Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Ces protocoles permettent à l’utilisateur de produire un grand nombre d’organoïdes testiculaires fonctionnels structurellement mimétiques et endocriniens dans des environnements exempts d’ECM et de DCM dans des conditions de culture 2D ou 3D. Ces techniques sont hautement reproductibles, facilement appliquées aux laboratoires biologiques standards, et n’utilisent que des outils et des matériaux communs. Les organoïdes testiculaires sont un nouvel outil pour simuler la spermatogenèse et l’endocrinologie reproductive in vitro, et pourraient un jour permettre l’étude de la gametogenèse in vitro.

Commencez par placer la sulfpine euthanasie de souris sur un tapis de dissection et stérilisant l’abdomen avec 70% d’éthanol. Tentez la peau du bas-ventre avec des forceps et ouvrez-la avec des ciseaux. Localiser les testicules dans les régions inguinales inférieures gauche et droite de l’abdomen et couper leurs connexions aux déférents de vas et à tout tissu conjonctif d’ancrage.

Puis soulevez les testicules entiers de l’animal. Placez-le dans une boîte de Pétri de BM pré-équilibré. Sous un microscope à dissection, faire une petite incision dans la tunica albuginea à une extrémité de chaque testicule avec soit de petits ciseaux de micro dissection ou en déchirant doucement avec deux forceps fins. Tout en tenant le testicule de l’extrémité opposée de l’incision, serrez-le doucement avec des forceps fins et poussez dans un mouvement de balayage vers le trou dans la tunica, qui libérera le tissu testiculaire comme pièce cohésive.

Couper le tissu en petits morceaux. Placez les morceaux en un millilitre de solution de dissociation d’avant-guerre et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’incubation, triturer délicatement les morceaux de testicules 50 fois avec une pipette P1000.

Assurez-vous que les tubules se séparent les uns des autres et du tissu interstitiel. S’il reste des touffes, incuber pendant cinq minutes supplémentaires et triturer à nouveau. Ajouter 33 microlitres de solution de bouillon d’hyaluronidase par millilitre du mélange de dissociation.

Puis triturer 50 fois avec une pipette P1000 et incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’incubation, triturer 50 fois avec une pipette P200. Après s’être assuré qu’il n’y a pas de tubules visibles ou de touffes de cellules, étanchez les enzymes de dissociation en ajoutant du FBS à 10 % du volume total de l’échantillon et triturez-le plusieurs fois avec une pipette P200.

Mouillez le centre d’une passoire à cellules de 40 micromètres avec du média et aspirez-le, puis ajoutez l’échantillon à la passoire prémét mouillée et filtrez-le pour produire une suspension à cellule unique. Centrifuger la suspension à 100 fois g pendant sept minutes. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules dans bm frais. Comptez les cellules viables sur un hémocytomètre à l’aide de l’exclusion bleue trypan, puis re-centrifugeuse et les résuspendez en BM frais. Pour une culture sans ECM 2D, plaquez les suspensions à cellule unique directement sur les glissières de chambre à quatre puits et placez les glissières dans un incubateur de 35 degrés Celsius.

Pour la culture ecm 2D, distribuez 100 microlitres de liquide matriciel extracellulaire dilué froid en un seul milieu de matrice dilué dans une glissière de chambre de quatre puits, en veillant à ce que le gel couvre le fond du plat. Placez la lame dans l’incubateur pendant au moins 30 minutes pour permettre à l’ECM de polymériser dans un gel, puis ajoutez la suspension cellulaire sur le dessus. Pour une culture 3D sans ECM, placez les boîtes de Pétri 3D surgi dans un plat de culture de 24 puits et couvrez-les d’un millilitre de BM. Laissez les plats s’équilibrer en BM pendant au moins 30 minutes dans un incubateur de 35 degrés Celsius, puis jetez le BM et répétez l’équilibrage une fois de plus avec un millilitre de BM frais. Retirez tous les BM du puits et distribuez 200 microlitres de BM frais autour mais pas à l’intérieur de l’évidement central de la boîte de Pétri 3D, puis recueillez n’importe quel BM restant de l’intérieur de la cavité centrale d’ensemencement de cellules du micro insert de puits.

Distribuez la suspension à cellule unique dans l’évidement central et triturez doucement de haut en bas. Placez le plat dans un incubateur humidifié de 35 degrés Celsius pour la culture. Le lendemain, retirez lentement et soigneusement les supports existants autour de la boîte de Pétri 3D agarose et remplacez-les par un millilitre de BM frais. Les organoïdes auraient dû se compacter pendant la nuit, ce qui leur permet de se reposer au fond.

Pour la culture ECM 3D, préparez une suspension à cellule unique en combinant des parties égales de la suspension cellulaire en BM avec de l’ECM prégelé à froid. Triturer plusieurs fois pour s’assurer qu’il est bien mélangé. Ensuite, distribuez immédiatement le mélange dans une glissière de chambre de quatre puits, en s’assurant qu’il couvre tout le fond de la plaque.

Incuber la chambre glisse à 35 degrés Celsius et laisser son contenu polymériser pendant au moins 30 minutes. Après la polymérisation, ajouter 500 microlitres de BM au-dessus de la culture. Culture tous les types de modèles organoïdes à 35 degrés Celsius.

Pour tous les types de culture, échangez la moitié de leurs médias avec bm frais tous les deux jours. Ce protocole a été employé pour réaliser la génération organoïde dans les 24 heures utilisant les cellules testiculaires juvéniles de murine. Les tissus générés avec succès ont été au commencement observés en tant que faisceaux de cellules 3D.

Dans les environnements ECM, les grappes cellulaires possédaient des marges claires entre le cluster et leur environnement environnant. On a également observé que les grappes cellulaires migrent à travers l’ECM et fusionnent ensemble. La culture 3D ECM a nécessité beaucoup plus de temps pour assembler des structures de novo que toutes les autres méthodes de culture.

Et la culture 3D sans ECM a produit les plus grands clusters avec un seul cluster grand et compact dans chaque puits de la boîte de Pétri agarose 3D. Pour évaluer si les modèles organoïdes ressemblent au tissu indigène, les constructions biologiques ont été sondées pour des marqueurs spécifiques aux cellules et visualisées avec l’immunofluorescence. Les méthodes 2D ECM et 3D ECM-free ont produit des organoïdes avec une morphologie interne fortement mimétique de compartimentation testiculaire.

Une analyse à long terme a été effectuée sur les organoïdes assemblés sans ECM 3D. Les organoïdes ont été cultivés pendant 14 jours, puis sondés pour des marqueurs cellulaires et spécifiques à la structure. Des structures en comme des tubules ont été observées.

Les organoïdes sans ECM 3D ont également été étudiés pour la fonction endocrinienne dans une culture de 12 semaines avec la stimulation de gonadotropine. La testostérone et l’inhibine B ont été quantifiées du milieu organoïde-conditionné. Après 12 semaines, des gonadotropines ont été enlevées pendant 48 heures, causant des concentrations de testostérone et d’inhibine B pour diminuer.

Quand les gonadotropines ont été retournées, les deux concentrations d’hormone ont sensiblement augmenté, démontrant la réactivité endocrinienne appropriée. L’assemblage organoïde tire parti du comportement autonome des cellules testiculaires immatures viables. Des expériences créatives peuvent être facilement conçues en utilisant des mélanges cellulaires triés sur mesure ou hybrides.

Après l’ensemencement cellulaire, l’imagerie vidéo en direct ou l’imagerie en accéléré peuvent être utilisées pour quantifier l’auto-assemblage organoïde. Dans toute la culture, les organoïdes et le milieu de l’état peuvent être recueillis pour des analyses d’analyse histologique et amino.