Name: Utilisation de neurones hippocampiques cultivés primaires pour étudier l’assemblage des segments initiaux axonaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Découvrez l'analyse quantitative de l'assemblage des segments initiaux axonaux dans les neurones hippocampiques primaires. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de développement neuronal et les altérations liées aux troubles neurodéveloppementaux.

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Nous remercions le Dr Gary Banker pour sa suggestion sur le protocole de culture neuronale. Ce travail est soutenu par le Howard Hughes Medical Institute, une subvention des NIH et une chaire de professeure dotée de George Barth Geller (V.B.).

REMARQUE: Cette méthode de culture de neurones de l’hippocampe à partir de souris ank3-E22/23f/f postnatales de 0 jour est adaptée du système de co-culture glie/neurone de Gary Banker. Par conséquent, il est essentiel d’effectuer toutes les étapes après la dissection dans une hotte propre à l’aide d’outils stérilisés. Ce protocole prend jusqu’à 1 mois. Le flux de travail est affiché dans Figure 3. Le protocole suit les directives animales de l’Université Duke.
1. Préparation des lamaux et des plats de placage neuronal
<ol><li>Au moins une semaine avant le jour de la culture, chargez les lamaux sur le support de lamelle et faites-le tremper dans de l’acide nitrique (70 % P/P) pendant la nuit (peut être prolongé pendant des jours).</li>
	<li>Laver les lamelle de couverture traitée à l’acide nitrique avec de l’eau distillée sur un agitateur à basse vitesse dans un bocal en verre 2 fois, 1 heure chacune.</li>
	<li>Incuber des lamisses de couverture dans du KOH saturé dissous dans de l’éthanol à 100% pendant la nuit. Ajouter le KOH dans l’éthanol jusqu’à ce qu’il ne soit plus dissous.</li>
	<li>Répétez l’étape de lavage avec de l’eau distillée. Rincer les lamaux de couverture avec de l’éthanol à 100% une fois pendant 10 minutes.</li>
	<li>Transférez les lamelle du rack vers un bécher en verre. Couvrez le bécher avec du papier d’aluminium. Cuire les lamaux de couverture dans un four à 225 °C pendant la nuit pour stériliser les lamaux de couverture. (Les lamaux de couverture pourraient être conservés dans le bécher pendant des semaines).</li>
	<li>Placez les lamelle dans une boîte de Petri, puis appliquez 3-4 points de cire sur la lamelle de couverture pour servir de pieds. Utilisez une pipette Pasteur pour tremper dans de la cire bouillie dans une bouteille en verre. Ensuite, touchez rapidement la lamelle de couverture pour créer un point. Une boîte de Pétri de 60 mm peut contenir 4 lamelle. Une boîte de Petri de 10 mm peut contenir environ 10 lamaux.</li>
	<li>2 jours avant le jour de la culture, enrober les lamôles (le côté avec les points de cire) avec filtre stérilisé 1 mg/mL de poly-L-lysine dans de l’acide borique 0,1 M (pH 8,5) pendant un minimum de 6 heures et rincer à l’eau 2 fois, 1 heure à chaque fois. Les lamelle de couverture restent dans la même boîte de Pétri.</li>
	<li>Ajouter le milieu de placage (MEM complété avec du glucose 0,6% (poids/vol) et 10% (vol/vol) de sérum de cheval) aux plaques lentement sans déranger les lamelles. Mettez des assiettes dans l’incubateur jusqu’au jour de la culture pour ensemencer les neurones.</li>
</ol>2. Préparation des plats d’alimentation en cellules glia (2 semaines avant le jour de la culture)
<ol><li>Disséquer le cortex d’un cerveau postnatal de souris âgées de 1 jour et décoller les méninges.</li>
	<li>Hachez le tissu cortex aussi finement que possible avec des ciseaux propres dans une boîte de Petri propre dans un banc propre.</li>
	<li>Transférer le tissu haché dans 12 ml de HBSS et ajouter 1,5 mL de trypsine à 2,5 % et de DNase à 1 % (poids/vol). Incuber dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 min, balancer toutes les 5 min. Les tissus bien digérés deviennent collants et forment un gros cluster. Triturer 10-15 fois avec une pipette de 10 mL pour décomposer le tissu et obtenir une meilleure digestion.</li>
	<li>Triturer le tissu bien digéré 10 à 15 fois avec une pipette de 5 mL jusqu’à ce que la plupart des morceaux disparaissent et que le milieu devienne trouble. Passez à travers une passoire cellulaire pour enlever les morceaux restants et ajouter 15 mL de milieu glia (milieu essentiel minimal (MEM) complété par du glucose (0,6% en poids/vol), 10% (vol/vol) de sérum de cheval et de pénicilline-streptomycine (1x) pour arrêter la digestion.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 120 x g pendant 5 minutes et aspirer le surnageant. Ressusciter le granulé cellulaire avec du milieu de glia frais et des graines dans des plats de culture cellulaire (environ 105 cellules/cm2).</li>
	<li>Remplacez le milieu par un milieu de glie frais le lendemain pour enlever les cellules non attachées.</li>
	<li>Nourrissez les plats de glie tous les 3-4 jours avec du milieu de glie fraîche. Claquez le ballon 5 à 10 fois avec une main pour déloger les cellules lâchement attachées avant de changer de milieu.</li>
	<li>Après 10 jours de culture, les cellules gliales doivent être presque confluentes. Détachez les cellules gliales avec 0,25% de trypsine-EDTA et ensemencez environ 105 cellules dans un nouveau plat de culture cellulaire de 60 mm. Les cellules restantes pourraient être congelées pour une utilisation future.</li>
	<li>3 jours avant le jour de la culture, changer le milieu de glie en milieu de culture neuronal (milieu neurobasal-A avec 1x GlutaMAX-I et 1x supplément de B27).</li>
</ol>3. Culture des neurones de l’hippocampe
REMARQUE: Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante.
<ol><li>Disséquer 6-8 hippocampes de chiots postnatals de 1 jour de souris ANK3-E22/23f/f avec hbss milieu dans une boîte de Petri à la pièce tempérée. Hachez l’hippocampe avec des ciseaux de dissection en petits morceaux. Transférer l’hippocampe de la boîte de Petri dans un tube de 15 mL.</li>
	<li>Laver l’hippocampe 2x avec 5 mL de HBSS dans le tube. Laisser l’hippocampe dans 4,5 mL de 1x HBSS après lavage.</li>
	<li>Ajouter 0,5 mL de trypsine à 2,5 % dans 4,5 mL de HBSS et incuber dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 minutes. Inversez le tube toutes les 5 minutes. Les hippocampes bien digérés devraient devenir collants et former un cluster. Si nécessaire, prolongez la digestion pendant 5 minutes supplémentaires.</li>
	<li>Laver l’hippocampe avec hbss 3 fois pendant 5 minutes chacun. N’utilisez pas de vide pour retirer le système HBSS. Il est très facile d’enlever l’hippocampe.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de HBSS après le lavage et pipetter l’hippocampe de haut en bas avec une pipette Pasteur 15 fois.</li>
	<li>Triturer le tissu avec une pipette Pasteur polie au feu (le diamètre de l’ouverture est réduit de moitié) 10 fois. N’allez pas au-delà de 10 fois même s’il reste encore des morceaux. L’entendement tue les neurones.</li>
	<li>Reposez le tube pendant 5 minutes jusqu’à ce que tous les morceaux se mettent au fond. Utilisez doucement une pointe de pipette de 1 mL pour transférer le surnageant contenant les neurones dissociés dans des plats de placage (105 cellules/plat de 60 mm). Ajoutez-le directement au placage pré-incube et secouez doucement la plaque.</li>
	<li>Répétez l’étape 3.6-3.7 avec les morceaux restants jusqu’à ce que la plupart des morceaux aient disparu.</li>
	<li>2-4 heures après l’ensemencement, vérifiez les plats de placage avec un microscope optique. La majorité des neurones devraient avoir attaché à la lamelle de couverture. Les cellules attachées sont rondes et brillantes. Retournez les lamures à l’aide d’une pince à pointe fine aux plats d’alimentation des cellules glies avec un milieu de culture neuronal préconditionné avec les points de cire côté orientés vers le bas.</li>
	<li>Les neurones peuvent se développer dans les plats d’alimentation des cellules gliaires jusqu’à 1 mois. Alimentez les neurones tous les 7 jours avec 1 mL de milieu de culture neuronale frais.</li>
	<li>Étape facultative : 1 semaine après l’ensemencement, ajouter la cytosine arabinoside (1-β-D-arabinofuranosylcytosine) à une concentration finale de 5 μM pour freiner la prolifération gliale.</li>
</ol>4. Perturbation de l’AIS par Knockout d’Ankyrin-G à un stade plus précoce du développement des neurones
<ol><li>Sur 3 div (jour in vitro),retournez les lamelle avec des points de cire côté face à un plat d’alimentation de cellules glia avec un milieu de culture neuronal conditionné.</li>
	<li>Mélanger 0,25 μg d’ADN Cre-BFP avec 0,5 μg d’ADN ankyrine-G-GFP (WT/mutant) dans un tube de 1,7 mL pour transfecter 4 lamelles (~ 2:1 rapport du nombre de copies d’ADN). Ajouter 100 μL de milieu de culture (p. ex. Opti-MEM), mélanger et reposer sur un rack. Si seul le Cre-BFP est transfecté, le squelette plasmidique GFP est utilisé pour correspondre à la quantité totale d’ADN.</li>
	<li>Mélanger 3 μL de réactif de transfection (p. ex. Lipofectamine 2000) (~ 3 fois d’ADN) avec un milieu de culture de 100 μL dans un nouveau tube de 1,7 mL. Incuber pendant 5 minutes à RT.</li>
	<li>Mélanger 100 μL de solution d’ADN de l’étape 4.2 avec 100 μL de réactif de transfection de l’étape 4.3. Reposez-vous pendant 5-10 minutes sur un rack.</li>
	<li>Ajouter 50 μL de mélange d’ADN de l’étape 4.4 juste au-dessus de chaque lamelle de couverture en insérant la pointe juste en dessous du milieu sans toucher les lamelle de couverture. Pipetter lentement pour éviter la propagation du mélange d’ADN.</li>
	<li>Ramenez lentement le plat à l’incubateur et incuber pendant 30 à 45 minutes.</li>
	<li>Retournez les lamaux de couverture vers le plat d’alimentation de glia à la maison avec des points de cire côté vers le bas et remettez la plaque à l’incubateur.</li>
</ol>5. Quantification du segment initial de l’axone
<ol><li>Fixer les neurones sur 7-10 div et la tache avec le marqueur AIS suivant le protocole d’immunocytochimie standard pour la protéine de l’intéressant.</li>
	<li>Recueillir des images fluorescentes avec la microscopie souhaitée.<ol>
<li>Prenez des sections de la série Z pour collecter le signal de l’AIS entier. Conservez la même profondeur Z pour toutes les images.</li>
		<li>Ajustez l’intensité laser pour atteindre la meilleure plage dynamique d’intensité de pixel.</li>
		<li>Assurez-vous que toutes les photos AIS sont prises sur la même configuration de microscope.</li>
		<li>Vérifiez toujours le signal de Cre-BFP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantification ais<ol>
<li>Image ouverte avec Fidji (https://fiji.sc).</li>
		<li>Générez une projection maximale des images de la série Z.</li>
		<li>Soustrayez le signal d’arrière-plan de la couverture vide de l’image.</li>
		<li>Tracez une ligne le long de l’AIS. La largeur de la ligne devrait couvrir entièrement l’AIS. Commencez la ligne avant que le signal AIS soit soulevé au-dessus de l’arrière-plan et arrêtez après qu’il tombe à l’arrière-plan.</li>
		<li>Mesurez l’intensité moyenne des pixels seule la ligne et exportez vers une feuille de calcul (~ 10-15 AIS sont nécessaires).</li>
		<li>Générer la courbe d’intensité moyenne de l’AIS à l’aide du script MATLAB adapté de Berger et al.15.</li>
		<li>Pour chaque expérience, inclure Cre seulement et Cre plus wildtype 480 kDa ankyrin-G neurones transfectés comme contrôles négatifs et positifs pour s’assurer que l’élimination de l’AIS est l’efficacité et le sauvetage est réussi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Nelson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction%3A+Ankyrin-G+regulates+forebrain+connectivity+and+network+synchronization+via+interaction+with+GABARAP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP.</a> Molecular Psychiatry. , (2019).</li>
<li>Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+ankyrin-G+stabilizes+somatodendritic+GABAergic+synapses+through+opposing+endocytosis+of+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).</li>
<li>Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axo-axonic+Innervation+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons+by+GABAergic+Chandelier+Cells+Requires+AnkyrinG-Associated+L1CAM%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM.</a> Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).</li>
<li>Hofflin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+Axon+Initial+Segment+in+Interneurons+and+Pyramidal+Cells+of+Rodent+Visual+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332(2017).</li>
<li>Schluter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Plasticity+of+Synaptopodin+in+the+Axon+Initial+Segment+during+Visual+Cortex+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development.</a> Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).</li>
<li>Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+activity+regulates+Na%28%2B%29+channel+distribution+at+the+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment.</a> Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).</li>
<li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+relocation+of+the+axon+initial+segment+fine-tunes+neuronal+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability.</a> Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).</li>
<li>Pan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+ankyrin-G-based+mechanism+retains+KCNQ+and+NaV+channels+at+electrically+active+domains+of+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon.</a> Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).</li>
<li>Cooper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Made+for+%22anchorin%22%3A+Kv7.2%2F7.3+%28KCNQ2%2FKCNQ3%29+channels+and+the+modulation+of+neuronal+excitability+in+vertebrate+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnkyrinG+is+required+for+clustering+of+voltage-gated+Na+channels+at+axon+initial+segments+and+for+normal+action+potential+firing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing.</a> The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).</li>
<li>Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnkyrinG.+A+new+ankyrin+gene+with+neural-specific+isoforms+localized+at+the+axonal+initial+segment+and+node+of+Ranvier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).</li>
<li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+ankyrin-G%3A+a+critical+innovation+in+vertebrate+evolution+of+fast+and+integrated+neuronal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).</li>
<li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+polarity+is+determined+by+a+multifunction+motif+mediating+lateral+membrane+retention+through+ankyrin-G+and+apical-lateral+transcytosis+through+clathrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Berger, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Myosin+II+Activity+Regulates+Assembly+and+Plasticity+of+the+Axon+Initial+Segment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment.</a> Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+mutation+of+giant+ankyrin-G+disrupts+a+core+mechanism+for+axon+initial+segment+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’assemblage de l’AIS est organisé par 480 kDa ankyrine-G. Cependant, l’ankyrine-G a des isoformes plus courtes qui peuvent cibler l’AIS des neurones de type sauvage, ce qui peut entraîner des difficultés dans l’interprétation des analyses structure-fonction de l’assemblage de l’AIS. Nous présentons ici une méthode utilisant des neurones de souris ANK3-E22/23-flox qui permet l’étude de l’assemblage de novo de l’AIS. En transfectant avec Cre-BFP à 3 div, nous éliminons toutes les isoformes endogènes de ...

Le segment initial de l’axone est situé à l’axone proximal dans la plupart des neurones vertébrés. Fonctionnellement, l’AIS est l’endroit où les potentiels d’action sont initiés en raison de la haute densité des canaux sodiques voltage-gated dans cette région. L’AIS de certains neurones excitateurs est également ciblée par des interneurones inhibiteurs par la formation de synapses GABAergiques1,2,3. Par conséquent, l’AIS est un site essentiel pour intégrer la signalisation cellulaire et moduler l’excitabilité des neurones. L’AIS a normalement une longueur de 20 à 60 μm et se trouve à moins de 20 μm du corps cellulaire. La longueur et la position de l’AIS varient dans les neurones d’une région du cerveau à l’autre, ainsi que dans différents stades de développement du même neurone4,5. Les preuves accumulées suggèrent que la composition et la position de l’AIS sont dynamiques pour répondre au changement de l’activité neuronale4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G est le maître organisateur de l’AIS. L’ankyrine-G 480 kDa est une protéine adaptatrice associée à la membrane qui se lie directement aux canaux sodiques voltageogènes ainsi qu’à d’autres protéines AIS majeures, notamment la beta4-spectrine, les canaux KCNQ2/3 qui modulent l’activité des canaux sodiques8,9et la neurofascine 186 kDa, un L1CAM qui dirige les synapses GABAergiques vers l’AIS2,10. 480 kDa ankyrine-G partage des domaines canoniques d’ankyrine trouvés dans la courte isoforme ankyrine-G de 190 kDa (répétitions ANK, domaine de liaison à la spectrine, domaine régulateur), mais se distinguent par un exon géant que l’on ne trouve que chez les vertébrés et qui est spécifiquement exprimé dans les neurones(figure 1A)11,12. Le domaine spécifique du neurone ankyrine-G de 480 kDa (NSD) est requis pour la formation de l’AIS12. L’ankyrine-G de 190 kDa ne favorise pas l’assemblage d’AIS ni ne cible l’AIS dans les neurones ankyrine-G-null12. Cependant, 190 kDa d’ankyrine-G est concentré au niveau de l’AIS contenant 480 kDa d’ankyrine-G12. Cette capacité de l’ankyrine-G de 190 kDa à cibler l’AIS pré-assemblé des neurones de type sauvage a été une source de confusion dans la littérature et a ralenti l’appréciation des fonctions spécialisées critiques de l’ankyrine-G de 480 kDa dans l’assemblage d’AIS. Par conséquent, il est essentiel d’étudier l’assemblage d’AIS dans les neurones ankyrine-G-null qui n’ont pas d’AIS pré-assemblé.
Ici, nous présentons une méthode pour étudier l’assemblage et la structure de l’AIS en utilisant des neurones hippocampiques cultivés à partir de souris ANK3-E22/23-flox qui élimine toutes les isoformes de l’ankyrine-G13 (Figure 1B). En transfectant des neurones avec une construction Cre-BFP avant que l’AIS ne soit assemblé, nous avons généré des neurones déficients en ankyrine-G qui manquaient complètement d’AIS(Figure 1B, Figure 2). L’assemblage de l’AIS est entièrement sauvé après co-transfection du plasmide ankyrine-G-GFP de 480 kDa avec un plasmide Cre-BFP. Cette méthode permet d’étudier l’assemblage AIS dans un environnement AIS non pré-assemblé. Nous avons également modifié le système de co-culture glia-neurone de Gary Banker sans utiliser d’antibiotiques, précédemment conçus pour les neurones embryonnaires du jour 18, pour une application aux neurones postnatals de souris et adapté une méthode de quantification AIS pour faire la moyenne des mesures AIS de plusieurs neurones afin de normaliser la variation de l’AIS14,15.

<table><tbody><tr><td>10xHBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>18mm (1.5D)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-84-1D</td><td></td></tr><tr><td>190kDa ankyrin-G-GFP</td><td>Addgene</td><td>#31059</td><td></td></tr><tr><td>2.5 % Tripsin sans rouge de phénol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>480kDa ankyrin-G-GFP</td><td>lab made</td><td>Fournir sur demande</td><td></td></tr><tr><td>ANK3-E22/23f/f</td> souris <td>JAX</td><td>Code commande : 029797</td><td>B6.129-ANK3tm2.1Bnt/J ;</td></tr><tr><td>Complément alimentaire sans sérum B27</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Passoire cellulaire avec maille de 70 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Porte-racles de coloration en céramique</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Cre-BFP</td><td>Addgene</td><td>#128174</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>Supplément GlutaMAX-I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1286001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668030</td><td></td></tr><tr><td>MEM avec Earle' sels et L-glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Acide nitrique 70 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>225711</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Sérum réduit Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>26124-78-7</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation de neurones hippocampiques cultivés primaires pour étudier l’assemblage des segments initiaux axonaux

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Les segments initiaux de l’axone neuronal (AIS) sont des sites d’initiation des potentiels d’action et ont été largement étudiés pour leur structure moléculaire, leur assemblage et leur plasticité dépendante de l’activité. L’ankyrine géante-G, le principal organisateur de l’AIS, s’associe directement aux canaux sodique et potassique (VSVG) et à la tension couvrant la membrane (KCNQ2/3), ainsi qu’à la neurofascine 186 kDa, une molécule d’adhésion cellulaire L1CAM. L’ankyrine-G géante se lie également aux molécules d’AIS cytoplasmiques et les recrute, y compris la bêta-4-spectrine, et les protéines de liaison aux microtubules, EB1/EB3 et Ndel1. L’ankyrine-G géante est suffisante pour sauver la formation d’AIS dans les neurones déficients en ankyrine-G. L’ankyrine-G comprend également une isoforme plus petite de 190 kDa située au niveau des épines dendritiques au lieu de l’AIS, qui est incapable de cibler l’AIS ou de sauver l’AIS dans les neurones déficients en ankyrine-G. Ici, nous avons décrit un protocole utilisant les neurones hippocampal cultivés des souris d’ANK3-E22/23-flox, qui, une fois transfected avec cre-BFP montrent la perte de toute l’isoforme de l’ankyrine-G et altèrent la formation d’AIS. Combiné un système modifié de co-culture de glie de Banker/neurone, nous avons développé une méthode pour transfecter des neurones nuls d’ankyrine-G avec un plasmide ankyrine-G-GFP de 480 kDa, ce qui est suffisant pour sauver la formation d’AIS. Nous utilisons en outre une méthode de quantification, développée par Salzer et ses collègues pour traiter la variation de la distance de l’AIS par rapport aux corps cellulaires neuronaux neuronaux qui se produit dans les cultures de neurones de l’hippocampe. Ce protocole permet des études quantitatives de l’assemblage de novo et du comportement dynamique de l’AIS.

Un ensemble complet d’expériences devrait inclure la transfection Cre-BFP seulement comme contrôle négatif, Cre-BFP plus 480 kDa ankyrine-G co-transfection comme contrôle positif et une condition non transfected comme contrôle technique. Dans le contrôle de Cre-BFP uniquement, les neurones transfectés n’ont pas l’accumulation de marqueurs AIS, y compris l’ankyrine-G (ankG), la beta4-spectrine (β4), la neurofascine (Nf) et les canaux sodiques à tension fermée (VSVG) (Figure 4A)<sup class="xre...

Ici, nous avons décrit un protocole pour étudier quantitativement l’assemblage et la structure des segments initiaux d’axone (AIS) des neurones hippocampiques qui manquent d’AIS pré-assemblé en raison de l’absence d’un ankyrin-G géant.

Utilisation de neurones hippocampiques cultivés primaires pour étudier l’assemblage des segments initiaux axonaux

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Ce protocole est utilisé pour étudier quantitativement l’assemblage et la structure des segments initiaux axonaux des neurones de l’hippocampe qui manquent d’AIS pré-assemblé en raison de l’absence d’une ankyrine-G géante. Pour commencer, disséquer six à huit hippocampes de bébés postnatals d’un jour avec du milieu HBSS dans une boîte de Pétri. Hachez l’hippocampe avec des ciseaux de dissection en petits morceaux et transférez-les du plat dans un tube de 15 millilitres.Lavez les hippocampes deux fois avec cinq millilitres de HBSS, et laissez-les dans 4,5 millilitres de HBSS après le lavage. Ajouter 0,5 millilitres de trypsine à 2,5 % dans 4,5 millilitres de HBSS et incuber dans un bain-marie de 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, en inversant le tube toutes les cinq minutes. Les hippocampes bien digérés devraient devenir collants et former un cluster.Si nécessaire, prolongez la digestion pendant cinq minutes supplémentaires. Laver l’hippocampe avec hbss trois fois pendant cinq minutes par lavage. Après le lavage, ajoutez deux millilitres de HBSS et pipettez l’hippocampe de haut en bas avec une pipette Pasteur 15 fois.Triturer le tissu avec une pipette Pasteur polie au feu 10 fois, et reposer le tube pendant cinq minutes jusqu’à ce que tous les morceaux soient réglés au fond. Répétez la trituration avec les morceaux restants jusqu’à ce que la plupart d’entre eux aient disparu. Ensuite, utilisez une pointe de pipette d’un millilitre pour transférer doucement le surnageant contenant les neurones dissociés dans des plats de placage.Ajoutez-le directement au placage pré-incobé et secouez doucement la plaque. Deux à quatre heures après l’ensemencement, vérifiez les plats de placage avec un microscope optique. La majorité des neurones devraient avoir attaché à la glissade de couverture.À l’aide d’une pince à pointe fine, retournez le couvercle glisse vers les plats d’alimentation des cellules gliales contenant un milieu de culture neuronale préconditionné avec les points de cire orientés vers le bas. Les neurones peuvent se développer dans les plats d’alimentation des cellules gliales jusqu’à un mois. Nourrissez les neurones tous les sept jours avec un millilitre de milieu de culture neuronale frais.Le troisième jour in vitro, retournez les glissades de couverture avec le côté du point de cire tourné vers le haut dans un plat d’alimentation de cellules gliales avec un milieu de culture neuronale conditionné. Mélanger 0,25 microgramme d’ADN CRE BFP avec 0,5 microgramme d’ADN ankyrine-GFP dans un tube de 1,7 millilitre pour transfecter quatre glissades de couverture. Ajouter 100 microlitres optimales.Ensuite, mélangez le tube et reposez-vous sur un rack. Si seul le BFP CRE est transfecté, le squelette plasmique GFP est utilisé pour correspondre à la quantité totale d’ADN. Mélanger trois microlitres de réactif de transfection avec 100 microlitres d’optimum dans un nouveau tube de 1,7 millilitre et incuber le tube pendant cinq minutes à température ambiante.Ensuite, mélangez 100 microlitres de l’ADN précédemment mélangé avec 100 microlitres de mélange de réactif de transfection, et laissez-le pendant cinq à 10 minutes sur un rack. Ajoutez 50 microlitres du mélange d’ADN sur le dessus de chaque glissement de couverture en insérant la pointe juste en dessous du support sans toucher les glissements de couverture. Pipette lentement pour éviter de répandre le mélange d’ADN.Ramenez lentement le plat à l’incubateur et laissez-le là pendant 30 à 45 minutes. Retournez le couvercle glisse vers le plat d’alimentation glial à la maison avec le côté du point de cire vers le bas et remettez le plat dans l’incubateur. Pour la quantification AIS, ouvrez les images de la série Z aux Fidji et générez une projection maximale d’images.Après avoir soustrait le signal d’arrière-plan de glissement de couverture vide de l’image, tracez une ligne le long de l’AIS, en vous assurant que la largeur de la ligne couvre entièrement l’AIS. Commencez la ligne avant que le signal AIS soit soulevé au-dessus de l’arrière-plan et arrêtez après qu’il tombe à l’arrière-plan. Mesurez l’intensité moyenne des pixels le long de la ligne et exportez-la vers une feuille de calcul.Ensuite, exécutez un script MATLAB pour générer la figure finale. L’expérience devrait inclure la transfection de Cre-BFP seulement comme contrôle négatif, la cotransfection de Cre-BFP plus 480 kilodalton ankyrine-G comme contrôle positif, et une condition non-transfectée comme contrôle technique. Dans le contrôle de Cre-BFP seulement, les neurones transfectés manquent de l’accumulation des marqueurs d’AIS, y compris l’ankyrine-G, le bêta spectrin 4, la neurofascine, et les canaux de sodium à tension fermée.En revanche, Cre et 480 kilodalton ankyrine-G neurones co-transfectés ont entièrement assemblé AIS, ce qui est démontré par la présence de marqueurs AIS. Il est important de confirmer la qualité de la culture par comparaison avec les plats non transfectés. Les neurones malsains ont tendance à montrer une structure anormale de l’AIS, comme l’AIS discontinué ou ectopique.Pour évaluer comment une mutation neurodevelopmental humaine d’ankyrine-G de désordre affecte l’assemblage d’AIS, l’intensité moyenne d’AIS a été tracée du soma à l’axone distal. Les protéines enrichies par AIS montrent normalement une augmentation rapide du signal de l’axone proximal et une diminution lente du signal à l’axone distal. Lorsqu’elle est alignée avec l’AIS non transfecté, la courbe mutante est plus large et le pic de la courbe est plus bas, ce qui suggère un changement de structure de l’AIS.L’AIS assemblé de type sauvage ankyrine-G étroitement aligné avec le non-transfecté.

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