Jonction neuromusculaire in vitro induite par les cellules souches pluripotentes induites par l’homme
3 décembre 2020
Ici, nous fournissons un protocole pour générer des NMJ in vitro à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (IPSCs). Cette méthode peut induire NMJs avec la morphologie mûre et la fonction en 1 mois dans un puits simple. Les NMJ qui en résultent pourraient potentiellement être utilisés pour modéliser des maladies connexes, étudier des mécanismes pathologiques ou dépister les composés médicamenteux pour la thérapie.
Ce système humain d’induction de jonction neuromusculaire peut être employé pour induire la formation des composants pré et post-synaptiques, y compris les neurones moteurs, le muscle squelettique, et les cellules de Schwann. Non seulement une structure mature et complexe du NMJ peut être obtenue dans un seul plat de culture à partir d’une seule population de cellules de départ, mais le NMJ qui en résulte possède également la capacité de se contracter. Cette méthode a le potentiel pour étudier des maladies neuromusculaires, telles que l’atrophie musculaire spinale, et pour le criblage thérapeutique de composé.
Le NMJ différencié est un tissu très épais et complexe, et il est difficile à visualiser. En démontrant la procédure, nous pouvons enseigner aux lecteurs comment identifier des structures spécifiques. Lavez les cellules avec trois millilitres de PBS avant d’ajouter un millilitre de solution de détachement cellulaire à une boîte de Pétri.
Après 10 minutes à 37 degrés Celsius, ajouter trois millilitres de milieu de cellules souches embryonnaires primate à chaque puits et pipette doucement trois fois pour dissocier les cellules des coverslips. Ensuite, mettre en commun les supernatants contenant des cellules souches détachées dans un tube conique de 50 millilitres pour centrifugation et résuspendre la pastille de cellules souches en trois millilitres de milieu de cellules souches embryonnaires de primates frais complété par 10 inhibiteurs micromolaires Y-27632 ROCK pour le comptage. Ensuite, diluer les cellules à deux fois 10 à cinq cellules par millilitre de milieu complété par la concentration inhibiteur rock et retourner deux millilitres de cellules à chaque coverslip dans chaque puits de la matrice extracellulaire enduite de six puits plaque.
Après 24 heures, remplacer le supernatant dans chaque puits par deux millilitres de milieu de cellules souches embryonnaires primates frais complété par un microgramme par millilitre de doxycycline et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures. À la fin de l’incubation, remplacer les supernatants par deux millilitres de milieu de différenciation complétés par de la doxycycline par puits et remettre la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant 10 jours. À la fin de l’incubation, remplacer les supernatants par deux millilitres de milieu de différenciation myogénique complété par de la doxycycline par puits et remettre la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant 10 jours supplémentaires.
À la fin de l’incubation, remplacer les supernatants par deux millilitres de milieu de jonction neuromusculaire par puits et remettre la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant 30 jours. À la fin de l’incubation, visualiser les jonctions neuromusculaires différenciées par microscopie inversée. Pour déclencher les contractions myotube, ajouter 25 millimolaire chlorure de calcium à chaque puits de cellules de jonction neuromusculaire différenciée.
Et dans un délai d’une à deux minutes de traitement, placez la plaque sur la scène d’un microscope inversé. À l’aide d’une microscopie cellulaire vivante, enregistrez un film de la contraction du myotube pendant 20 secondes. À la fin de l’enregistrement, ajouter 300 nanogrammes par millilitre de curare au milieu de la culture et enregistrer le film pendant encore 20 secondes avant d’ouvrir le fichier de film dans un logiciel approprié d’analyse vectorielle de mouvement pour l’analyse.
La coloration immunofluorescente des vaisseaux synaptiques de neurofilament et des récepteurs d’acétylcholine peut être exécutée pour identifier les neurones. Les motoneurones pourraient être identifiés par tuj 1 et islet 1 colorant, tandis que les myotubes post-synaptiques peuvent être identifiés en souinant pour la chaîne lourde de myosine. Les cellules de Schwann peuvent être étiquetées avec des anticorps S-100.
Dans ces images de microscopie électronique de balayage, la morphologie des jonctions neuromusculaires mûres peut être observée avec la visualisation claire des terminaux élargis d’axon, des axones, et des fibres musculaires. La microscopie électronique de transmission peut être employée pour visualiser la structure ultra mature des composants neuromusculaires, y compris le terminal présynaptique d’axon avec des vésicules synaptiques et la région post-synaptique, qui est séparée par la fissure synaptique. Les plis jonctionnels marquent la jonction entre le neurone et les fibres musculaires.
Ici, les terminaux d’axons matures qui contiennent des vésicules synaptiques sont montrés. Pris ensemble, ces dispositifs morphologiques indiquent que les composants neuromusculaires ont été bien induits et mûris. L’évaluation fonctionnelle des cellules révèle que les signaux neuromusculaires proéminents de mouvement de jonction peuvent être induits par le chlorure de calcium et que ces contractions peuvent être interrompues par curare confirmant que les signaux de neurone moteur sont transmis par la jonction neuromusculaire pour déclencher la contraction de muscle.
La densité d’ensemencement cellulaire influe sur l’efficacité de la formation de NMJ. Il peut être modifié pour s’adapter au protocole, selon les objectifs expérimentaux. Cette culture de jonction neuromusculaire contient plusieurs types de cellules, et ces composants peuvent être utilisés pour étudier les interactions entre ces cellules lors du développement de jonctions neuromusculaires ou en réponse à des pathologies spécifiques de la maladie.
Aperçu
Ce protocole décrit la génération de jonctions neuromusculaires (NMJ) in vitro à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC). La méthode permet la création de jonctions neuromusculaires matures dotées de capacités fonctionnelles en un mois, offrant ainsi un outil précieux pour la modélisation des maladies et le criblage de médicaments.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Médecine régénérative
Contexte
- Les JNM sont essentielles pour la contraction musculaire et la fonction motrice.
- L'étude des JNM peut fournir des informations sur les maladies neuromusculaires.
- Les CIP humaines offrent une source renouvelable pour la recherche sur les JNM.
- Les méthodes actuelles de génération des JNM sont souvent complexes et longues.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole optimisé de formation des jonctions neuromusculaires à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPSC).
- Faciliter l'étude des maladies neuromusculaires.
- Permettre le criblage de médicaments à des fins de thérapie.
Méthodes utilisées
- Techniques de culture cellulaire pour différencier les iPSC en composants de la jonction neuromusculaire.
- Utilisation de milieux et de suppléments spécifiques pour favoriser la maturation.
- Marquage immunofluorescent pour identifier les composants neuronaux et musculaires.
- Essais fonctionnels pour évaluer l'activité de la jonction neuromusculaire et la contraction.
Résultats principaux
- Des jonctions neuromusculaires matures se sont formées avec des capacités fonctionnelles.
- Le chlorure de calcium a induit des contractions dans les myotubes.
- La curare a interrompu efficacement les contractions musculaires, confirmant le fonctionnement des jonctions neuromusculaires.
- Les techniques d'imagerie ont révélé la morphologie détaillée des jonctions neuromusculaires.
Conclusions
- Le protocole fournit une méthode fiable pour la génération de jonctions neuromusculaires à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPSC).
- Ce système peut être utilisé pour étudier les interactions au cours du développement de la jonction neuromusculaire.
- Les applications potentielles incluent la modélisation de maladies et le test de composés thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Ce modèle in vitro de jonction neuromusculaire humaine (JNM) dérivé de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) fournit un système physiologiquement pertinent pour l'étude des mécanismes des maladies neuromusculaires et l'évaluation de composés thérapeutiques. En intégrant des composants pré- et post-synaptiques avec une connectivité fonctionnelle, le modèle permet la validation de cibles thérapeutiques et la réduction des risques mécanistiques en phase précoce de découverte. Sa durée de maturation d'un mois et ses paramètres fonctionnels robustes permettent le développement d'essais à grande échelle pour l'identification de candidats-médicaments et offrent une confiance prédictive dans la recherche translationnelle.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en modélisant la formation et la fonction de la jonction neuromusculaire dans un système pertinent pour l'humain.
- Valeur opérationnelle : Soutient la dé-risquisation biologique grâce à une évaluation intégrée des interactions entre les motoneurones, le muscle squelettique et les cellules de Schwann.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille thérapeutique en fournissant des mesures quantitatives de l'intégrité de la jonction neuromusculaire et de la réponse contractile.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit une plateforme standardisée et reproductible pour le criblage de composés, avec des paramètres fonctionnels liés à l'activité de la jonction neuromusculaire.
- Valeur opérationnelle : Permet la réalisation d'essais évolutifs en format multi-puits à partir d'une seule population initiale de cellules souches induites pluripotentes dans un même plat de culture.
- Préparation de l'essai : Produit des jonctions neuromusculaires matures présentant des réponses contractiles et inhibitrices détectables, adaptées au criblage à contenu élevé.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Fait le lien entre la découverte et la validation préclinique en modélisant la physiopathologie de la jonction neuromusculaire humaine et la réponse aux médicaments.
- Déminimisation des risques mécanistiques : Permet l'étude de la perturbation de la jonction neuromusculaire dans des modèles de maladies comme l'atrophie musculaire spinale, en utilisant des fonds génétiques définis.
- Avancement ajusté au risque : Soutient les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin, basées sur des lectures fonctionnelles de la jonction neuromusculaire corrélées à l'innervation musculaire in vivo.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de cible à l'identification de composés d'intérêt, en passant par les tests d'efficacité préclinique, offrant un système réutilisable pertinent pour l'homme dans la recherche neuromusculaire.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses concernant la formation, le maintien et le dysfonctionnement des jonctions neuromusculaires dans des modèles de maladies induites par des facteurs génétiques ou toxiques.
- Écrans pharmacologiques : Fournit des jonctions neuromusculaires prêtes à l'essai, avec des lectures fonctionnelles de contraction et d'inhibition, permettant d'évaluer les effets de composés sur la transmission neuromusculaire.
- Analytique : Génère des données quantitatives sur la motilité des myotubes et sur l'inhibition pharmacologique, permettant des comparaisons entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Relie les jonctions neuromusculaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à la continuité préclinique en modélisant des interactions et pathologies neuromusculaires humaines spécifiques.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme scalable dérivée de cellules souches pluripotentes, applicable à plusieurs indications neuromusculaires et campagnes de criblage.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans le développement de thérapeutiques ciblant la jonction neuromusculaire.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et la reproductibilité grâce à un protocole de différenciation défini en une seule étape.
- Valeur stratégique : Optimise l'efficacité du capital en permettant une détection précoce des défauts neuromusculaires et en réduisant le risque d'échec en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Guide la priorisation ajustée au risque des composés en fonction des résultats fonctionnels sur la jonction neuromusculaire et de l'engagement ciblé.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules souches pluripotentes induites humaines, en différenciation et en biologie neuromusculaire.
- Dépend de milieux spécialisés, de suppléments (y compris la doxycycline et l'inhibiteur de ROCK) et de supports revêtus de matrice extracellulaire.
- Exige des protocoles normalisés pour la densité d'ensemencement cellulaire, le changement de milieu et le calendrier des tests fonctionnels.
- Implique des ajustements nécessaires pour l'application à différentes lignées de cellules iPS et à des fonds génétiques modélisant des maladies.
- Comprend des limites pratiques telles que la complexité de l'imagerie due à la formation de tissus épais et multicouches, nécessitant une microscopie avancée.
F.A.Q. sur la bio-pharmacie
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:59
Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC) Culture
2:00
iPSC Differentiation
3:04
Neuromuscular Junction (NMJ) Muscle Contraction and Curare Treatment
3:47
Results: Representative NMJ Phenotypic, Morphological, and Functional Characterization
5:20
Conclusion
