Mesure de la liaison des nucléotides aux protéines membranaires fonctionnelles intactes en temps réel

Comme l’ATP est un messager cellulaire important, nous avons développé une méthode qui nous permet de mesurer la liaison de l’ATP à ses récepteurs avec une grande précision. En utilisant FRET entre les dérivés nucléotidiques et les protéines marquées par fluorescence, nous pouvons surveiller la liaison des nucléotides aux récepteurs fonctionnels intacts en temps réel et avec une excellente résolution spatiale. Nous utilisons cette méthode pour comprendre les effets du métabolisme cellulaire sur le canal potassique sensible à l’ATP, qui est impliqué dans certaines formes de diabète.

Pour mettre en place une expérience de membrane sans toit, utilisez d’abord une paire de pinces pour casser un petit fragment d’un couvercle avec des cellules transfectées et rincez le fragment avec du PBS. Si la glissière de couverture est pré-enduite de polylysine, placez le fragment au fond d’une antenne de 35 millimètres contenant deux millilitres de PBS et maintenez un sonicateur de sonde de trois millimètres trois à cinq millimètres au-dessus de l’échantillon, pulsant à 50 watts et 20 à 40% d’amplitude pendant 200 à 500 millisecondes pour découvrir les cellules. Si les lamelles de couvercle ne sont pas pré-enduites, après rinçage avec du PBS, tremper le fragment dans un tube contenant 0,1% de poly-L-lysine pendant environ 30 secondes avant de découvrir les cellules avec une brève sonication comme démontré.

Transférer le fragment soniqué dans une antenne parabolique de 35 millimètres en verre couvert contenant deux millilitres de solution de bain et monter la boîte sur un microscope inversé équipé d’un objectif d’immersion dans l’eau à grande ouverture numérique 60x. Vérifiez que le port de caméra du microscope est connecté à un spectrographe en série avec une caméra CCD haute sensibilité et utilisez une pompe péristaltique pour perfuser la chambre du bain avec un tampon à un débit de 0,5 à un millilitre de tampon par minute. Pour identifier les fragments de membrane non couverts exprimant le canal marqué ANAP, visualisez l’échantillon pour localiser les membranes avec des canaux fluorescents.

Enclenchez partiellement le masque du spectromètre entre le port de la caméra du microscope et le spectrographe. L’ombre du masque apparaîtra sur l’image de la caméra. Acquérir une image de champ clair et de fluorescence de la membrane non couverte pour permettre la sélection de la région d’intérêt pour l’analyse.

Rapprochez l’extrémité du système de perfusion microvolume de la membrane non couverte. Pour acquérir une image de la fluorescence ANAP, excitez la membrane avec une LED de 385 nanomètres à travers un filtre d’excitation passe-bande 390/18 nanomètres et un dichroïque de bord de 416 nanomètres, collectant la lumière émise à travers un filtre d’émission passe-long de 400 nanomètres. Engagez le masque du spectromètre et assurez-vous que la lumière émise est traversée.

Alignez la région d’intérêt avec la fente du masque du spectromètre. Enclenchez les réseaux du spectromètre. Une fois les réseaux en place, la lumière diffractée par le spectromètre sera projetée sur la puce de la caméra CCD pour produire des images spectrales.

Les images conserveront les informations spatiales dans la dimension Y. La dimension X sera remplacée par la longueur d’onde. Tout en perfusant avec une solution tampon sans nucléotides, obtenir une ou plusieurs expositions de 0,1 à dix secondes pour la correction en aval et la normalisation des données recueillies tout au long du reste de l’expérience.

Ensuite, appliquer une gamme de concentrations d’ATP TNP dans la solution du bain pour établir une courbe concentration-réponse, en perfusant chaque solution pendant au moins une minute pour s’assurer qu’un état d’équilibre est atteint et obtenir une exposition pour chaque concentration. Après chaque concentration, laver le TNP ATP avec une solution de bain sans nucléotides pendant au moins une minute avant d’acquérir une image d’exposition post-traitement. Pour effectuer une expérience de fluorométrie patch-clamp, tirez d’abord les pipettes patch des capillaires de verre borosilicaté à paroi épaisse à une résistance de 1,5 à 2,5 mégaohms lorsqu’ils sont remplis avec une solution de pipette.

Ensuite, transférez un couvercle avec des cellules transfectées dans une antenne à fond de verre de 35 millimètres contenant deux millilitres de solution de bain et montez la capsule sur le microscope inversé. Perfuser la chambre de bain avec une solution de bain et identifier une cellule exprimant des canaux marqués ANAP. Appliquez une légère pression positive sur une pipette patch et placez la pipette dans une chambre de bain.

Pressez la pipette contre la membrane de la cellule et appliquez une aspiration douce pour obtenir un joint gigaohm. Pour exciser le patch, éloignez rapidement le support de pipette de la cellule patchée. Approchez l’extrémité de la pipette du patch de l’extrémité du système de perfusion et vérifiez que la percuterie se trouve dans la fente du masque du spectromètre.

Appliquez ensuite l’ATP TNP et collectez les spectres d’image. Dans ces images, un fragment de membrane typique non couvert d’une cellule HEK293T exprimant des canaux potassiques sensibles à l’ATP marqués avec une protéine fluorescente orange peut être observé. Dans cette image spectrale de canaux potassiques sensibles à l’ATP marqués par l’ANAP dans une membrane non couverte d’une cellule HEK293T exposée à cinq micromolaires TNP ATP, deux régions de haute intensité peuvent être observées qui correspondent au pic d’émission d’ANAP et de TNP ATP.

Un spectre final peut être obtenu en soustrayant le spectre de fond moyenné du spectre moyen de la région d’intérêt. Ici, la réduction de la fluorescence ANAP de pointe après plusieurs expositions peut être observée. La fluorescence maximale de plusieurs expositions en l’absence de TNP ATP a été ajustée à une seule décroissance exponentielle.

Ces données ont ensuite été utilisées pour corriger les artefacts de photoblanchiment. Ici, des images spectrales représentatives d’une membrane non couverte obtenues à partir d’une cellule exprimant des canaux potassiques sensibles à l’ATP marqués ANAP en l’absence et la présence de TNP ATP sont montrées. L’observation des spectres d’émission corrigés révèle une séparation nette entre l’émission fluorescente donneuse et acceptrice.

Dans cette figure, les courants et spectres représentatifs des canaux potassiques sensibles à l’ATP marqués par l’ANAP provenant d’une expérience typique de fluorométrie patch-clamp sont montrés. Les spectres d’émission sont corrigés pour tenir compte du bruit de fond et du blanchiment, comme démontré pour les membranes non couvertes. Prenez soin avec les commandes de vérifier que le signal fluorescent est spécifique à votre récepteur.

Assurez-vous que votre profusion est rapide, efficace et complète et gardez vos expositions aussi courtes que possible. Cette méthode répond à des questions sur l’occupation des récepteurs et son lien avec la fonction. D’autres techniques FRET utilisées avec une configuration similaire peuvent sonder les changements de confirmation induits par le ligand dans le récepteur.