Name: Plasmodium falciparum Culture de gamétocytes et infection par les moustiques par l’alimentation par membrane artificielle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Apprenez la culture de gamétocytes infectieux de Plasmodium falciparum et l'infection des moustiques par alimentation sur membrane artificielle. Cette méthode permet d'étudier la biologie de la transmission du paludisme et de générer des sporozoïtes pour la recherche.

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Les auteurs remercient Bloomberg Philanthropies pour son soutien financier au Johns Hopkins Malaria Research Institute (JHMRI). Ce travail n’aurait pas été possible sans l’expertise fournie par les installations de base d’insectes et de parasitologie de JHMRI.

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<li>Grabias, B., Zheng, H., Mlambo, G., Tripathi, A. K., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+enhanced+chemiluminescent-ELISA+for+the+detection+of+Plasmodium+falciparum+circumsporozoite+antigen+in+midguts+of+Anopheles+stephensi+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive enhanced chemiluminescent-ELISA for the detection of Plasmodium falciparum circumsporozoite antigen in midguts of Anopheles stephensi mosquitoes.</a> Journal of Microbiological Methods. 108, 19-24 (2015).</li>
<li>Ferrer, P., Vega-Rodriguez, J., Tripathi, A. K., Jacobs-Lorena, M., Sullivan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimalarial+iron+chelator+FBS0701+blocks+transmission+by+Plasmodium+falciparum+gametocyte+activation+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Antimalarial iron chelator FBS0701 blocks transmission by Plasmodium falciparum gametocyte activation inhibition.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (3), 1418-1426 (2015).</li>
<li>Sanders, N. G., Sullivan, D. J., Mlambo, G., Dimopoulos, G., Tripathi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gametocytocidal+screen+identifies+novel+chemical+classes+with+Plasmodium+falciparum+transmission+blocking+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gametocytocidal screen identifies novel chemical classes with Plasmodium falciparum transmission blocking activity.</a> PLoS One. 9 (8), 105817(2014).</li>
<li>Lindner, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomics+and+proteomics+reveal+two+waves+of+translational+repression+during+the+maturation+of+malaria+parasite+sporozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Transcriptomics and proteomics reveal two waves of translational repression during the maturation of malaria parasite sporozoites.</a> Nature Communications. 10, 4964(2019).</li>
<li>McLean, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Transmission-Competent+Human+Malaria+Parasites+with+Chromosomally-Integrated+Fluorescent+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of Transmission-Competent Human Malaria Parasites with Chromosomally-Integrated Fluorescent Reporters.</a> Scientific Reports. 9, 13131(2019).</li>
<li>Espinosa, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+Cleavage+of+the+Plasmodium+falciparum+Circumsporozoite+Protein+Is+a+Target+of+Protective+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Proteolytic Cleavage of the Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein Is a Target of Protective Antibodies.</a> Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1111-1119 (2015).</li>
<li>Swearingen, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+Plasmodium+Sporozoite+Surface%3A+Identification+of+Surface-Exposed+Proteins+and+Demonstration+of+Glycosylation+on+CSP+and+TRAP+by+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Interrogating the Plasmodium Sporozoite Surface: Identification of Surface-Exposed Proteins and Demonstration of Glycosylation on CSP and TRAP by Mass Spectrometry-Based Proteomics.</a> PLoS Pathogens. 12 (4), 1005606(2016).</li>
<li>Ifediba, T., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+in+vitro+maturation+of+Plasmodium+falciparum+gametocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete in vitro maturation of Plasmodium falciparum gametocytes.</a> Nature. 294 (5839), 364-366 (1981).</li>
<li>Miura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inter-laboratory+comparison+of+standard+membrane-feeding+assays+for+evaluation+of+malaria+transmission-blocking+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">An inter-laboratory comparison of standard membrane-feeding assays for evaluation of malaria transmission-blocking vaccines.</a> Malaria Journal. 15, 463(2016).</li>
<li>Miura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualification+of+Standard+Membrane-Feeding+Assay+with+Plasmodium+falciparum+Malaria+and+Potential+Improvements+for+Future+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Qualification of Standard Membrane-Feeding Assay with Plasmodium falciparum Malaria and Potential Improvements for Future Assays.</a> PLoS One. 8 (3), 57909(2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les méthodes décrites ici ont été utilisées avec succès à l’Institut de recherche sur le paludisme Johns Hopkins depuis plus de10ans15,16,17,18,19,20,21,22. Les gamétocytes produits à l’aide de ce protocole ont été utilisés pour des tests gamétocytocidaires...

Le paludisme est causé par les parasites Plasmodium et est transmis à leurs hôtes vertébrés par la piqûre infectieuse de moustiques anophèles femelles. Selon le rapport 2019 de l’Organisation mondiale de la santé (OMS), on estime à 405 000 le nombre de décès, sur un total de 228 millions de cas de paludisme1. La plupart des décès liés au paludisme étaient concentrés dans la région africaine, en particulier chez les enfants de moins de cinq ans. Alors que le taux d’incidence global du paludisme a diminué à l’échelle mondiale à partir de 2010, le déclin a plafonné ces dernières années et des stratégies de lutte supplémentaires sont nécessaires de toute urgence pour éliminer la maladie.
Les stades sanguins asexués cycliques des parasites du paludisme provoquent une pathogenèse de la maladie et un petit sous-ensemble de ceux-ci se différencient en gamétocytes femelles et mâles. Les gamétocytes de Plasmodium falciparum sont uniques par nature car ils prennent de 7 à 10 jours à se développer à travers cinq stades morphologiquement distincts. Les gamétocytes immatures du stade I à IV sont séquestrés dans le parenchyme de la moelle osseuse et restent largement absents de la circulation périphérique2,3,4,5. Les érythrocytes infectés par des gamétocytes matures de stade V sont libérés dans la circulation sanguine et circulent librement pour être pris par les moustiques. Une fois à l’intérieur de l’intestin moyen du moustique, les gamétocytes sont activés, par un changement de température et une exposition à l’environnement de l’intestin moyen, se transforment en gamètes femelles et mâles et commencent le développement des stades de moustique, qui culmine avec les stades infectieux des sporozoïtes dans les glandes salivaires des moustiques6,7.
Depuis que Trager et Jenson8 ont décrit une méthode standardisée de culture de P. falciparum,les études sur les stades sanguins asexués ont considérablement progressé. Cependant, l’absence d’un système de culture fiable pour les stades sexuels a rendu difficile l’étude des gamétocytes de P. falciparum, de la biologie de la transmission et des stades des moustiques. Ces dernières années, plusieurs méthodes ont été publiées qui ont aidé les laboratoires à établir des cultures de gamétocytes9,10,11,12. Ce manuscrit décrit un protocole normalisé et fiable pour la culture des gamétocytes de P. falciparum qui peut représenter une ressource précieuse pour la communauté de recherche sur le paludisme. Cette méthode permet la production robuste de gamétocytes matures et infectieux qui, avec un protocole d’alimentation normalisé des moustiques, se traduit par une infectiosité très fiable des moustiques. Ces méthodes ont été établies pour maintenir un approvisionnement ininterrompu en gamétocytes et en parasites au stade des moustiques. Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole complet de culture de gamétocytes (Figure 1), la préparation de mangeoires à membrane de verre et l’infection des moustiques à l’aide de ces mangeoires membranaires (Figure 2), la dissection de l’intestin moyen (Figure 3) et de la glande salivaire des moustiques (Figure 4), et la quantification de l’infection chez les moustiques après la dissection de l’intestin moyen et des glandes salivaires.

<table><tbody><tr>Solution <td></td><td></td><td></td><td>de sucre à 10 % Pipette</td></tr><tr><td>sérologique 10ml</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>tube conique 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique 1ml</td><td>Falcon</td><td>357521</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Pipette sérologique</td><td>Falcon</td><td>357535</td><td></td></tr><tr><td>37&deg ; C Incubateur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml tube conique</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique 5ml</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>6 plaques de culture tissulaire</td><td>puits Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>70 % Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette en verre 9"</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Anopheles Mosquitoes</td><td>JHMRI, Noyau d’insectarium</td><td>Nous utilisons un compteur de cellules A. stephensi ou A. gambiae (keele)</td>Bain d’eau circulante Pince à pointe fine Fisherbrand 12-000-122 Coloration Geimsa Sigma GS1L Dessiccateur en verre Mangeoire à membrane en verre <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG183570</td><td></td></tr><tr><td>Lames de verre</td><td>Fisherbrand</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Sang humain O+</td><td>JHU</td><td></td><td>Lavez les globules rouges trois fois avec RPMI et réfrigérez à 50 % d’hématocrite</td></tr><tr><td>Sérum humain O+</td><td>Banque de</td><td></td> sang inter-États <td>Rassemblez au moins 6 unités de sérum de différents donneurs et congelez les aliquotes à -20& deg ;C.</td></tr><tr><td>Hypoxanthine</td><td>Sigma</td><td>H9337</td><td>Faire un stock 500x dans 1M NaOH</td></tr><tr><td>Mercurochrome</td><td>Sigma</td><td>M7011</td><td>Préparer une solution mère à 1 % dans du PBS qui peut être diluée à 0,1 % si nécessaire</td></tr><tr><td>Micro Pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td>Tout microscope avec objectif 10x, 40x et 100x fonctionnera.</td></tr><tr><td>Gobelets anti-moustiques</td><td>Coupes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neptune N-acétylglucosamine</td><td>Sigma</td><td>A3286</td><td>Facultatif et nécessaire uniquement lorsque des gamétocytes purs sont nécessaires.</td></tr><tr><td>Filet Assurez-vous</td><td></td><td></td><td>qu’il peut contenir les moustiques et permettre l’alimentation sanguine</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Thermo Scientific</td><td>249964</td><td></td></tr><tr><td>Pointes</td><td></td><td></td><td></td>de pipette</tr><tr><td>Pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmodium falciparum NF54</td><td>BEI Resources</td><td>MRA-1000</td><td>Congelez un grand nombre de cultures à passage précoce pour vous assurer d’avoir un approvisionnement constant</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>CV-041-CV</td><td>Le milieu contient de la glutamine et de l’HEPES</td></tr><tr><td>Chauffe-lames</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td>Facultatif pour les milieux, ajouter uniquement lors de l’utilisation d’un mélange de gaz paludisme pendant le bain</td></tr> <tr><td></td><td>d’eau d’incubation</td> de la culture<td></td><td></td></tr><tr><td>Acide xanthurénique</td><td>Sigma</td><td>D120804</td><td>Pour les milieux de flagellation</td></tr></tbody></table>

plasmodium falciparum culture de gamétocytes et infection par les moustiques par l’alimentation par membrane artificielle

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

Le paludisme reste l’un des problèmes de santé publique les plus importants, causant une morbidité et une mortalité importantes. Le paludisme est une maladie transmise par les moustiques transmise par une piqûre infectieuse du moustique anophèle femelle. La lutte contre le paludisme reposera éventuellement sur une multitude d’approches, notamment des moyens de bloquer la transmission vers, par et depuis les moustiques. Pour étudier les stades des moustiques des parasites du paludisme en laboratoire, nous avons optimisé un protocole de culture de gamétocytes hautement infectieux de Plasmodium falciparum, un stade parasitaire nécessaire à la transmission de l’hôte humain au moustique vecteur. Les gamétocytes de P. falciparum mûrissent à travers cinq étapes morphologiquement distinctes, ce qui prend environ 1 à 2 semaines. La culture de gamétocytes décrite dans ce protocole est terminée en 15 jours et est infectieuse pour les moustiques des jours 15 à 18. Ces protocoles ont été développés pour maintenir un cycle continu de gamétocytes compétents en matière d’infection et pour maintenir un approvisionnement ininterrompu des stades de moustiques du parasite. Ici, nous décrivons la méthodologie de culture de gamétocytes et comment infecter les moustiques avec ces parasites en utilisant des mangeoires à membrane de verre.

Nous présentons ici les résultats d’une série d’alimentations membranaires utilisant des cultures de gamétocytes P. falciparum NF54 générées à l’aide du protocole ci-dessus (voir (Figure 5). La culture de gamétocytes a été initiée avec environ 0,5% de culture asexuée au stade mixte le jour 0, qui a atteint un pic de parasitémie d’environ 15% au jour 4 et au jour 5. Comme le montre la figure 5A à cette parasitémie élevée, les parasites sont stressés et l...

Des études détaillées sur les stades des moustiques des parasites du paludisme sont essentielles pour concevoir des stratégies efficaces de blocage de la transmission. Ce protocole montre comment mettre en culture efficacement des gamétocytes infectieux, puis nourrir ces gamétocytes avec des moustiques pour générer des stades de moustiques de P. falciparum.

Plasmodium falciparum Culture de gamétocytes et infection par les moustiques par l’alimentation par membrane artificielle

Malaria remains one of the most important public health problems, causing significant morbidity and mortality. Malaria is a mosquito borne disease ...

Les gamétocytes sont responsables de la transmission du parasite du paludisme. La génération de gamétocytes infectieux en laboratoire est essentielle pour étudier la biologie de la transmission aux stades moustiques et pour générer des sporozoïtes pour des résultats ultérieurs. Ces méthodes sont simples à adopter pour n’importe quel laboratoire, et une démonstration visuelle aidera à partager ces procédures avec la communauté mondiale du paludisme.Mes collègues, Godfree Mlambo, notre associé de recherche principal, et Sachie Kanatani, notre boursière postdoctorale, tous deux de l’Institut de recherche sur le paludisme de Johns Hopkins, feront la démonstration de la procédure avec moi. Pour mettre en place une culture de gamétocytes, faites tourner cinq millilitres de culture d’alimentation dans une centrifugeuse et remettez la pastille en suspension dans 30 millilitres de milieu complet. Mélangez 1,2 millilitre de globules rouges remplis avec le contenu du tube et ajoutez cinq millilitres de la suspension résultante dans chaque puits d’une plaque de culture à six puits.Placez ensuite l’assiette dans un photophore à 37 degrés Celsius. Tous les jours pendant les 15 à 18 prochains jou

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Une fois qu'un gène est identifié comme étant potentiellement réfractaires pour le virus de la dengue, il doit être évalué pour son rôle dans la prévention des infections virales dans le moustique. Ce protocole illustre la façon dont l'étendue des cas de dengue de moustiques peuvent être dosés. Les techniques pour cultiver le virus en culture, l'alimentation à membrane moustiques sang humain, et en dosant les titres viraux dans l'intestin moyen des moustiques sont démontrés.

Protocole pour la dengue dans les moustiques (Aedes aegypti) et détermination de phénotype d&#39;infection

Une fois qu'un gène est identifié comme étant potentiellement réfractaires au paludisme, il doit être évalué pour son rôle dans la prévention des infections à Plasmodium dans le moustique. Ce protocole illustre la façon dont l'étendue des infections à Plasmodium de moustiques peuvent être dosés. Les techniques de préparation de la culture de gamétocytes, se nourrissant de sang humain membrane moustiques, et en dosant les titres viraux dans l'intestin moyen des moustiques sont démontrés.

Protocole pour les infections à Plasmodium falciparum dans la détermination Phénotype moustiques et les infections

Cette vidéo montre la génération d’un modèle murin expérimental de paludisme cérébral. Des sporozoïtes isolés de moustiques femelles infectées par Plasmodium berghei sont injectés dans les veines de la queue d'une souris restreinte, entraînant une rupture de la barrière hémato-encéphalique et une inflammation cérébrale, provoquant un paludisme cérébral. Ce modèle de souris infectée offre un outil précieux pour étudier in vivo la pathologie microvasculaire associée au paludisme cérébral.

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La tuberculose et le paludisme sont deux des infections les plus répandues chez les humains et les principales causes de morbidité et de mortalité dans les populations pauvres dans les zones tropicales. Nous avons établi un système de modèle expérimental pour étudier les résultats de la co-infection tuberculose-paludisme chez la souris après l'épreuve avec les deux agents pathogènes par l'intermédiaire de leur voie naturelle de l'infection.

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En raison des similitudes frappantes entre le cycle de vie et la biologie des parasites du paludisme des rongeurs et les parasites du paludisme chez l'homme, les modèles de paludisme des rongeurs sont devenus indispensables à la recherche sur le paludisme. Ici, nous avons normalisé certaines des techniques les plus importantes utilisées dans l'analyse phénotypique des espèces de paludisme de rongeurs de type sauvage et transgénique.

Analyse phénotypique des stades du sang asexué et sexuel du parasite du paludisme des rongeurs et des stades des moustiques

Le test standard d’alimentation membranaire (SMFA) est considéré comme l’étalon-or pour l’évaluation et l’identification de composés antipaludiques potentiels. Ce système d’alimentation artificiel est utilisé pour infecter les moustiques afin d’évaluer davantage les effets de ces composés sur l’intensité et la prévalence du parasite Plasmodium falciparum .

Dosage standard d’alimentation par membrane pour la détection de l’infection à Plasmodium falciparum chez les moustiques vecteurs anophèles

Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour aider à élucider les mécanismes de l’immunité cellulaire à Plasmodium pendant le stade sanguin de l’infection. Il s’agit d’un test in vitro qui mesure la destruction des globules rouges infectés par les lymphocytes cytotoxiques.

In vitro Dosage de la destruction des globules rouges infectés par le plasmodium par des lymphocytes cytotoxiques

Le paludisme est transmis par l’inoculation du stade sporozoïte de Plasmodium par des moustiques infectés. Le plasmodium transgénique nous a permis de mieux comprendre la biologie du paludisme et a contribué directement aux efforts de développement d’un vaccin contre le paludisme. Nous décrivons ici une méthodologie simplifiée pour générer des sporozoïtes transgéniques de Plasmodium berghei .

Génération de sporozoïtes génétiquement modifiés à Plasmodium berghei

La génétique chimique implique la substitution d’un résidu gardien par un acide aminé contenant une chaîne latérale différente au locus cible. Ici, nous avons généré un parasite mutant contenant un allèle hypomorphe de cdpk1 et identifié des voies compensatoires adoptées par le parasite dans le fond mutant.

Comprendre le développement de voies compensatoires chez un parasite mutant du paludisme hébergeant un allèle hypomorphe de kinases ressemblant à des plantes

Le développement sexuel de Plasmodium se produit dans l’intestin moyen du moustique. Cibler les stades sexuels du parasite est une stratégie prometteuse pour bloquer la transmission. Nous avons développé Ookluc, un P. berghei transgénique exprimant la nanoluciférase après la formation de zygotes, permettant un criblage à haut débit de composés bloquant la transmission. Cet article détaille les méthodes de dépistage à l’aide d’Ookluc.

Ookluc : une ligne de Plasmodium berghei pour l’identification des composés bloquant la transmission

Apprenez la culture de gamétocytes infectieux de Plasmodium falciparum et l'infection des moustiques par alimentation sur membrane artificielle. Cette méthode permet d'étudier la biologie de la transmission du paludisme et de générer des sporozoïtes pour la recherche.

Plasmodium falciparum Culture de gamétocytes et infection par les moustiques par l’alimentation par membrane artificielle

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