Un modèle préclinique d’impact cortical contrôlé pour l’hémorragie traumatique, la contusion et la neuroinflammation

L’hémorragie intraparenchymateuse et la neuroinflammation accompagnées d’une contusion cérébrale peuvent déclencher de graves lésions cérébrales secondaires. Ce protocole détaille un modèle d’impact cortical contrôlé (ICC) chez la souris, permettant aux chercheurs d’étudier l’hémorragie, la contusion et les réponses immunitaires post-traumatiques, et d’explorer des thérapies potentielles.

Ce modèle peut être utilisé pour étudier les pathologies associées à la contusion cérébrale, notamment l’hémorragie intracrânienne, la toxicité ferrique, la mort des neurones, les lésions axonales, le déficit neurologique et l’inflammation neuronale. Le principal avantage de cette technique est que la gravité des lésions cérébrales peut être facilement contrôlée en manipulant les paramètres biochimiques tels que la vitesse et la mort de l’impact sur le dispositif CCI. La lésion corticale focale induite par l’ICI est hautement reproductible.

Une technique stéréotaxique appropriée et la procédure de craniotomie sont des déterminants majeurs dans la production de lésions cérébrales induites par l’ICC stables et reproductibles. En général, l’investigateur novice dans la procédure aura du mal à stabiliser la souris sur le cadre stériotexique et à faire la craniotomie appropriée. Mme Jhih Shuan Lin, une technicienne de laboratoire de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Commencez par confirmer l’absence de réflexe de pincement des orteils chez l’animal pour vous assurer qu’il est correctement anesthésié. Rasez la tête de la souris avec une tondeuse électrique dans le sens caudal à rostral. Mais ne coupez pas les moustaches.

Placez la souris sur le cadre stéréotaxique et insérez soigneusement les barres d’oreille dans les conduits auditifs, en vous assurant que la tête de la souris est stabilisée par les deux barres d’oreille de manière égale. Maintenez l’anesthésie à un à 2 % d’isoflurane pendant toute la durée de la chirurgie. Appliquez de la vaseline sur les deux yeux pour éviter le dessèchement pendant la chirurgie.

Utilisez ensuite des cotons-tiges stériles pour désinfecter le crâne rasé avec de la bétadine suivie de 70 % d’éthanol. Administrez 100 microlitres de bupivacaïne à 0,25 % par voie sous-cutanée avec une aiguille à insuline de calibre 31 et massez doucement le site d’injection pour une meilleure absorption. Faites une incision longitudinale le long de la ligne médiane du cuir chevelu à l’aide d’un scalpel ou de ciseaux.

Ensuite, utilisez un hémostat pour retirer la peau du côté droit. Laissez le crâne exposé sécher pendant une minute. Nettoyez ensuite tout résidu de sang et de tissus sur le crâne avec un coton-tige stérile.

Vérifiez que la tête de l’animal est au niveau dans le plan horizontal et identifiez les repères anatomiques, Bregma et Lambda, en marquant les deux emplacements avec un crayon. Assurez-vous que la tête de l’animal est de niveau dans la direction rostrale-caudale en mesurant les coordonnées Z de Bregma et de Lambda. Utilisez la même procédure pour positionner la tête horizontalement.

Utilisez une aiguille à insuline de calibre 31 pour identifier le site de la craniectomie. Réglez l’origine XY sur Bregma et déplacez latéralement l’aiguille de trois millimètres vers la droite. Marquez cette position comme le site de la craniectomie et tracez un cercle de quatre millimètres de diamètre sur le crâne avec un crayon.

Coupez le long du cercle délimité au crayon avec une micro-perceuse à grande vitesse avec le trépan pour créer un trou ouvert de quatre millimètres de diamètre. Retirez le rabat osseux à l’aide d’une pince à épiler et rangez-le dans une solution saline normale et glacée. Rincez doucement le trou avec une solution saline avant d’appliquer une pression sur la surface du cerveau pour arrêter le saignement.

Sur l’appareil CCI, réglez l’extrémité arrondie de l’impacteur de 2,5 millimètres de diamètre à un angle de 22,5 degrés. Placez la pointe de l’impact sur la surface de la durale et réglez les paramètres d’impact sur le boîtier de commande à une vitesse de quatre mètres par seconde et à une profondeur de déformation de deux millimètres. Rétractez l’embout métallique.

Déchargez le piston pour générer une impaction sur le cerveau. Placez ensuite un coton-tige stérile sur la zone blessée pour arrêter le saignement. Replacez le lambeau osseux et fixez-le avec du ciment dentaire.

Fermez le cuir chevelu avec un adhésif tissulaire. Placez la souris sous la lampe chauffante dans une cage de récupération propre avec de la litière jusqu’à ce qu’elle se rétablisse complètement. Une technique stéréotaxique et une craniectomie appropriées sont des déterminants majeurs dans la production de lésions cérébrales induites par l’ICC stables et reproductibles.

Une procédure de craniectomie idéale causerait des lésions histologiques minimes dans le cerveau opéré par placebo. Des changements dans les lésions cérébrales et la perte du corps calleux ont été observés aux jours 1, 3, 7 et 28 après l’ICC. De plus, une atrophie cérébrale unilatérale du côté des contusions a été observée au 28e jour après l’ICC.

La neuroinflammation a été révélée par une microglie activée Iba1-positive et une accumulation de macrophages autour de la limite de la zone de contusion. L’hémorragie intraparenchymateuse a également été détectée par la coloration positive à Ly76 du premier au septième jour après l’ICC. Un mélange de globules rouges avec une morphologie cellulaire rompue et intacte a été observé au septième jour après l’ICC, suggérant que les globules rouges étaient lysés à ce stade.

Ce phénomène était cohérent avec l’observation selon laquelle les dépôts de fer ferrique étaient détectables dans la région de contusion du septième au 28e jour après l’ICC. Des microglies et des macrophages activés ont été observés dans le striatum loin du site de contusion du troisième à 28 jours après l’ICC, indiquant des lésions du corps calleux et du striatum. Cette technique ouvre la voie à l’enquêteur pour explorer davantage l’interaction neuro-inflammatoire induite par l’hémorragie cérébrale en comprenant la réponse des cellules immunitaires, telles que la microglie, après une contusion hémorragique.