Analyse des taches d’ARN pour la détection et la quantification des microARN végétaux

Salut. Il s’agit donc d’un petit protocole nord arn. C’est un dérivé du protocole optimisé à l’origine par le Dr Rashid Akbergenov.

Dans cette méthode, on peut détecter de petits ARN de n’importe où entre 20-24 nucléotide dans la longueur, très précisément et à très haute résolution. Le protocole est essentiellement une forme modifiée d’analyse traditionnelle du Nord, mais ici, le pourcentage d’acrylamide est assez élevé, c’est 15 p. 100. Ce nord peut être utilisé pour détecter un petit ARN déjà connu, soit micro ARN ou tout autre ensemble de petits ARN, lorsque la séquence est connue ou il peut être utilisé pour la confirmation de l’abondance de petits ARN provenant de la prochaine génération de groupes de données de séquençage.

L’avantage de cette méthode est que, on peut non seulement regarder l’abondance de micro ARN, mais aussi l’abondance des précurseurs, par exemple micro ARN peut laisser de côté un précurseur qui est d’environ 30 à peut-être quelques centaines de nucléotide de long, cela peut également être détecté simultanément, avec le micro ARN. Le protocole est très simple, très simple, mais il faut être très prudent tout en effectuant quelques étapes critiques qui sont énumérées à la fin de ce protocole. Pour la préparation du mélange de gel de 10 mL, ajouter 4,8 grammes d’urée, 3,75 mL de solution acrylamide à 40 %, et 1 mL de TBE 10X fraîchement préparé, pH 8,2 et mélanger délicatement la solution.

Dissoudre complètement l’urée, en chauffant le mélange dans un bain d’eau, jusqu’à ce que la solution semble claire. Composent le volume jusqu’à 10 mL, à l’aide d’eau MilliQ stérile et refroidissez le mélange de gel à température ambiante. Lavez l’appareil requis avec du détergent, frottez-les doucement pour éliminer le TBE résiduel et l’acrylamide.

Rincez-les davantage à l’eau MilliQ et laissez-les sécher. Assembler la plaque de verre ensemble, s’assurer que les deux sont au même niveau. Placez-les fermement sur l’éponge.

Ajouter 8 micro litres de TEMED et 80 micro litres de 10% d’APS fraîchement préparés au mélange de gel. Mélanger délicatement et verser le mélange de gel dans les assiettes assemblées. Assurez-vous que le gel ne fuit pas.

Placez soigneusement le peigne. Laisser le gel polymériser pendant environ 45 minutes. Après la polymérisation du gel, retirer les plaques de verre de l’assemblage.

Laver les plaques de verre avec de l’eau MilliQ. Et placez-les dans la cassette en marche. Placez la cassette en marche à l’intérieur du réservoir.

Verser 1X TBE fraîchement préparé, pH 8.2. Retirez soigneusement le peigne. Lavez soigneusement les puits du gel en pipetting le tampon.

Cette étape élimine les précipités de l’urée du puits et facilite l’ARN à courir uniformément à travers le gel. Fermez le couvercle de l’appareil et pré-exécutez le gel vide à 80 volts pendant 30 minutes, pour vérifier toute fuite tampon. Pour la préparation de 10 mL de colorant de chargement, peser 5 mg de bromophénol bleu, 5 mg de cyanol xylène et ajouter 10 mL de formamide déioinisé et bien mélanger.

Aliquot le colorant et stocker à 4 degrés pour une utilisation plus supplémentaire. Aliquot 10 microgramme d’ARN total en tubes stériles de 1,5 mL. Assurez-vous que la qualité de l’ARN, c’est-à-dire

le rapport 260:230 est supérieur ou plus proche de deux. Placez le tube à l’intérieur d’un speedVac et séchez les échantillons sous vide. Suspendre à nouveau les échantillons d’ARN séchés dans 8 microcrédits de colorant de chargement.

Chauffer les échantillons à 98 degrés pendant deux minutes. Refroidissez-les pendant une minute à température ambiante. Vortex les échantillons d’ARN refroidis pour assurer une re-suspension appropriée dans le colorant de chargement.

Faites tourner les tubes. Répétez les étapes de chauffage, de refroidissement et de vortex pendant trois fois pour obtenir l’ARN qui coule librement. Arrêtez la pré-course du gel.

Lavez soigneusement les puits, avant de charger l’échantillon, pour enlever les dépôts de l’urée à l’intérieur des puits. Chauffer les échantillons d’ARN re-suspendus à 98 degrés pendant une minute. Chargez les échantillons chauds dans les puits à l’aide de pointes capillaires.

Évitez d’introduire des bulles d’air. Chargement complet de tous les échantillons et assemblage du couvercle. Faire fonctionner le gel à 80 volts pendant trois heures ou jusqu’à ce que le bromophénol bleu fonctionne complètement.

Utilisez une membrane de nylon chargée positivement pour le transfert. Coupez-le aux dimensions de la plaque de verre. Étiquetez la membrane à son coin supérieur droit.

Placez doucement la membrane à la surface de l’eau stérile milliq assurez-vous de placer le côté étiquette vers le bas, face à la surface de l’eau. Prenez un plateau propre et préparez un sandwich au gel pour le transfert électro. Placez le côté gris de la cassette vers le bas.

Verser 1X TBE légèrement au-dessus du niveau de la cassette. Pré-mouiller le tampon en fibre dans 1X TBE et le presser pour enlever les bulles d’air. Couper deux morceaux de papier buvard de la taille d’un tampon en fibre.

Pré-mouiller un morceau de papier buvard en 1X TBE et le placer sur le tampon en fibre. Enlever les bulles d’air en roulant une pipette en plastique sur le papier. Pré-mouiller un autre morceau de papier buvard en 1X TBE et le poser sur la cassette.

Rouler pour enlever les bulles d’air. Maintenant, la configuration sandwich est prêt pour le transfert électro. Après l’achèvement de l’électrophorèse, arrêter la course et retirer le couvercle de l’appareil.

Retirez la cassette en cours d’exécution de la configuration. Sortez les plaques de verre de la cassette en marche. Retirer délicatement le gel de l’assemblage.

Mentez-le sur le papier buvard de sorte que le premier échantillon d’ARN chargé est vers votre droite. Trempez doucement la membrane pré-trempée dans 1X TBE et placez-la sur le gel, face au côté étiqueté vers le bas. Ne laissez pas sécher la membrane et le gel.

Rouler doucement pour enlever la bulle d’air. Tremper un morceau de papier buvard dans 1X TBE et le poser sur la membrane. Enlever les bulles d’air.

Placez un autre morceau de papier buvard et retirez les bulles d’air. Complétez le sandwich en posant la garniture en fibre sur l’assemblage. Fermez fermement la cassette.

Placez la cassette trans-tache dans le module. Remplissez le réservoir de 1X TBE, pH 8.2, jusqu’à la marque de ballonnement. Fermer le couvercle de l’appareil et transférer à 10 volts pendant la nuit à 4 degrés ou dans une chambre froide.

Gardez le lien croisé UV prêt et réglez-le à 1200, juste avant l’achèvement du transfert électro. Après l’achèvement du transfert, retirez la cassette du module. Placez la membrane humide sur une feuille A4, en plaçant le côté marqué vers le haut.

Relier l’ARN à la membrane par irradiation avec 254 nanomètres de lumière UV à 120 milli joules. La tache croisée peut être stockée à quatre degrés ou utilisée pour l’hybridation. Concevoir une sonde qui est complètement complémentaire à la petite ARN qui doit être détectée.

Étiquetez la sonde à son extrémité principale à cinq extrémités principales en utilisant l’enzyme PNK et combinez les composants comme indiqué. Incuber le mélange de réaction à 37 degrés pendant 30 minutes. Après 30 minutes d’incubation, utilisez les colonnes G-25 pour séparer les sondes non étiquetées du mélange de réaction.

Pour un étiquetage amélioré de la sonde, préparez la colonne G-25 avant utilisation. Placer la tache, côté ARN face au dessus, à l’intérieur d’une bouteille d’hybridation. Mélanger vigoureusement le tampon d’hybridation avant utilisation.

Ajouter 10 mL de tampon d’hybridation à l’intérieur et placer la bouteille d’hybridation à l’intérieur du four d’hybridation, maintenir à 35 degrés avec rotation. Effectuez la pré-hybridation pendant 20 à 30 minutes. Après la pré-hybridation, retirer la bouteille du four.

Ajouter délicatement la sonde étiquetée dans le tampon d’hybridation. Assurez-vous que les bulles d’air ne sont pas créées. Incuber la tache à l’intérieur du four à 35 degrés avec rotation pendant 12 heures.

Après hybridation, retirez le tampon d’hybridation de la bouteille. Effectuez un lavage rapide des taches, à l’aide du tampon de lavage I. Cette étape est effectuée pour éliminer la solution d’hybridation excédentaire des taches.

Incuber davantage les taches à 35 degrés pendant 30 minutes à l’aide du tampon-I de lavage. Effectuez un autre lavage à l’aide du tampon II à 35 degrés pendant 30 minutes. Après le lavage de la tache, placez-la à l’intérieur d’un couvercle d’hybridation, retirez l’excédent de tampon et scellez-le.

Placez-le à l’intérieur d’une cassette et exposez-le à un écran phospho-imageur sans rayonnement pendant 12 heures. Détectez le signal d’hybridation à l’aide de l’imageur biomoléculaire typhoon et analysez les résultats à l’aide du logiciel ImageJ. Pour l’hybridation de la tache avec d’autres sondes, effectuer des étapes de décapage comme illustré.

Avec cette technique, on peut estimer l’abondance de micro ARN, ainsi que sa longueur. À partir de cette image, l’expression du micro ARN 397 peut être détectée dans tous les échantillons. Dans cette tache, l’abondance de l’échantillon un est d’environ 5 lires par million, selon les données de séquençage de prochaine génération, ce qui suggère que notre technique peut détecter moins abondante micro ARN aussi.

En outre, en utilisant le logiciel de quantification ImageJ, on peut quantifier l’expression du micro 397 parmi les échantillons. Ici, nous avons utilisé U6 et micro ARN 168 comme contrôles de chargement. Je vais parler de certaines étapes cruciales qui doivent être prises en considération lors de l’exécution de l’expérience.

Assurez-vous d’utiliser de l’ARN de bonne qualité pour la préparation de l’échantillon. Tout en séchant les échantillons sous vide, évitez de les sécher trop. La re-suspension de l’ARN dans le colorant de chargement est essentielle.

Assurez-vous de préparer un échantillon qui coule librement. Il faut prendre soin de charger le gel. Les puits du gel doivent être lavés et l’échantillon doit être chargé en ligne droite à l’intérieur des puits.

Pendant le transfert électro, la propagation de la membrane dans l’eau, juste avant de la tremper dans 1X TBE est essentielle, il améliore le transfert. L’hybridation de la tache doit être effectuée à 35 degrés. Maintenir la température du four d’hybridation.

Pour une utilisation répétée des taches, les membranes doivent être stockées à 4 degrés. Ils doivent être maintenus humides dans 2X SSE. Contrairement à d’autres méthodes basées sur pcr, cette méthode assure la quantification de l’expression, ainsi que la détermination de la taille des micro ARN.