étape 4 et les tibias pour l’étape 6. Assurez-vous de garder le trochanter intact.</li>
</ol>3. Préparation de la section de paraffine
<ol><li>Fixer le membre postérieur droit dans du paraformaldéhyde à 4 % à 4 °C pendant 48 h.</li>
	<li>Décalcifier: Lavez doucement les échantillons avec 1x PBS pendant 10 min 3 fois. Décalcifier les échantillons dans 15% d’EDTA (150 g d’EDTA dans 800 mL deddH2Oet 100 mL de PBS 10x) avec un décalcificateur ultrasonique pendant 3 à 4 semaines jusqu’à ce que les os puissent être pliés. Remplacer par du liquide décalcifiant frais tous les deux jours.</li>
	<li>Lavez doucement les échantillons 3x avec 1x PBS, puis plongez-les dans de l’éthanol à 75% à 4 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Déshydratation: Le deuxième jour, immerger séquentiellement les échantillons dans de l’éthanol à 95%, de l’éthanol à 100% et du xylène, chacun pendant 1 h deux fois.</li>
	<li>Immerger les spécimens dans 1/2 xylène 1/2 paraffine pendant 30 min. Plongez les spécimens dans de la paraffine à 65 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Embed: Sélectionnez un réservoir d’encastrement approprié pour l’encastrement. Placez le tibia uniformément en dessous. Placez le fémur et le tibia à un angle de 90°. Une fois que la paraffine a été complètement refroidie et solidifiée, retirez-la du réservoir d’encastrement. Numérotez les spécimens et conservez-les à -20 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Couper des sections de 5 μm d’épaisseur en continu à l’aide du microtome. Coupez 20 à 40 sections. Étalez les sections sur de l’eau à 37 °C, adhérez-les aux lames du microscope et faites cuire à 42 °C pendant la nuit.</li>
</ol>4. Micro-CT balayage et analyse
<ol><li>Scannez les fémurs gauches avec un micro-scanner. Résolution: 10 μm; Tension: 70 kV; Courant : 114 μA; Fliter : 0,5 mm Al ; Étape de rotation : 0,5°.</li>
	<li>Reconstruire des images 3D de l’os cortical et de l’os trabéculaire à l’aide du logiciel de support du scanner en suivant les instructions du fabricant. Les ROIs sont dans une largeur totale de 1 mm d’os trabéculaire près du plat distal de croissance et dans une section totale de 1 millimètre de large de l’os cortical au milieu des fémurs.</li>
	<li>Calculer les paramètres quantitatifs de microarchitecture : densité minérale osseuse (DMO), fraction volumique osseuse (BV/TV), épaisseur trabéculaire (Tb.Th.), nombre trabéculaire (Tb.N.), séparation trabéculaire (Tb.Sp.) et épaisseur corticale osseuse (Ct.Th.).</li>
</ol>5. Coloration TRAP
<ol><li>Cuire les sections de paraffine à 65 °C pendant 30 min.</li>
	<li>Dewax: Plongez les sections dans le xylène pendant 10 min. Effectuez cette étape 3x avec du xylène frais.</li>
	<li>Réhydrater : Immerger les sections séquentiellement dans de l’éthanol à 100 %, de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 70 % et du ddH2O, chacun pendant 5 min deux fois.</li>
	<li>Préparer la solution de coloration à l’aide de la trousse de coloration TRAP en suivant les instructions du fabricant et réchauffer à 37 °C. REMARQUE: La solution de coloration TRAP doit être fraîchement préparée immédiatement avant chaque essai.</li>
	<li>Ajouter une solution de coloration de 50 à 100 μL à chaque échantillon et incuber dans une chambre humide à 37 °C pendant 20 à 30 min. Vérifiez l’état de coloration des ostéoclastes au microscope optique toutes les 5 minutes jusqu’à ce que des ostéoclastes multinucléés rouges puissent être vus. Terminez la réactionavec ddH2 O.</li>
	<li>Contre-tache dans une solution d’hématoxyline pendant 30 s. Créez une couleur bleue stable par immersion dans une solution d’ammoniac à 1% pendant 1 min. Rincer à l’eau du robinet qui coule lentement.</li>
	<li>Montez les sections avec des lamaux à l’aide de baume neutre et séchez pendant la nuit.</li>
	<li>Capturez 3 à 5 champs d’intérêt au microscope. Analyser le périmètre trabéculaire par l’image J: mesurer la longueur de la barre d’échelle (Ls) en utilisant l’outil 'ligne droite' comme L1, puis mesurer la longueur du périmètre trabéculaire en utilisant l’outil 'ligne segmentée' comme L2, la longueur physique (Lp)= Ls*L2 /L1). Comptez le nombre de cellules TRAP-positives avec plus de trois noyaux.</li>
</ol>6. Double étiquetage de calcine et d’alizarine rouge
<ol><li>Préparation de l’échantillon : Injecter par voie intrapéritonéale 20 mg/kg de caltine (1 mg/mL dans une solution de NaHCO3 à 2 %) le jour 0, et 25 mg/kg d’alizarine rouge S (AL, 2 mg/mL dansH2O)le jour 4. Sacrifier des souris le jour 7. Dissocier soigneusement les tibias et fixer dans du paraformaldéhyde à 4 % à 4 °C pendant 48 h.</li>
	<li>Déshydratation: Après fixation, lavez doucement les tibias 3x avec 1x PBS. Plongez séquentiellement les éprouvettes dans de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 100 % et du xylène pendant 5 min deux fois séparément.</li>
	<li>Plongez les éprouvettes dans de l’acétone pendant 12 h, dans 1/2 d’acétone 1/2 résine pendant 2 h, et dans de la résine pure dans un four de séchage pendant la nuit. NOTA : La résine a été préparée à l’aide de résine disponible dans le commerce (p. ex. résine Embed 812) conformément aux instructions du fabricant.</li>
	<li>Incorporer: Ajoutez de la résine pure dans un réservoir d’encastrement de gel de silice approprié et placez les échantillons doucement pour éviter les bulles. Polymériser la résine dans un étuve de séchage à 60 °C pendant 48 h.</li>
	<li>Couper les éprouvettes en sections épaisses de 5 μm en continu à l’avec un microtome rotatif. Conservez le reste des échantillons avec du desséchant à température ambiante.</li>
	<li>Adhérez aux sections avec une pince à épiler dans une goutte de 75% d’alcool. Montez les sections avec des lamaux à l’aide de baume neutre. Capturez le étiquetage de fluorescence rouge et vert avec un microscope à fluorescence.</li>
	<li>Mesurez la largeur entre deux lignes d’étiquetage (Ir.L.Wi), le périmètre trabéculaire monétique (sL.Pm), le périmètre trabéculaire à double étiquette (dL.Pm) et le périmètre trabéculaire total (Tb.Pm). Calculer le taux d’apposition minérale (MAR) et le taux de formation osseuse (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/jours d’intervalle. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les modèles murins génétiquement modifiés sont couramment utilisés pour étudier le mécanisme et le traitement pharmaceutique des maladies humaines13. Les souris Ctsk-Cre ont été largement utilisées pour les études fonctionnelles des ostéoclastes6. La présente étude a décrit les protocoles des méthodes pour analyser le phénotype squelettique et pour étudier les gènes critiques contrôlant l’activité osteoclast in vivo.
L’analyse histologiq...

L’os squelettique est le principal organe porteur du corps humain et est sous la pression de l’environnement interne et externe pendant la marche et l’exercice1. Tout au long de la vie, les os passent continuellement par l’auto-renouvellement, qui est équilibré par les ostéoblastes et les ostéoclastes. Le processus d’élimination des ostéoclastes des os anciens et de la formation de nouveaux os par les ostéoblastes maintient l’homéostasie et la fonction mécanique du système squelettique2. Une perturbation de l’équilibre peut induire des maladies métaboliques osseuses, telles que l’ostéoporose. L’ostéoporose, qui est causée par une activité ostéoclastique excessive, est répandue à l’échelle mondiale et entraîne des pertes économiques substantielles pour la société2,3,4. Selon le nombre limité de médicaments disponibles pour le traitement de l’ostéoporose et leur risque d’effets indésirables4, il est important de dévoiler les détails de la formation et de l’activité de l’ostéoclaste.
Les ostéoclastes dérivés de la lignée hématopoïétique monocyte/macrophage ont des noyaux multiples (peuvent avoir de 2 à 50 noyaux) et sont grands (généralement supérieurs à 100 μm de diamètre)2. Bien que l’exploration des mécanismes et le criblage des drogues pour des désordres osteoclastic aient été largement améliorés par l’intermédiaire de la culture osteoclast in vitro, les réactions organiques compliquées rendent l’évidence in vivo indispensable pour la thérapie visée. En raison des similitudes génétiques et physiopathologiques entre les souris et les humains, les modèles murins génétiquement modifiés sont couramment utilisés pour étudier les mécanismes et les traitements pharmaceutiques des maladies humaines in vivo6. Le système Cre-loxP est une technologie largement utilisée pour l’édition de gènes de souris et a permis aux chercheurs d’étudier les fonctions des gènes d’une manière spécifique aux tissus/cellules5. La cathepsine K (CSTK) est une cystéine protéase sécrétée par des ostéoclastes qui peuvent dégrader le collagène osseux8. Il est bien accepté que CTSK soit sélectivement exprimé dans les osteoclasts mûrs ; par conséquent, les souris Ctsk-Cre sont considérées comme un outil utile pour les études fonctionnelles des ostéoclastes et ont été utilisées6.
La famille des transducteurs de signaux et activateurs de transcription (STAT) est classique et très importante dans l’immunité et la progression et le développement du cancer7,8. Parmi les sept STATs, STAT3 est signalé comme le plus pertinent pour l’homéostasie osseuse9,10. Plusieurs études in vivo ont rapporté que l’inactivation spécifique de STAT3 dans les ostéoblastes diminue la formation osseuse9,10. Néanmoins, les preuves solides concernant la participation de STAT3 à la formation d’ostéoclastes et au métabolisme osseux in vivo sont encore limitées. Récemment, nous avons fourni des preuves in vivo avec un modèle murin de suppression Stat3 spécifique à l’ostéoclaste (Stat3fl/ fl; Ctsk-Cre, ci-après appelé Stat3Ctsk) que STAT3 participe à la différenciation ostéoclaste et au métabolisme osseux11. Dans la présente étude, nous décrivons les méthodes et les protocoles que nous avions l’habitude d’analyser les changements de la masse d’os, de l’histomorphologie d’os, et de l’anabolisme et du catabolisme d’os des souris Stat3Ctsk afin d’étudier l’influence de la suppression STAT3 osteoclast-spécifique sur l’homéostasie d’os.

<table><tbody><tr><td>Solution de paraformaldéhyde à 4 %</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E672002</tr><tr><td>Acetone</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>80000360</tr><tr><td>Alizarine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’ammoniac</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Ctsk-Cre</td><td></td><td></td><td>souris un don de S. Kato, Université de Tokyo, Tokyo, Japon</td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>13710</td><td></td></tr><tr><td>DeCa RapidlyDecalcifier</td><td>Pro-Cure</td><td>DX1100</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>EMBED 812 RESIN</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>microscope à fluorescence</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hématoxyline</td><td>Beyotime Biotechanology</td><td>C0107</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>Scanco Medical AG</td><td>&mu ; CT 80</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>10018918</tr><tr><td>Neutre baume</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E675007</tr><tr><td>NMA</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>19000</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A601889</tr><tr><td>microtome rotatif</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Stat3fl/fl souris</td><td>GemPharmatech Co., Ltd</td><td>D000527</td><td></td></tr><tr><td>TRAP staining kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>xylene</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td>Référence 1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse du phénotype squelettique d’un modèle murin de suppression conditionnelle de stat3

Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model

Les modèles murins transgéniques sont puissants pour comprendre les gènes critiques contrôlant la différenciation et l’activité de l’ostéoclaste, et pour étudier les mécanismes et les traitements pharmaceutiques de l’ostéoporose. Cathepsine K (Ctsk)-Crémeurs ont été largement utilisés pour les études fonctionnelles des ostéoclastes. Le transducteur de signal et activateur de transcription 3 (STAT3) est pertinent dans l’homéostasie osseuse, mais son rôle dans les ostéoclastes in vivo reste mal défini. Pour fournir la preuve in vivo que STAT3 participe à la différenciation des ostéoclastes et au métabolisme osseux, nous avons généré un modèle murin de délétion Stat3 spécifique à l’ostéoclaste (Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre) et analysé son phénotype squelettique. Le balayage de Micro-CT et la reconstruction 3D ont impliqué la masse accrue d’os chez les souris knockout conditionnelles. La souillure de H&E, la double souillure rouge de calcein et d’alizarin, et la souillure acide tartrate-résistante de la phosphatase (PIÈGE) ont été exécutées pour détecter le métabolisme d’os. En bref, ce protocole décrit quelques méthodes et techniques canoniques pour analyser le phénotype squelettique et pour étudier les gènes critiques contrôlant l’activité osteoclast in vivo.

Utilisant le protocole actuel, des souris spécifiques osteoclast de suppression Stat3 ont été produites pour étudier l’influence de la suppression STAT3 sur la différentiation osteoclast. Les souris Stat3Ctsk et leurs compagnons de litière de type sauvage (WT) ont été élevés et gardés après le génotypage. Des macrophages de moelle osseuse ont été isolés et cultivés en osteoclasts, et la suppression STAT3 chez les souris Stat3Ctsk a été démontrée (<strong ...

Ce protocole décrit une méthode canonique pour comprendre les gènes critiques contrôlant l’activité osteoclast in vivo. Cette méthode utilise un modèle murin transgénique et certaines techniques canoniques pour analyser le phénotype squelettique.

Analyse du phénotype squelettique d’un modèle murin de suppression conditionnelle de Stat3

Transgenic mouse models are powerful for understanding the critical genes controlling osteoclast differentiation and activity, and for studying mechanisms ...

Les modèles de souris génétiquement modifiés sont des outils puissants pour étudier les mécanismes de la maladie humaine in vivo. L’analyse du phénotype squelettique des souris est à la base de la recherche squelettique. Cette particule décrit certaines techniques typiques d’analyse du phénotype squelettique qui peuvent être intéressantes pour ceux qui débutent dans la recherche sur les tissus squelettiques.Lorsque vous essayez cette particule, gardez à l’esprit que les expériences sur les animaux prennent du temps, alors collectez autant d’échantillons de haute qualité que possible au cours de chaque expérience, même si vous n’en avez pas besoin à court terme. Commencez par placer une souris euthanasiée en position couchée et disloquez doucement les articulations bilatérales de la hanche à la main. À l’aide de ciseaux ophtalmiques, coupez verticalement la peau du tibia distal, puis retirez toute la peau du membre postérieur.Coupez le ligament articulaire de l’articulation de la hanche droite et de l’articulation du genou avec des ciseaux pour séparer le membre postérieur. Coupez ensuite l’os aux deux extrémités pour l’immerger complètement dans 4 % de PFA. Coupez le trochanter et la jonction du péroné.Immergez le membre postérieur dans 4 % de PFA, en gardant le membre postérieur droit pour la section en paraffine. Coupez les ligaments articulaires des articulations de la hanche gauche et du genou avec des ciseaux et retirez doucement les tissus mous. Séparez le tibia et le fémur et plongez-les séparément dans de l’éthanol à 75 %.Conservez le fémur pour la microtomodensitométrie et les tibias pour le double marquage en rouge de calcéine et d’alizarine. Pour préparer les sections de paraffine, lavez doucement le membre postérieur droit fixé trois fois avec du PBS pendant 10 minutes par lavage. Ensuite, détartrez-le à 15 % d’EDTA avec un détartrant à ultrasons pendant trois à quatre semaines jusqu’à ce que les os puissent être pliés, en remplaçant le liquide détartrant tous les deux jours.Après le détartrage, lavez les échantillons trois fois avec du PBS et plongez-les dans de l’éthanol à 75 % à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le deuxième jour, immergez séquentiellement les échantillons dans de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 100 % et du xylène pendant une heure chacun. Immergez les échantillons dans moitié du xylène et moitié de la paraffine pendant 30 minutes, puis dans de la parexposition à 65 degrés Celsius pendant la nuit.Pour enfoncer l’échantillon, immergez-le dans de la paraffine, en plaçant le fémur et le tibia à un angle de 90 degrés. Lorsque la paraffine a complètement refroidi, retirez les échantillons du réservoir d’enrobage. Numérotez-les et conservez-les à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit.Faites cuire les sections de paraffine à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis faites-les cirer en les immergeant dans du xylène pendant 10 minutes. Immergez les sections trois fois avec du xylène frais à chaque fois. Réhydratez les sections en les immergeant séquentiellement dans 100 % d’éthanol, 95 % d’éthanol, 70 % d’éthanol et de l’eau distillée pendant cinq minutes chacune.Préparez la solution de coloration à l’aide du kit de coloration TRAP et réchauffez-la à 37 degrés Celsius. Ajoutez 50 à 100 microlitres de solution de coloration à chaque section et incubez-les dans une chambre humide à 37 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes. Vérifiez l’état de coloration des ostéoclastes au microscope optique toutes les cinq minutes jusqu’à ce que l’on puisse voir des ostéoclastes multinucléés rouges.Terminez ensuite la réaction avec de l’eau. Contre-colorez les sections dans une solution d’hématoxyline pendant 30 secondes et créez une couleur bleue stable en les immergeant dans une solution d’ammoniac à 1 % pendant une minute. Ensuite, rincez-les à l’eau du robinet qui coule lentement.Montez les sections à l’aide de lamelles de protection avec du baume neutre et séchez-les pendant la nuit. Capturez trois à cinq champs de vision avec un microscope et analysez le périmètre trabéculaire avec l’image J.Utilisez l’outil en ligne droite pour mesurer la longueur de la barre d’échelle en L1. Utilisez ensuite l’outil de ligne segmentée pour mesurer la longueur du périmètre trabéculaire en tant que L2. Calculez la longueur physique et comptez le nombre de cellules positives à TRAP avec plus de trois noyaux. Après la fixation, lavez doucement les tibias trois fois avec du PBS et plongez séquentiellement les échantillons dans de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 100 % et du xylène pendant cinq minutes chacun.Immergez les échantillons dans de l’acétone pendant 12 heures, moitié dans de l’acétone et moitié dans de la résine pendant deux heures, puis dans de la résine pure dans une étuve de séchage pendant la nuit. Ajoutez de la résine pure dans un réservoir d’enrobage de gel de silice approprié et placez les échantillons dans le réservoir en évitant les bulles. Polymériser la résine dans une étuve de séchage à 60 degrés Celsius pendant 48 heures.Coupez les échantillons en sections de cinq micromètres d’épaisseur en continu avec un microtome rotatif et stockez le reste des échantillons avec un dessiccant à température ambiante. Collez les sections avec une pince à épiler dans une goutte d’éthanol à 75 % et fixez-les avec des lamelles de recouvrement à l’aide de baume neutre. Capturez le marquage de fluorescence rouge et vert à l’aide d’un microscope à fluorescence.Des souris de délétion Stat3 spécifiques aux ostéoclastes ont été générées pour étudier l’influence de la délétion de Stat3 sur la différenciation des ostéoclastes. La reconstruction fémorale et l’analyse quantitative par micro-tomodensitométrie ont indiqué que la masse osseuse des souris Stat3 Ctsk était augmentée par rapport aux souris de type sauvage. La morphologie histologique des fémurs de souris de type sauvage et Stat3 Ctsk a été examinée par coloration H et E.L’activité ostéoclastogène a été détectée à l’aide de la coloration TRAP. Les ostéoclastes sont de grandes cellules positives au TRAP avec plusieurs noyaux. Le nombre d’ostéoclastes positifs à TRAP était plus faible chez les souris Stat3 Ctsk, par rapport aux souris de type sauvage, ce qui indique que le déficit en Stat3 a altéré la formation d’ostéoclastes.L’ostéogenèse a été mesurée par double marquage à la calcéine et au rouge d’alizarine. La zone entre la calcéine et la fluorescence rouge d’alizarine représente l’os nouvellement formé. La suppression de Stat3 dans les ostéoclastes n’a pas influencé l’anabolisme osseux.Des coupes de paraffine sagittale dans lesquelles le cartilage était plus tard symétrique et qui ont montré que la ligne claire en forme de M a été utilisée ici. Pour les études, nous inclurons plus de caractéristiques du système squelettique, telles que les propriétés mécaniques.

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