Name: Neisseria meningitidis Infection de cellules endothéliales cérébrales dérivées de cellules souches pluripotentes induites (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Découvrez une méthode utilisant des cellules endothéliales cérébrales dérivées de cellules souches pluripotentes induites pour étudier les interactions hôte-pathogène avec Neisseria meningitidis. Ce modèle permet d'analyser les mécanismes d'infection au niveau de la barrière hémato-encéphalique.

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L.M.E. est soutenu par le programme de formation à la recherche de la DFG GRK2157 intitulé « Modèles tissulaires 3D pour l’étude des infections microbiennes par des agents pathogènes humains » attribué à A. S-U. B.J.K. bénéficie d’une bourse postdoctorale de la Fondation Alexander von Humboldt. De plus, nous remercions Lena Wolter pour son assistance technique dans la génération des iPSC-BEC dans le domaine de la culture.

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<li>Schubert-Unkmeir, A., Sokolova, O., Panzner, U., Eigenthaler, M., Frosch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+pattern+in+human+brain+endothelial+cells+in+response+to+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Gene expression pattern in human brain endothelial cells in response to Neisseria meningitidis.</a> Infection and Immunity. 75 (2), 899-914 (2007).</li>
<li>Sokolova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Neisseria+meningitidis+with+human+brain+microvascular+endothelial+cells%3A+Role+of+MAP-+and+tyrosine+kinases+in+invasion+and+inflammatory+cytokine+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interaction of Neisseria meningitidis with human brain microvascular endothelial cells: Role of MAP- and tyrosine kinases in invasion and inflammatory cytokine release.</a> Cellular Microbiology. 6 (12), 1153-1166 (2004).</li>
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<li>Kim, B. J., Schubert-unkmeir, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Models+for+Studying+the+Interaction+of+Neisseria+meningitidis+with+Human+Brain+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neisseria+meningitidis%3A+Methods+and+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro Models for Studying the Interaction of Neisseria meningitidis with Human Brain Endothelial Cells.</a> Neisseria meningitidis: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1969, 135-148 (2019).</li>
<li>Kim, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+induction+of+Snail1+contributes+to+blood-brain+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Bacterial induction of Snail1 contributes to blood-brain barrier disruption.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2473-2483 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La modélisation des BEC et de la BHE a posé des défis, car les BEC humains primaires et immortalisés, in vitro, ont tendance à ne pas avoir de phénotypes barrières robustes. L’avènement des technologies de cellules souches humaines a permis la génération de cellules de type BEC dérivées de CSPi qui conservent les phénotypes de BHE caractéristiques attendus, tels que les marqueurs endothéliaux, l’expression des jonctions serrées, les propriétés barrières, la réponse à d’autres types de cellules du SNC et les tran...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61400">Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae</a>. The Authors section was updated from:
Leo M. Endres1 
Alexandra Schubert-Unkmeir1 
Brandon J. Kim1,2 
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of W&#252;rzburg 
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
to:
Leo M. Endres1 
Sarah F. Hathcock2 
Alexandra Schubert-Unkmeir1 
Brandon J. Kim1,2 
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of W&#252;rzburg 
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61400">Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

La barrière hémato-encéphalique (BHE) et la barrière méningée-sang-LCR (mBCSFB) sont des barrières cellulaires extrêmement serrées qui séparent la circulation du système nerveux central (SNC) et sont principalement composées de cellules endothéliales cérébrales (CEB) hautement spécialisées1,2. Ensemble, les BEC maintiennent une bonne homéostasie cérébrale en régulant les nutriments et les déchets à l’intérieur et à l’extérieur du cerveau, tout en excluant de nombreuses toxines, médicaments et agents pathogènes 1,2. La méningite bactérienne survient lorsque les bactéries transmissibles par le sang sont capables d’interagir avec la barrière formée par les BEC et de la pénétrer, ce qui provoque une inflammation. Neisseria meningitidis (Nm, méningocoque) est une bactérie à Gram négatif qui colonise le nasopharaynx de 10 à 40 % des individus en bonne santé, mais qui, dans certains cas, peut provoquer une maladie systémique grave3. Chez les personnes atteintes, le Nm peut accéder à la circulation sanguine où il peut provoquer un purpura fulminans ainsi que pénétrer dans les BEC en accédant au SNC causant la méningite3. Le Nm est l’une des principales causes de méningite bactérienne dans le monde et, malgré les efforts de vaccination, reste l’une des principales causes de méningite4. Les interventions médicales modernes, telles que les traitements antibiotiques, ont permis de survivre à ces maladies, mais les personnes atteintes de méningite se retrouvent souvent avec des dommages neurologiques permanents 5,6.
Des études antérieures ont identifié des facteurs bactériens et la signalisation de l’hôte qui contribuent aux interactions Nm-BEC 7,8,9,10,11. Les adhésines et les invasines identifiées telles que la protéine d’opacité Opc et les pili de type IV, ainsi que des récepteurs tels que CD147, ont été menées sur divers modèles BEC in vitro, mais ces modèles manquent de nombreuses propriétés BHEdéfinissant 7,9,11,12. La compréhension complète des interactions Nm-BEC reste difficile à atteindre, en partie à cause de l’incapacité d’utiliser des modèles in vivo, d’une protection vaccinale incomplète et du manque de modèles BEC humains robustes in vitro.
La modélisation des hBEC in vitro a été difficile en raison des propriétés uniques des BEC. Par rapport aux cellules endothéliales périphériques, les BEC présentent un certain nombre de phénotypes qui améliorent leurs propriétés de barrière, telles qu’une résistance électrique trans-endothéliale élevée (TEER) due à des jonctions serrées complexes12. Une fois retirés du microenvironnement cérébral, les BEC perdent rapidement leurs propriétés barrières, ce qui limite l’utilité des modèles primaires ou in vitro immortalisés qui ne forment qu’une barrière faible12,13. La combinaison de la spécificité humaine des infections à Nm, de l’absence de modèles in vivo robustes et des défis liés à la modélisation des BEC humains in vitro crée un besoin de meilleurs modèles pour comprendre l’interaction complexe hôte-pathogène entre Nm et les BEC. Récemment, à l’aide de technologies modèles de cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPi), des cellules de type BEC ont été dérivées de cellules iPS qui imitent mieux les BEC in vivo12,13,14,15. Les iPSC-BEC sont d’origine humaine, facilement évolutives et possèdent les phénotypes BEC attendus par rapport à leurs homologues primaires ou immortalisés12,13,14,15. De plus, nous et d’autres avons démontré que les iPSC-BEC sont utiles pour modéliser diverses maladies du SNC telles que l’interaction hôte-pathogène, la maladie de Huntington et le déficit en MCT8 qui cause le syndrome d’Allan-Hurndon-Dudley 16,17,18,19,20,21. Ici, nous montrons comment dériver des iPSC-BEC à partir de sources d’iPSC renouvelables et l’infection des iPSC-BEC par Nm conduisant à l’activation de la réponse immunitaire innée. Nous pensons que ce modèle est utile pour interroger l’interaction hôte-pathogène qui ne peut pas être récapitulée dans d’autres modèles in vitro et est particulièrement utile lors de l’examen des interactions avec des agents pathogènes spécifiques à l’homme tels que Nm.

<table><tbody><tr><td>Accutase (1x)</td><td>Sigma</td><td>A6964</td><td>Réactif de dissociation cellulaire enzymatique</td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Acide rétinoïque tout-trans (RA)</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31 (PECAM-1)</td><td>Thermo Scientific (Labvision)</td><td>RB-10333</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Claudin-5</td><td>Invitrogen</td><td>4C3C2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Glut-1</td><td>Thermo Scientific (Labvision)</td><td>SPM498 (MA5-11315)</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Occludine</td><td>Invitrogen</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VE-cadhérine</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-52751</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>33-9100</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Proteose Peptone</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoethanol</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>Plaques et flacons de culture cellulaire</td><td>Centrifugeuse Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Heraeus Megafuge 1.0R)</td>Armoire de biosécurité <td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Classe II</td> Incubateur CO2 <td>Nuaire</td><td>NU-437-400E</td><td></td></tr><tr><td>(Incubateur DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed)</td><td>Nuaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Columbia ager + 5 % de sang de mouton</td><td>Biomérieux</td><td>43049</td><td></td></tr><tr><td>Costar Transwell filtres polyester (12 ou 24 puits)</td><td>Corning</td><td>3460, 3470</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ROTH</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Volt-ohmmètre épithélial (Millicell ERS-2) avec électrode STX</td><td>Merck (Millipore)</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NO3)3</td><td>ROTH</td><td>5632.1</td><td></td></tr> Microscope à fluorescence <tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>(Eclipse Ti)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hémacytomètre Nikon (Neubauer)</td><td>A. Hartenstein</td><td>ZK06</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes de base humain (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Milieu sérique endothélial humain (hESFM)</td><td>Gibco</td><td>11111-044</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé (Wilovert)</td><td>Hund (Will Wetzlar)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iPS(IMR90)-4 cellules</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Pour préparer 110 ml de supplément Kellogg’s, préparez 100 ml de 4 g/ml de glucose, 0,1 g/ml de glutamine, 0,2 mg/ml de pyrophosphate de thiamine et 10 ml de 5 mg/ml de Fe(NO3)3 et combinez les solutions. Filtrer, stériliser et stocker aliquote à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Remplacement sérique knockout (KOSR)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (GlutaMAX)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix Kit</td><td>NEB</td><td>E3010L</td><td>kit de synthèse d’ADNc</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>ROTH</td><td>4627.5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ROTH</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettes (Research Plus)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>ROTH</td><td>6329</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Kit d’isolement d’ARN</td><td>Machery-Nagel</td><td>740955</td><td>Kit d’isolement d’ARN</td></tr><tr><td>Pipette boy (Accu-Jet Pro)</td><td>Marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum dérivé du plasma pauvre en plaquettes, bovin (PDS)</td><td>Fisher</td><td>50-443-029</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25742</td><td>qPCR master mix</td></tr><tr><td>film qPCR (MicroAmp Optical Adhesive Film)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4211971</td><td></td></tr><tr><td>plaques qPCR (MicroAmp Fast 96-well)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de ROCK, chlorhydrate Y27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur RT-PCR (StepOnePlus)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StemFlex milieu basal + 50x supplément StemFlex</td><td>Gibco</td><td>A3349401</td><td>Milieu d’entretien des cellules souches</td></tr><tr><td>Rotor à godets oscillants (Heraeus #2704)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrophosphate de thiamine</td><td>Sigma</td><td>C8754-5G</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4 %</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-033</td><td>Réactif de dissociation cellulaire non enzymatique (EDTA)</td></tr></tbody></table>

neisseria meningitidis infection de cellules endothéliales cérébrales dérivées de cellules souches pluripotentes induites

Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

La méningite à méningocoques est une infection potentiellement mortelle qui survient lorsque Neisseria meningitidis (méningocoque, Nm) peut accéder au système nerveux central (SNC) en pénétrant dans des cellules endothéliales cérébrales (CEB) hautement spécialisées. Comme le Nm est un agent pathogène spécifique à l’homme, l’absence de systèmes modèles in vivo robustes rend difficile l’étude des interactions hôte-pathogène entre le Nm et les BEC et établit la nécessité d’un modèle humain qui imite les BEC natifs. Les BEC possèdent des propriétés de barrière plus serrées que les cellules endothéliales périphériques caractérisées par des jonctions serrées complexes et une résistance électrique trans-endothéliale (TEER) élevée. Cependant, de nombreux modèles in vitro , tels que les BEC primaires et les BEC immortalisés, n’ont pas ou perdent rapidement leurs propriétés de barrière après avoir été retirés du microenvironnement neuronal natif. Les progrès récents dans les technologies des cellules souches humaines ont permis de mettre au point des méthodes permettant de dériver des cellules endothéliales semblables à celles du cerveau à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) qui permettent de mieux faire une phénocopie des BEC par rapport à d’autres modèles humains in vitro . L’utilisation de BEC dérivés d’iPSC (iPSC-BEC) pour modéliser l’interaction Nm-BEC présente l’avantage d’utiliser des cellules humaines qui possèdent des propriétés de barrière BEC et peut être utilisée pour examiner la destruction de la barrière, l’activation immunitaire innée et l’interaction bactérienne. Nous montrons ici comment dériver des iPSC-BEC à partir d’iPSCs en plus de la préparation bactérienne, de l’infection et de la collecte d’échantillons pour analyse.

Le protocole décrit ici est adapté de Stebbins et al. et met en évidence le processus de différenciation des cellules iPS en cellules endothéliales semblables au cerveau qui possèdent des propriétés de BHE, et comment utiliser ce modèle pour les études d’infection utilisant des cellules iPSC-BEC avec Nm19,22. Les iPSC-BEC, lorsqu’ils sont différenciés correctement, présentent des propriétés de barrière serrée mesurées par TEER qui sont souvent supérieures à 2000 ...

Le protocole décrit ici met en évidence les principales étapes de la différenciation des cellules endothéliales cérébrales dérivées de cellules souches pluripotentes induites, de la préparation de Neisseria meningitidis pour l’infection et de la collecte d’échantillons pour d’autres analyses moléculaires.

Neisseria meningitidis Infection de cellules endothéliales cérébrales dérivées de cellules souches pluripotentes induites

Meningococcal meningitis is a life-threatening infection that occurs when Neisseria meningitidis (meningococcus, Nm) can gain access to the central ...

Ce protocole démontre l’utilisation de cellules endothéliales de type cerveau dérivées d’iPSC pour examiner les interactions hôte-pathogène au niveau des barrières hémato-encéphalique, telles que les barrières hémato-cervicales méningées, dans un modèle qui peut mieux imiter les cellules endothéliales cérébrales in vivo. L’examen in vitro des propriétés de la barrière cellulaire endothéliale cérébrale et des interactions avec des agents pathogènes spécifiques à l’homme peut être difficile en raison des limites de la modélisation. Les cellules endothéliales cérébrales dérivées d’iPSC sont particulièrement utiles pour ces applications car elles possèdent des phénotypes de barrière supérieurs et sont d’origine humaine.Maintenez les cellules souches pluripotentes induites, ou iPSC, à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans des plaques à six puits avec deux millilitres de milieu de maintenance des cellules souches. Pour faire passer les cellules, aspirez le milieu d’un puits qui n’est pas confluent et ajoutez un millilitre de réactif de dissociation cellulaire non enzymatique. Ensuite, incubez l’assiette à 37 degrés Celsius pendant sept minutes.Pendant ce temps, remplacez la solution de gel matriciel sur une nouvelle plaque à six puits par deux millilitres de milieu d’entretien de cellules souches fraîches par puits. Aspirez le réactif de dissociation cellulaire en prenant soin de ne pas aspirer les cellules qui sont encore attachées à la plaque. Rincez le fond du puits avec six millilitres de milieu d’entretien des cellules souches jusqu’à ce que toutes les cellules soient complètement détachées.Ensemencez la nouvelle plaque à six puits avec des densités variables, généralement de un à six ou de un à 12 pour un entretien normal. Secouez l’assiette d’avant en arrière et de gauche à droite, en faisant une pause entre les mouvements de secousse alternés jusqu’à ce que le milieu se soit stabilisé. Ensuite, mettez-le dans l’incubateur.Ajoutez un millilitre de réactif de dissociation cellulaire enzymatique dans chaque puits et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant sept minutes. Pour désactiver le réactif de dissociation cellulaire, transférez un millilitre de suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres avec au moins deux millilitres de milieu d’entretien des cellules souches fraîches. Faites tourner la suspension cellulaire à 1500 G pendant cinq minutes.Ensuite, mettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu d’entretien des cellules souches et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Remettre en suspension 7,5 fois 10 à la cinquième cellules dans 12 millilitres de milieu d’entretien des cellules souches et 10 inhibiteurs de roche micromolaires. Aspirer la matrice d’un ballon T75 et transférer la suspension cellulaire dans le ballon.Agitez le ballon pour répartir les cellules et placez-le dans l’incubateur. Rafraîchissez le milieu tous les jours pendant les deux prochains jours pour éliminer l’inhibiteur de roche et favoriser la croissance des colonies de cellules souches. Le troisième jour, commencez la différenciation en changeant le média en un média inconditionné.Changez le milieu tous les jours pendant les cinq prochains jours. Six jours après le début de la différenciation, élargir sélectivement la population de cellules endothéliales en passant à une cellule endothéliale ou à un milieu EC avec 20 nanogrammes par millilitre de bFGF et 10 micromolaires d’acide rétinoïque. Incuber les cellules pendant deux jours.Préparez la solution de collagène IV et de fibronectine selon les instructions du manuscrit et utilisez-la pour enrober les plaques de culture cellulaire et les inserts membranaires. Aspirez le milieu EC des cellules et ajoutez 12 millilitres de réactif de dissociation cellulaire. Incuber le ballon à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que 90 % des cellules se soient détachées.Pendant le temps d’incubation, retirez la solution d’enrobage des plaques et des inserts préalablement préparés et laissez-les sécher dans une hotte stérile. Une fois les cellules détachées, utilisez une pipette de 10 millilitres pour créer une suspension unicellulaire. Transférez les cellules dans un tube de 50 millilitres et diluez-les avec un volume égal de milieu sans sérum endothélial humain.Comptez ensuite les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Granulez les cellules à 1500 G pendant 10 minutes. Ensuite, mettez-les en suspension dans un milieu EC fraîchement préparé avec du bFGF et de l’acide rétinoïque pour une concentration de 2 millions de cellules par millilitre.Ajoutez 500 microlitres de suspension cellulaire en haut d’un insert à 12 puits et 1,5 millilitre de fluide au fond. Répartissez les cellules uniformément sur l’insert et incubez la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, changez le média en EC sans bFGF ni acide rétinoïque.Placez le voltmètre/ohmmètre épithélial dans le capot de biosécurité et connectez les électrodes. Désinfectez les électrodes en les immergeant dans de l’éthanol à 70 % pendant au moins cinq minutes et laissez-les sécher complètement. Retirez les cellules de l’incubateur et mesurez immédiatement la résistance électrique transendothéliale, ou TEER, en plaçant l’électrode la plus courte sur le dessus de l’insert et l’électrode la plus longue dans le milieu entourant l’insert.La veille de l’expérience d’infection, commencez une culture nocturne de la bactérie à partir de bouillon congelé. S’écouler sur la gélose Columbia sur la gélose Columbia avec 5 % de sang de mouton et incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Les bactéries pathogènes, telles que Neisseria meningitidis, ont le potentiel de provoquer des maladies chez l’homme.Il est important de bien former les personnes qui travaillent avec de tels micro-organismes et de toujours utiliser les meilleures pratiques et de porter un EPI approprié. Le lendemain, préparez un milieu frais PPM plus selon les instructions du manuscrit et inoculez 10 millilitres de milieu avec les bactéries et incubez la culture. Pendant l’incubation des bactéries, replacez le milieu dans les cellules endothéliales cérébrales dérivées d’iPSC, puis centrifugez la culture bactérienne à 4 000 G pendant 10 minutes.Aspirer le média et remettre en suspension la pastille dans 250 microlitres de PBS. Ajustez à une OD600 d’environ 0,4, soit environ une fois 10 puissance 10 puissance huit unités formant colonie par millilitre. Diluez les bactéries à la multiplicité d’infection souhaitée avec un milieu EC et infectez les cellules avec 100 microlitres de la suspension bactérienne préparée par puits.Ensuite, incubez les cellules pendant le temps souhaité de l’infection. Lorsqu’elles sont différenciées correctement, les cellules endothéliales cérébrales dérivées d’iPSC présentent des propriétés de barrière étanche qui sont souvent supérieures à 2000 ohms centimètre carré et des marqueurs endothéliaux, tels que VE-Cadhérine et CD-31. De plus, ils expriment et localisent les marqueurs de jonction serrée Claudin-5, Occludin et ZO-1, ainsi que les transporteurs, tels que Glut-1.Lors de l’infection par Neisseria meningitidis, les cellules régulent à la hausse les cytokines neutrophililes et pro-inflammatoires, telles que CXCL8, CXCL1, CXCL2, CCL20 et IL6. Lors de la différenciation cellulaire, l’entretien quotidien et l’obtention de la densité de semis optimale initiale lors de la division des cellules sont essentiels. En suivant les étapes décrites ici, les chercheurs peuvent collecter une variété d’échantillons pour étudier de nombreux aspects de l’interaction post-pathogène, des réponses inflammatoires au dysfonctionnement des cellules endothéliales cérébrales.L’avènement des cellules endothéliales cérébrales dérivées d’iPSC a ouvert les portes au domaine des barrières cérébrales pour étudier un large éventail de maladies où les cellules endothéliales sont compromises. Comme certains agents pathogènes du SNC sont spécifiques à l’homme, nous démontrons l’utilisation d’un système basé sur l’homme avec l’agent pathogène Neisseria meningitidis spécifique à l’homme

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette méthode décrit comment isoler et d'immortaliser les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau de souris. Nous décrivons un protocole étape par étape à partir de l'homogénéisation du tissu cérébral, phases de digestion, l'ensemencement et l'immortalisation des cellules. Habituellement, cela prend environ cinq semaines pour obtenir un ensemble homogène, immortalisé ligne de cellules endothéliales microvasculaires.

Génération d&#39;une ligne Immortalisé microvasculaire murin des cellules endothéliales du cerveau comme un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle barrière hémato-encéphalique

Cette vidéo démontre un protocole pour induire la différenciation des cellules souches pluripotentes induites en cellules endothéliales cérébrales.

Génération de cellules endothéliales cérébrales à partir de cellules souches pluripotentes induites

Cette vidéo illustre un processus en plusieurs étapes pour différencier les iPSC humaines en cellules endothéliales microvasculaires cérébrales. Les cellules différenciées qui en résultent imitent étroitement les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau, caractérisées par des jonctions serrées, ce qui les rend idéales pour la recherche sur les maladies du cerveau.

Différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme en cellules endothéliales microvasculaires cérébrales

Source : Parajuli, B., et.al. Transplantation de microglie dérivée de cellules souches pluripotentes humaines induites dans le cerveau de souris immunocompétentes par voie transnasale non invasive. J. Vis. Exp. (2022).Cette vidéo démontre la transplantation transnasale de cellules microgliales humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPSMG) dans le cerveau d’une souris. L’hyaluronidase est appliquée sur les narines d’une souris appauvrie en microglies pour améliorer la...

Transplantation transnasale de cellules microgliales humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites dans le cerveau de souris

Ici, nous vous présentons notre méthode établie pour reprogrammer des cellules somatiques humaines dans CSPi humaines sans transgène avec le virus de Sendai, qui montre des résultats cohérents et une efficacité accrues.

Génération efficace d&#39;origine humaine souches pluripotentes à partir de cellules somatiques humaines avec Sendai-virus

Cibler les cellules du cerveau-résident pour la lignée reprogrammation directe offre de nouvelles perspectives pour la réparation du cerveau. Nous décrivons ici un protocole de la façon de préparer les cultures enrichies en péricytes du cerveau-résident de l'adulte cortex cérébral humain et les convertir en neurones induits par l'expression de retrovirus de facteurs de transcription Sox2 et Ascl1.

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Ici, nous décrivons une méthode pour induire la méningite méningococcique par une voie intracisternal d'infection chez les souris adultes. Nous présentons un protocole étape par étape de l'infection méningococcique de la préparation de l'inoculum à l'infection intracisternal ; enregistrez ensuite la survie animale et évaluez les charges bactériennes dans les tissus murines.

Induire la méningite méningococcique Sérogroupe C chez les souris par l'intermédiaire de la livraison intracisternal

Nous décrivons une injection intracisternale qui emploie une aiguille pliée à la pointe qui peut être stabilisée au crâne, éliminant ainsi le risque de dommages au parenchyme sous-jacent. L’approche peut être utilisée pour la cartographie du destin génétique et les manipulations des cellules leptoméningeales et pour le suivi du mouvement des fluides phériques.

Induction de modification des cellules leptomeningeales par injection intracisterale

Ce protocole détaille une méthode adaptée pour dériver, étendre, et cryopréserver des cellules endothéliales microvasculaires de cerveau obtenues en différeciant les cellules souches pluripotentes induites par l’homme, et pour étudier des propriétés de barrière de cerveau de sang dans un modèle ex vivo.

Dérivation, expansion, cryopréservation et caractérisation des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Le protocole présenté ici permet la transplantation de microglies humaines induites dérivées de cellules souches pluripotentes (iPSMG) dans le cerveau par voie transnasale chez des souris immunocompétentes. La méthode de préparation et de transplantation transnasale de cellules et l’administration d’un mélange de cytokines pour le maintien de l’iPSMG est présentée.

Transplantation de microglies dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans le cerveau de souris immunocompétentes par voie transnasale non invasive

Ici, nous décrivons un protocole, la méthode de culture cellulaire endothéliale étendue (EECM), qui permet de différencier les cellules souches pluripotentes en cellules de type cellule endothéliale microvasculaire cérébrale (BMEC). Ces cellules présentent l’expression de molécules d’adhésion cellulaire endothéliale et constituent donc un modèle de barrière hémato-encéphalique humain adapté à l’étude des interactions entre cellules immunitaires in vitro.

Différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme en cellules endothéliales microvasculaires cérébrales de type phénotype avec un phénotype immunitaire mature

Découvrez une méthode utilisant des cellules endothéliales cérébrales dérivées de cellules souches pluripotentes induites pour étudier les interactions hôte-pathogène avec Neisseria meningitidis. Ce modèle permet d'analyser les mécanismes d'infection au niveau de la barrière hémato-encéphalique.

Neisseria meningitidis Infection de cellules endothéliales cérébrales dérivées de cellules souches pluripotentes induites

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