Génération et caractérisation quantitative des kystes épithéliales biliaires fonctionnels et polarisés

C’est le premier protocole pour générer des kystes biliaires, fournissant une analyse systématique qui permet l’évaluation de la formation de kyste, de l’efficacité, et de la taille au fil du temps. Cette méthode permet l’évaluation quantitative de la formation épithéliale de kyste, et permet d’évaluer ce processus en fonction du type de cellules épithéliales ou hydrogel. Puisque les options thérapeutiques pour des désordres biliaires sont limitées, ce protocole ouvre la porte pour normaliser des études de drogue, identifier des cibles thérapeutiques normales, et comprendre des mécanismes de maladie.

La méthode simple permet de répondre à des questions importantes sur les mécanismes de nouvelles informations dans le domaine de la bioingénierie des structures tubulaires. Avant de commencer une expérience, décongelez une solution hydrogel appropriée à quatre degrés Celsius et des pointes de pipette pré-refroidies et une glissade de chambre de huit puits à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, placez l’hydrogel et une glissade de chambre de huit puits sur la glace et ajoutez le volume approprié d’hydrogel au cholangiocyte normal froid de rat pour obtenir 500 microlitres de solution d’hydrogel de 40%.

Ensuite, utilisez les pointes de pipette froide pour ajouter 50 microlitres de solution hydrogel au centre de chaque puits de la glissière de chambre et utilisez une pointe de pipette pour étendre la solution sur toute la surface du fond du puits aussi uniformément que possible sans bulles. Pour préparer les cellules à l’expérience, pendant que l’hydrogel est polymérisant, lavez les cellules d’une culture normale de cholangiocyte de rat de 70% confluent avec le PBS préchauffé et incubez les cellules avec cinq millilitres de PBS préchauffé frais pendant 20 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. À la fin de l’incubation, remplacer le PBS par un millilitre de Trypsin-EDTA préchauffé et remettre le flacon à l’incubateur de culture cellulaire pendant cinq à dix minutes.

Lorsque les cellules se sont détachées, neutralisez la réaction avec quatre millilitres de cholangiocyte normal normal préchauffé et transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres pour centrifugation. Puis suspendez la pastille en cinq millilitres de milieu préchauffé et filtrez les cellules à travers une passoire de 40 microns dans un tube de 50 millilitres pour le comptage. Pour générer des kystes, ajouter le volume approprié d’hydrogel au milieu normal froid de cholangiocyte de rat pour obtenir 1.600 microlitres d’une solution d’hydrogel de 80% sur la glace et diluer les cellules à cinq fois 10 aux cinquièmes cellules par millilitre de concentration normale froide de cholangiocyte de rat dans 1.600 microlitres de milieu.

Mélangez immédiatement les solutions cellulaires et hydrogel cellulaires et ajoutez 400 microlitres de cellules à chaque puits de la glissière de chambre recouverte d’hydrogel, en prenant soin d’éviter les bulles. Pour assurer l’acquisition de résultats reproductibles et significatifs, assurez-vous de manipuler l’hydrogel avec soin et de bien mélanger la solution initiale d’hydrogène cellulaire pour obtenir une solution homogène. Lorsque toutes les cellules ont été ensemencées, placez la diapositive dans l’incubateur de culture cellulaire.

Après deux jours de culture, retirer 250 microlitres du milieu d’un coin de chaque puits, en prenant soin de ne pas rincer l’hydrogel, et remplacer lentement le supernatant jeté par 250 microlitres de milieu de culture frais. Pour l’imagerie kyste, le jour approprié de la culture, sélectionnez l’objectif 10 X sur un microscope à contraste de phase équipé d’un logiciel d’acquisition d’images, allumez la lampe blanche et sélectionnez l’option d’imagerie brightfield. Sélectionnez jouer pour allumer la caméra et se concentrer sur un champ de kystes.

Réglez le temps d’exposition et ouvrez la fenêtre du dossier de capture automatique pour permettre l’enregistrement automatique des images. Ouvrez la fenêtre de la série Z de capture, réinitialisez la position par défaut et utilisez la vis Z pour définir les plaines supérieure et inférieure de la pile Z, en ajustant l’étape Z en fonction de l’objectif et du niveau de résolution. Cliquez ensuite sur exécuter dès maintenant pour lancer l’acquisition.

Après l’imagerie, ouvrez la pile Z aux Fidji. Pour dupliquer la pile, cliquez sur l’image, dupliquez et dupliquez la pile. Pour créer une projection d’intensité minimale à partir de la pile dupliquée, sous le menu image, sélectionnez les piles et le projet Z.

Sélectionnez l’intensité minimale pour le type de projection et cliquez bien. Pour soustraire l’arrière-plan de la projection, sous le menu de processus, sélectionnez l’arrière-plan de soustraction et sélectionnez 500 pixels de rayon de boule roulante et fond léger pour rendre les kystes plus contrastés que l’arrière-plan. Pour mesurer le diamètre approximatif du kyste, zoomez sur le kyste ciblé, sélectionnez l’outil en ligne droite et appuyez sur le bouton T sur le clavier.

Tracez une ligne à travers le diamètre de chaque kyste sur la projection finale. La prochaine région d’intérêt créée pour chaque kyste sera ajoutée à la région du gestionnaire d’intérêt. Lorsque tous les kystes ont été comptés, cliquez sur la fenêtre Z-stack pour le sélectionner et cliquez sur afficher tous pour voir les kystes comptés.

Déplacez le curseur le long de la pile Z pour vérifier que tous les kystes ont été comptés dans chaque image, en ajoutant de nouveaux kystes à la région de gestionnaire d’intérêt si nécessaire. Lorsque tous les kystes ont été comptés, sélectionnez la région d’intérêt ensemble et cliquez plus et enregistrer pour enregistrer les données. Pour déterminer la taille de chaque kyste, avec les régions d’intérêts encore sélectionnées, cliquez sur mesurer.

Une fenêtre énumérant chaque kyste et sa taille estimée apparaîtront. Enregistrez ensuite les données au format CSV. Comme démontré, l’enregistrement du nombre de kystes et de leurs tailles respectives au fil du temps permet l’analyse de l’évolution de la formation et de la croissance de kyste.

La viabilité de la population de cellules de départ et des kystes vieux de 10 jours peut être évaluée par coloration vivante/morte. Les cellules mortes représentent moins de 3% de la population cellulaire au jour 10 et sont principalement situées à l’extérieur du kyste comme cellules isolées ou dans le cadre de petits agrégats, bien que certaines accumulations de débris cellulaires nécrotiques soient observées dans certains gros kystes. L’incubation avec le diacétate de fluorescéine et hoechst permet d’évaluer la formation et la sécrétion de fluorescéine du basal à l’espace luminal apical.

Notamment, la sécrétion de fluorescéine est inhibée par prétraitement avec un inhibiteur multirésistant, ce qui indique que l’accumulation fluorescente de fluorescéine dans le lumen est due à la sécrétion par le transporteur multirésistant et non à une fuite de l’espace intercellulaire. La coloration pour l’expression d’E-cadherin indique que les cholangiocytes normaux de rat maintiennent leur phénotype épithélial dans l’hydrogel pendant au moins 10 jours. Lors de la préparation des kystes pour l’évaluation de l’immunofluorescence, le maintien de l’albumine de sérum bovin à 0,1% ou moins pendant la saturation est la clé pour maintenir l’intégrité du kyste, que des concentrations plus élevées entraînent la rétractation des kystes et l’effondrement lumen.

L’hydrogel de nuit, le dégel, la pointe de pipette et l’enregistrement de glissière de chambre, le travail sur la glace et l’épandage uniforme du mélange homogène d’hydrogel cellulaire sur la glissière de chambre cultivé sont tous essentiels au succès expérimental. Cette méthode peut être utilisée pour générer des kystes à partir d’autres cellules épithéliales ou hydrogels, permettant des comparaisons pour une meilleure compréhension de la polarisation épithéliale. Cette méthode quantitative peut être utilisée pour tester les effets des médicaments ou des mutations génétiques sur la fonction biliaire et l’organogenèse.