Name: Quantitation du virus de la rage dans diverses structures cérébrales bovines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Apprenez la quantification du virus de la rage par qRT-PCR dans les structures cérébrales bovines. Cette méthode sensible détecte le gène N du virus pour améliorer le diagnostic et la recherche en virologie animale.

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Ces travaux ont été soutenus par l’Institut national de recherche agricole, forestière et animale (INIFAP). Nous remercions Jerzayn Fraustro Esquivel pour sa collaboration dans le développement de la vidéo associée à ce document.

Cette étude a été approuvée et menée dans le strict respect des recommandations relatives à l’utilisation des animaux fournies par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA).
1. Échantillons
<ol><li>Utilisez différentes zones du cerveau disséquées à partir de 6 cerveaux bovins positifs à la rage pour l’analyse RT-PCR.</li>
</ol>2. Anticorps fluorescents directs (AD) pour confirmer la rage
REMARQUE : La détection de l’antigène antirabique par DFA est une méthode qualitative pour déterminer la présence de la nucléoprotéine de la rage à l’aide d’anticorps étiquetés fluorescéine. Le test a été effectué à l’aide du protocole fourni par Dean et coll. (1966)20, tel que décrit ci-dessous.
<ol><li>Faites deux impressions de chaque tissu disséqué à partir de différentes structures cérébrales sur une lame stérile d’environ 15 mm de diamètre. Utilisez un applicateur en bois pour enduiser une partied’environ 3 mm 3 du tissu sur la glissière stérile. Pour créer le frottis, appuyez doucement sur l’applicateur en bois contre la diapositive manuellement.</li>
	<li>Fixez les glissières de frottis de l’échantillon en submersant les diapositives dans 100% d’acétone pendant 1 h à -20 °C. Après l’incubation, sécher les glissières sur un chiffon sec à 21 °C pendant 30 min.</li>
	<li>Ajouter 50 μL de l’anticorps antinucléoprotéine étiqueté fluorés à chaque frottis cérébral à une dilution de 1:10 en distribuant à travers une seringue.</li>
	<li>Incuber les glissières avec le conjugué dans une chambre humide à 37 °C pendant 1 h.</li>
	<li>Après l’incubation, laver les glissières deux fois avec de l’eau et avec du PBS pour éliminer l’excès de conjugué. Laisser sécher les glissières à 21 °C. Éponger soigneusement pour enlever l’excès de liquide, puis sécher brièvement à l’air avant le montage.</li>
	<li>Ajouter une goutte de 50% de glycérine phosphatée pour couvrir la surface de la section, puis couvrir d’un coverslip. Observez les sections au microscope épifluorescence à 40x grossissement.<ol>
<li>Traiter et observer les contrôles positifs et négatifs (contrôle positif : cerveaux de souris inoculés avec RABV; contrôles négatifs : cerveaux bovins négatifs rabv) de la même manière que les échantillons.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Générer un contrôle positif pour RT-PCR
<ol><li>Obtenir les cellules BHK-21 de la banque de germplasme. Utilisez des cellules jusqu’au 70e passagepour reproduire la souche RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) à l’aide du passage 2.</li>
	<li>Maintenir et propager les cellules BHK-21 dans des bouteilles contenant un minimum de milieu essentiel (MEM) complété par 10% de sérum fœtal de veau (FCS) à 37 °C en présence de CO2 (5 %) et dans des conditions humides. Faire pousser les cellules dans des flacons de culturede 25 cm 2 jusqu’à ce qu’elles atteignent 80 % de confluence, puis de sous-culture.</li>
	<li>Retirer le milieu de culture des cellules et laver la bouteille avec du salin tamponné au phosphate (PBS). Inoculer la culture avec 105 TCID/mL de souche RABV ERA. Incuber l’inoculum viral pendant 2 h sous secousse constante à 37 °C en présence de CO2 (5 %) et dans des conditions humides.</li>
	<li>Retirer le milieu d’infection et ajouter mem complété avec 5% (sérum fœtal bovin) SFB. Incuber pendant 72 h à 37 °C en présence de CO2 (5 %) dans des conditions humides.</li>
	<li>Récolte RABV 3 jours après l’inoculation lorsque les cellules présentent des effets cytopathiques. Congeler les cellules infectées, puis les décongeler à 4 °C pour lyser les cellules. Recueillir le milieu de la bouteille, puis placer les cellules dans un tube de centrifugeuse pour centrifugation à 1050 x g pendant 10 min à 4 °C.</li>
	<li>Conservez les supernatants de RABV à -80 °C et préparez des aliquots de travail pour le stockage à -70 °C.</li>
	<li>Inoculer inocule intracerébrally le virus obtenu dans l’étape précédente dans les souris femelles cd1 de 21 jours. Utilisez une seringue de 1 mL pour inoculer 50 μL de solutions contenant 106 MICLD50 (dose mortelle de culture infectieuse de souris 50 %) doses chez la souris22.</li>
</ol>4. Extraction d’ARN
REMARQUE : L’ARN total a été extrait directement des cerveaux bovins à l’aide d’une méthode d’extraction organique selon le protocole suivant.
<ol><li>Utilisez 100 mg de tissu cérébral de chaque structure anatomique pour extraire l’ARN total à l’aide d’un réaccélément disponible dans le commerce contenant de l’isothiocyanate de guanidium.</li>
	<li>Homogénéiser manuellement un total de 100 mg de tissu de chaque structure dans 1 mL du réagent d’isothiocyanate de guanidium par vortexing à l’aide d’un homogénéisateur Dounce avec un petit pilon à l’intérieur du microtube pendant 15 s à vitesse maximale.</li>
	<li>Incuber les échantillons sur la glace pendant 5 min, puis ajouter 200 μL de chloroforme. Mélanger vigoureusement les échantillons pendant 15 s, incuber sur la glace pendant 2 à 3 minutes, puis centrifugeuse à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.</li>
	<li>Transférer la phase aqueuse dans un tube propre et ajouter 500 μL d’alcool isopropylique. Incuber les échantillons pendant 15 min à 21 °C.</li>
	<li>Centrifugeuse les échantillons à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer le supernatant aqueux par pipetting. L’ARN isolé sera présent comme granulé dans le tube.</li>
	<li>Ensuite, lavez la pastille d’ARN avec 1 mL d’éthanol à 75 % par pipetting, et centrifugeuse à 7500 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Décanter le supernatant et sécher à l’air le granulé d’ARN à température ambiante (21 °C). Ensuite, diluer la pastille dans 50 μL d’eau sans nucléase.</li>
	<li>Déterminer la concentration et la qualité de l’ARN à 260 nm à l’aide d’un spectrophotomètre. Conserver l’ARN à -80 °C jusqu’à utilisation.</li>
	<li>Retirer l’ADN des échantillons d’ARN par digestion avec DNase I. Ajouter 2 U de DNase I par 1 μg d’ARN extrait dans l’étape précédente. Ensuite, ajouter 5 μL de tampon de réaction 10x, puis incuber à 37 °C pendant 30 min. Inactivez le DNase I en ajoutant 1 μL d’EDTA au mélange suivi de l’incubation pendant 10 min à 65 °C.</li>
</ol>5. synthèse cDNA et PCR
<ol><li>Synthétiser le cDNA du premier brin à l’aide d’oligo dT et de transcriptase inverse. Pour chaque 1 μg d’ARN, ajouter 1 μL d’oligo DT (500 μg/mL), 1 μL de mélange dNTP de 10 mM et de l’eau distillée sans nucléase à un volume final de 12 μL. Incuber le mélange à 65 °C pendant 5 min.</li>
	<li>Réfrigérer le mélange de réaction à 4 °C. Centrifugeuse du tube pendant 30 s à 1 050 x g,puis ajouter 4 μL de tampon de réaction, 2 μL 0,1 M DTT et 1 μL d’inhibiteur de la ribonucléase (40 U/μL).</li>
	<li>Incuber le mélange de réaction à 37 °C pendant 2 min, puis ajouter 1 μL de transcriptase inverse (200 U). Ensuite, incuber le mélange de réaction pendant 50 min à 37 °C, puis inactiver la réaction à 70 °C pendant 15 min.</li>
	<li>Conserver l’ADN à -20 °C avant utilisation. REMARQUE : Pour vérifier la qualité de l’ADN synthétisé, effectuez l’amplification d’un fragment de 761 bp du gène RABV N avant d’effectuer la synthèse in vitro. Utilisez le protocole décrit par Loza-Rubio et coll.11 tel que décrit à l’étape 5.5 ci-dessous.</li>
	<li>Effectuez la PCR à l’aide de polymésase d’ADN Taq dans les conditions suivantes. Effectuez la réaction configurée comme suit : tampon Taq 10x contenant 20 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 1 U Taq polymélase, 10 μM de chaque amorce (SuEli+: 5′ cgtrgaycaatatgagtaca 3′ et SuEli-: 5′ caggctcraacattcttctta 3′), 2,5 μL de cDNA, et l’eau ultrapure à un volume final de 50 μL.</li>
	<li>Effectuer l’amplification dans un thermocycleur en utilisant les conditions de vélo suivantes: 95 ° C pendant 3 min; 35 cycles de 95 ° C pour 30 s, 60 °C pour 30 s, et 72 °C pendant 1 min; un cycle de 72 °C pendant 7 min.</li>
	<li>Évaluer la présence des produits PCR de 761 pb à l’aide d’un gel d’agarose de 1 %.</li>
</ol>6. Transcription in vitro
REMARQUE : La transcription in vitro génère l’ARNm d’un gène cible. Utilisez une paire d’amorce qui amplifie le gène RABV N complet et qui est utilisé comme un contrôle positif pour l’analyse qRT-PCR. Ces amorces sont conçues pour amplifier le gène RABV N complet et pour ajouter un promoteur qui reconnaît la polymése T7 (TAATACGACTCACTATAG).
<ol><li>Pour amplifier l’ensemble du gène N RABV, utilisez les amorces Trans-Nrab vers l’avant (5'gatgagtcactcgaatatgtctt 3') et l’inverse (5'caataatacgactcactatagggatggatgcacaagatt 3') et un kit PCR haute fidélité.<ol>
<li>Pour chaque réaction, préparez un mix maître PCR en ajoutant à un tampon de réaction de tube PCR propre 10x, 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2, 10 mM dNTP, 10 μM de chaque amorce, 0,5 U de polymélas haute fidélité, 1,5 μL de cDNA (préparé à l’étape 5), et de l’eau ultrapure à un volume final de 50 μL.</li>
		<li>Utilisez un thermocycleur réglé dans les conditions suivantes pour l’amplification : 94 °C pendant 1 min; 4 cycles de 94 °C pendant 1 min, 40 °C pendant 1 min et 72 °C pendant 2 min; 35 cycles de 94 °C pendant 1 min, 60 °C pendant 1 min et 72 °C pendant 2 min; extension finale de 72 °C pendant 2 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour utiliser le produit PCR comme modèle pour la synthèse in vitro et pour supprimer les composants de la réaction enzymatique de l’étape 6.1.2, purifiez le produit PCR à l’aide d’un kit concentrateur à colonne selon les instructions du fabricant, puis quantifier à l’aide d’un spectrophotomètre.</li>
	<li>Pour la synthèse de l’ARN, utilisez une trousse de transcription in vitro avec le mélange de réaction suivant : 5 μL T7 Transcription 5x tampon, 1,9 μL de chaque nucléotide triphosphate, 10 μg d’ADN RABV N VP2 purifié et 2,5 μL de l’enzyme du mélange. Ensuite, incuber le mélange à 37 °C pendant 4 h. Ajouter ensuite 1 μL de 1 U/μg de DNase sans RNase au mélange de réaction et incuber pendant 15 min à 37 °C pour éliminer la contamination par l’ADN.</li>
	<li>Purifier l’ARN transcrit in vitro, puis le concentrer à l’aide de phénol: chloroforme: alcool isoamyle (25:24:1).</li>
	<li>Resuspendez la pastille d’ARN purifiée en tampon 70 μL de TE, puis stockez à -80 °C jusqu’à utilisation.</li>
	<li>Répétez le protocole PCR de l’étape 6.1 jusqu’à ce qu’environ 5 μg de produit PCR soient obtenus. Après purification et concentration, l’ARNm transcrit in vitro du gène N sera présent à une concentration de 4,711 μg/μL.</li>
	<li>Confirmer que l’ARNm transcrit in vitro correspond au gène N suivant l’étape 5 de ce protocole et l’utiliser comme un contrôle positif pour la réaction en chaîne de polymésexe de transcription inverse en temps réel (qRT-PCR).</li>
</ol>7. Réaction en chaîne de polymése de transcription inverse en temps réel (qRT-PCR)
<ol><li>Pour qRT-PCR, utilisez une transcription in vitro de l’ARNm codant le gène N complet comme un contrôle positif avec un kit commercial qRT-PCR en une étape à l’aide de sondes d’hybridation selon les instructions du fabricant. Utilisez la sonde et les amorces décrites par Carneiro et coll. (2010)23 pour détecter une région conservée du gène RABV N (BRDesrot-Rev: 5′ aaactcaagagaaggccaacca 3′, BRDesrot-Fwd: 5′ cgtactgatgtggaagggaattg 3′, et BRDesrot-Probe: 5′-FAM-acaagggaccctactgtttcagagcatgc-3′-BHQ).</li>
	<li>Utilisez les conditions de cycle thermique suivantes : 1 cycle de 50 °C pendant 10 min et 95 °C pendant 2 min; 40 cycles de 95 °C pour 15 s et 50 °C pour 30 s.</li>
</ol>8. Courbe d’étalonnage ou courbe standard
<ol><li>Effectuer des dilutions périodiques de l’ARNm transcrit in vitro en pipetant périodiquement 1 μg/μL d’ARNm dans des tubes jusqu’à ce que six dilutions decuple soient obtenues. Préparez des tubes à un volume de 100 μL en triplicate pour une utilisation dans la création de la courbe standard. Effectuez qRT-PCR tel que décrit à l’étape 7.</li>
	<li>Effectuez qRT-PCR dans un thermocycler avec un rotor en traitant les différents échantillons de cerveau simultanément avec les réactions courantes pour créer la courbe standard et en utilisant des contrôles positifs, des contrôles négatifs et des supernatants isolés de la culture cellulaire.</li>
	<li>Pour évaluer la limite de détection, d’efficacité des tests et de sensibilité du test, utilisez une courbe standard en triplicate dans les mêmes conditions.</li>
</ol>9. qRT-PCR d’échantillons biologiques
<ol><li>Pour la détection du gène RABV N, utilisez l’ARN à partir d’échantillons sur le terrain, de contrôles positifs, de contrôles négatifs et de supernatants de culture cellulaire pour effectuer qRT-PCR à l’aide du kit PCR décrit à l’étape 7.</li>
	<li>Pour déterminer le nombre de copies du génome rabv présentes dans les échantillons de cerveau bovin, obtenir des données Ct à partir de la courbe standard et des échantillons biologiques et de ceux interpolés à partir de l’équation de la courbe d’étalonnage.</li>
</ol>

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<li>Finke, S., Cox, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+transcription+attenuation+of+rabies+virus+genes+by+intergenic+regions%3A+generation+of+recombinant+viruses+overexpressing+the+polymerase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Differential transcription attenuation of rabies virus genes by intergenic regions: generation of recombinant viruses overexpressing the polymerase gene.</a> Journal of Virology. 74 (16), 7261-7269 (2000).</li>
<li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFooks%2C+AR+%22Rabies%22">Rabies</a>. 3, Macmillan Publishing Limited. 1-18 (2017).</li>
<li>Bingham, J., Van Der, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+rabies+antigen+in+infected+brain+material%3A+determining+the+reliability+of+different+regions+of+the+brain+for+the+rabies+fluorescent+antibody+test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test.</a> Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Des études antérieures ont montré que le DFA ne peut détecter rabv que dans les sept jours suivant le stock de l’échantillon à température ambiante (21 °C)14. En revanche, ces travaux ont démontré que la sensibilité de RT-PCR commence à diminuer après que les échantillons ont été exposés à la température ambiante pendant 12 jours. Par conséquent, le génome rabv peut être détecté par qRT-PCR dans les échantillons exposés à la température ambiante pendant un jusqu’à 23 jours. Cela démontre que la se...

La rage peut être confirmée ante mortem et post mortem par diverses techniques qui permettent la détection d’acides nucléiques viraux dans le cerveau, la peau, l’urine ou la salive1. La détection du gène de nucléoprotéine de virus de rage(N)est principalement employée pour le diagnostic de rage par des essais moléculaires. Ce gène est également utilisé pour le génotypage viral. La rage peut être diagnostiquée chez les animaux en utilisant n’importe quelle partie du cerveau affecté; toutefois, pour exclure la possibilité de la rage, les tissus d’au moins deux régions du cerveau doivent être testés2. Plusieurs méthodes diagnostiques existent pour la détection de la rage chez les animaux; cependant, le test d’immunofluorescence directe reste la technique de référence standard3. D’autres essais incluent des essais biologiques qui incorporent l’inoculation de souris, l’infection dans la culture de tissu, et la réaction en chaîne de polymése (PCR)4. Toutes ces techniques sont recommandées par l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) et l’Organisation mondiale de la santé animale (OIE) pour le diagnostic de la rage chez l’homme et l’animal,respectivement 5.
Les techniques de détection et d’amplification de l’acide nucléique ont révolutionné le diagnostic de larage au cours des dernières années 6 et ces techniques jouent un rôle important dans le diagnostic ante mortem de la rage humaine. Plusieurs tests basés sur pcr ont été évalués pour compléter les tests conventionnels pour les diagnostics anti mortem et post mortem de rage 7,8,9,10. La plupart des analyses ciblent le gène viral de nucléoprotéine de rage pour l’amplification qui est la région la plus fortement conservée dans le génome viral1,11. Au cours des 20 dernières années, divers tests moléculaires ont été développés pour diagnostiquer rabv, et certains de ces tests ont été utilisés pour la caractérisation du virus. La plupart des essais ont pour but de détecter les gènes conservés dans le génome viral, le plus souvent en utilisant des analyses conventionnelles ou quantitatives en temps réel de la chaîne de polymése (qRT-PCR)12,13.
Pcr est une technique de diagnostic très sensible qui peut détecter le génome d’un agent pathogène donné dans les tissus, même lorsque ces tissus sont décomposés. À l’aide d’approches basées sur la PCR, des quantités minimales d’un agent infectieux peuvent être détectées dans un échantillon clinique par l’amplification sélective et répétitive d’une séquence de nucléotidesd’ADN 14. qRT-PCR qui incorpore des sondes fluorescentes (p. ex., TaqMan) ou des colorants liant l’ADN (p. ex., SYBR Green) a été utilisé dans des essais pour diagnostiquer rabv ante- et post- mortem avec une sensibilité élevée; toutefois, une telle approche nécessite un équipement spécialisé. Pour surmonter cette limitation, l’amplification isothermale à médie en boucle de transcription inverse (RT-LAMP) a été suggérée, basée sur son faible coût, sa simplicité et ses caractéristiques souhaitables pour la détection du RABV. Cet essai est particulièrement important car il peut être utilisé dans les pays en développement15.
qRT-PCR est basé sur la détection et la quantification d’une molécule, où les augmentations de signal fluorescent sont en proportion directe de la quantité de produit PCR en une seule réaction. À mesure que le nombre de copies de la cible de l’acide nucléique augmente, la fluorescence augmente également. Les colorants intercalaires non spécifiques tels que le colorant liant l’ADN SYBR Green ou les sondes oligonucléotides spécifiques à la séquence transportant un fluorophore et un quencher sont couramment utilisés pour fournir la lecture fluorescente dans qRT-PCR. Cet essai offre des avantages par rapport au RT-PCR conventionnel qui incluent un temps d’essai plus court (2-4 h), un risque réduit de contamination dû au système de tube fermé (absence de manipulation post-PCR des produits amplifiés), et la capacité de détecter différentes cibles simultanément16. qRT-PCR peut être utilisé pour diagnostiquer l’anti mortem de la rage à partir de salive et d’autres échantillons. Cet essai peut également être utilisé comme un test universel en temps réel pour la détection de différentes espèces de Lyssavirus ou lignées de RABV15. Dans cette approche RT-PCR combo, deux réactions sont utilisées. Le premier détecte différents linages génétiques du RABV, et le second détecte les espèces de Lyssavirus. Les deux étapes impliquent des analyses qRT-PCR, où la première utilise des sondes d’hybridation et la seconde utilise des dyes15. En raison du grand nombre de tests qui ont démontré la détection moléculaire réussie du RABV à l’aide de cette technique, l’actuel Manuel terrestre de l’OIE (2018) recommande l’utilisation du PCR pour la détection moléculaire du RABV17.
Le Mexique est un pays avec un potentiel d’élevage considérable. Les États où la production animale est la plus élevée contiennent à la fois des régions tropicales humides et des régions sèches à risque d’épidémies de rage en raison de la présence de la chauve-souris vampire Desmodus rotundus, principal émetteur de la rage. Il est donc essentiel de développer davantage d’outils de prévention et de lutte contre la rage paralytique bovine (BPR) au Mexique. Sur cette base, l’objectif de cette étude était d’utiliser qRT-PCR quantitative pour déterminer le nombre de particules virales dans différentes structures anatomiques du cerveau bovin après la mort due à l’infection par la rage.
Six cerveaux obtenus à partir de bovins positifs au RABV ont été donnés par un laboratoire externe pour l’utilisation dans le développement du protocole qRT-PCR décrit ci-dessous. Les échantillons de structure cérébrale bovine ont été transportés à la chaîne froide au laboratoire BSL-2 du laboratoire DE LNE-MA de l’INIFAP et stockés à -80 °C jusqu’à utilisation. Des cerveaux ont été obtenus des animaux des États de Campeche, Yucatán, et Querétaro. Avant la réception, diverses structures ont été disséquées du cerveau. Ces structures comprenaient la corne de l’Ammon, le cervelet, le cortex, la médulle, les pons et le thalamus18,19. Le matériel génétique a été extrait tel que décrit ci-dessous. Le diagnostic rabv a été confirmé utilisant les anticorps fluorescents directs (DFA)20. Comme un contrôle positif, cerveaux de souris qui ont été inoculés avec RABV21 ont été utilisés. En outre, quatre cerveaux de bovins négatifs au RABV (déterminés par le DFA) ont été utilisés comme témoins négatifs.

<table><tbody><tr><td>Chloroforme</td><td>SIGMA</td><td>C7559</td><td>Facilite la récupération de la phase aqueuse des PCR qui ont été recouvertes d’huile minérale.</td></tr><tr><td>ADN propre & Concentrateur-500</td><td>Zimo</td><td>D4031</td><td>L’ADN Clean & Le Concentrator-500 (DCC-500) est conçu pour la purification et la concentration rapides de grands formats allant jusqu’à 500 & micro ; g d’ADN de haute qualité à partir d’échantillons, y compris des digestions d’endonucléases de restriction à grande échelle et des préparations d’ADN impur.</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Amresco</td><td>193-500</td><td>Purification des acides nucléiques</td></tr><tr><td>Kit système PCR haute fidélité FastStart, dNTPack</td><td>Roche</td><td>3553400001</td><td>Enzyme haute fidélité pour l’amplification des produits PCR évitant les changements de base aléatoires</td></tr><tr><td>GelDoc XR</td><td>BioRad</td><td>XR+</td><td>Analyse les gels de protéines et d’ADN plus grands GelRed</td></tr><tr><td></td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Une nouvelle génération de colorants de gel d’acide nucléique, ils possèdent de nouvelles caractéristiques chimiques conçues pour minimiser le risque que les colorants interagissent avec les acides nucléiques dans les cellules vivantes.</td></tr><tr><td>iCycler Thermal Cycler Gradient</td><td>BioRad</td><td>582BR</td><td>La température peut être surveillée et contrôlée par un algorithme d’instrument, une sonde dans l’échantillon ou des modes de bloc d’échantillon</td></tr><tr><td>Sondes universelles iTaq Kit en une étape BioRad</td><td></td><td>1725141</td><td>Mélange réactionnel pour effectuer des réactions PCR en temps réel à l’aide de sondes d’hybridation de type TaqMan</td></tr><tr><td>Alcool isopropylique</td><td>Amresco</td><td>0918-500</td><td>Précipitation des acides nucléiques</td></tr><tr><td>QIAquick kit d’extraction de gel</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>Les kits QIAquick contiennent une membrane de silice pour la liaison de l’ADN dans un tampon à haute teneur en sel et l’élution avec un tampon à faible teneur en sel ou de l’eau. La procédure de purification élimine les amorces, les nucléotides, les enzymes, l’huile minérale, les sels, l’agarose, le bromure d’éthidium et d’autres impuretés des échantillons d’ADN</td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>28025-021</td><td>Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) utilise de l’ARN ou de l’ADN simple brin ou de l’ADN en présence d’une amorce pour synthétiser un brin d’ADN complémentaire .</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo-Scientific</td><td>ND2000</td><td>Spectrophotomètre à microvolume</td></tr><tr><td>Amorce Oligo(dT)18</td><td>Invitrogen</td><td>SO132</td><td>L’amorce oligonucléotide (dT)18 est un oligonucléotide 18-mère monocaténaire synthétique avec des extrémités 5'- et 3'-hydroxyle.</td></tr><tr><td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 et T7</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td>Les réactions de transcription in vitro sont utilisées pour synthétiser des quantités de microgrammes de sondes d’ARN à partir de matrices d’ADN recombinant. La plupart des réactions de transcription conçues pour générer des sondes d’ARN sont optimisées pour maximiser l’incorporation de ribonucléotides radiomarqués plutôt que pour produire de grandes quantités d’ARN</td></tr><tr><td>Taq ADN polymérase</td><td>Invitrogen</td> <td>#EP0402</td><td>L’ADN polymérase Taq est une ADN polymérase hautement thermostable de la bactérie thermophile Thermus aquaticus. L’enzyme catalyse 5' et 3' synthèse de l’ADN </td></tr><tr><td></td><td>Le réactif TRIzo</td><td>15596026</td><td>l est un réactif complet, prêt à l’emploi, conçu pour l’isolement d’ARN total de haute qualité ou l’isolement simultané d’ARN, d’ADN et de protéines à partir d’une variété d’échantillons biologiques.</td></tr></tbody></table>

quantitation du virus de la rage dans diverses structures cérébrales bovines

Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures

La rage paralytique bovine (BPR) est une forme d’encéphalite virale d’une importance économique importante dans toute l’Amérique latine, où elle présente un risque zoonotique majeur. Ici, notre objectif était d’utiliser un protocole de laboratoire pour déterminer le nombre relatif de copies du génome du virus de la rage (RABV) dans différentes structures anatomiques du cerveau bovin à l’aide de la réaction quantitative en temps réel de la chaîne de polymérase de transcription inverse (qRT-PCR). qRT-PCR quantifie le nombre spécifique de copies génétiques présentes dans un échantillon à partir de la fluorescence émise après amplification qui est directement proportionnelle à la quantité d’acide nucléique cible présent dans l’échantillon. Cette méthode est avantageuse en raison de sa courte durée, de son risque réduit de contamination et du potentiel de détection plus facile des acides nucléiques viraux dans différents échantillons par rapport à d’autres techniques. Le cerveau de six animaux enragés a été divisé en six structures anatomiques, à savoir la corne d’Ammon, le cervelet, le cortex, la médulle, les pons et le thalamus. Tous les cerveaux ont été identifiés comme positifs pour des antigènes rabv basés sur un essai direct d’immunofluorescence. Les mêmes structures anatomiques du cerveau de quatre bovins négatifs au RABV ont également été évaluées. L’ARN a été extrait de chaque structure et utilisé pour qRT-PCR. Un essai a été effectué pour déterminer les numéros de copie des gènes RABV à l’aide d’un gène nucléoprotéine transcrit in vitro. La courbe standard utilisée pour quantifier l’ARN viral présentait une efficacité de 100 % et une linéarité de 0,99%. L’analyse a indiqué que le cortex, la médulle, et le thalamus étaient les portions idéales de CNS pour l’usage dans la détection de RABV, basé sur l’observation que ces structures ont possédé les niveaux les plus élevés de RABV. La spécificité du test était à 100%. Tous les échantillons étaient positifs, aucun faux positif n’a été détecté. Cette méthode peut être utilisée pour détecter rabv dans les échantillons qui contiennent de faibles niveaux de RABV lors du diagnostic de BPR.

Les résultats de DFA ont montré 100%, 100%, 83.3%, 66%, et 50% positivité pour RABV dans le cortex, thalamus, medulla, pons, et corne, respectivement. Ces résultats ont confirmé les résultats précédents, et au moins trois des structures disséquées de chaque cerveau étaient positives pour RABV. Une coloration positive représentative du DAF est indiquée dans la figure 1.
La figure 2 montre l’amplification d’un fragment du gène RABV N (é...

Ce protocole présente une approche basée sur qRT-PCR pour déterminer le numéro de copie de gène de nucléoprotéine de virus de rage (N) dans diverses structures anatomiques de cerveau bovin utilisant la transcription in vitro.

Quantitation du virus de la rage dans diverses structures cérébrales bovines

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major ...

Quantitation du virus de la rage dans diverses structures cérébrales bovines. Le Mexique est un pays avec un potentiel d’élevage considérable. Les États où l’élevage est le plus élevé contiennent à la fois des régions tropicales humides et des régions sèches à risque d’épidémies de rage en raison de la présence de la chauve-souris vampire, Desmodus rotundus, principal émetteur de la rage.La détection du gène N de nucléoprotéine de virus de rage est principalement employée pour le diagnostic de rage par des essais moléculaires. À l’aide d’approches basées sur la PCR, des quantités minimales d’un agent infectieux peuvent être détectées dans un échantillon clinique par l’amplification sélective et répétitive d’une séquence de nucléotides d’ADN. qRT-PCR est basé sur la détection et la quantification d’une molécule où les augmentations de signal de fluorescence sont en proportion directe de la quantité de produit PCR en une seule réaction.À mesure que le nombre de copies de la cible de l’acide nucléique augmente, la fluorescence augmente également. Sur cette base, l’objectif de l’étude était d’utiliser qRT-PCR quantitative pour déterminer le nombre de particules virales dans différentes structures anatomiques du cerveau bovin, après la mort, en raison de l’infection à la rage. L’ARN total a été extrait directement des cerveaux bovins à l’aide d’une méthode d’extraction organique selon le protocole suivant.Utilisez 100 milligrammes de tissu cérébral de chaque structure anatomique pour extraire l’ARN total à l’aide d’un réaccélérable disponible dans le commerce contenant de l’isothiocyanate de guanidinium. Homogénéiser manuellement un total de 100 milligrammes de tissu de chaque structure en un millilitre du réagent d’isothiocyanate de guanidinium par vortexing à l’aide d’un homogénéisateur Dounce avec un petit pilon à l’intérieur du microtube pendant 15 secondes à la vitesse maximale. Incuber les échantillons sur la glace pendant cinq minutes, puis ajouter 200 microlitres de chloroforme.Mélanger vigoureusement les échantillons pendant 15 secondes. Incuber sur la glace pendant deux à trois minutes, puis centrifuger à 12 000 x g pendant 15 minutes à quatre degrés centigrades. Transférer la phase aqueuse dans un tube propre et ajouter 500 microlitres d’alcool isopropylique.Incuber les échantillons pendant 15 minutes à 21 degrés centigrades. Centrifugeuse les échantillons à 12 000 x g pendant 10 minutes à 4 degrés centigrades. Aspirer le supernatant aqueux par pipetting.L’ARN isolé sera présent comme granulé dans le tube. Ensuite, lavez la pastille d’ARN avec un millilitre de 75% d’éthanol par pipetting et centrifugeuse à 7500 x g pendant cinq minutes à quatre degrés centigrades. Décanter le supernatant et sécher à l’air le granulé d’ARN à température ambiante, 21 degrés centigrades.Ensuite, diluer la pastille dans 50 microlitres d’eau sans nucléase. Déterminer la concentration et la qualité de l’ARN à 260 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre. La transcription in vitro génère l’ARNm d’un gène cible.Utilisez une paire d’amorce qui amplifie le gène RABV N complet, et qui est utilisé comme un contrôle positif pour l’analyse qRT-PCR. Ces amorces sont conçues pour amplifier le gène RABV N complet, et pour ajouter un promoteur qui reconnaît la polymése T7. Pour amplifier l’ensemble du gène N RABV, utilisez les amorces trans et RAB vers l’avant et vers l’arrière, ainsi qu’un kit PCR haute fidélité.Pour chaque réaction, préparez un mélange principal PCR en ajoutant à un tampon de réaction propre de tube PCR avec 10 micromolaire de chaque amorce et 0,5 unité de polymése haute fidélité. Pour utiliser le produit PCR comme modèle pour la synthèse in vitro et pour supprimer les composants de la réaction enzymatique, purifiez le produit PCR à l’aide d’un kit concentrateur basé sur la colonne, selon les instructions du fabricant. Et puis quantifier à l’aide d’un spectrophotomètre.Pour la synthèse de l’ARN, utilisez une trousse de transcription in vitro avec le mélange de réaction suivant : cinq microlitres T7 transcription 5X tampon, 1,9 microlitres de chaque nucléotide triphosphate, 10 microgrammes d’ADN RABV N purifié, et 2,5 microlitres du mélange enzymatique. Ensuite, incuber le mélange à 37 degrés centigrades pendant quatre heures. Ensuite, ajouter un microlitre d’une unité par microgramme Rnase-Free DNase au mélange de réaction et incuber pendant 15 minutes à 37 degrés centigrades pour éliminer la contamination par l’ADN.Purifier l’ARN transcrit in vitro, puis le concentrer à l’aide de phénol: chloroforme: alcool isoamyle à un rapport de 25:24:1. Resuspendez la pastille d’ARN purifiée en 70 microlitres de tampon TE, puis conservez-la à 80 degrés centigrades jusqu’à utilisation. Répétez le protocole PCR jusqu’à ce qu’environ cinq microgrammes de produit PCR soient obtenus.Après purification et concentration, l’ARNm transcrit in vitro du gène N sera présent à une concentration de 4.711 microgrammes par microlitre. Confirmez que l’ARNm transcrit in vitro correspond au gène N suivant l’étape cinq de ce protocole, et utilisez-le comme un contrôle positif pour la réaction en chaîne de polymésexe de transcription inverse en temps réel, qRT-PCR. Pour une réaction en chaîne de polymése de transcription inverse en temps réel, utilisez une transcription in vitro de l’ARNm pour coder le gène N complet comme un contrôle positif.Avec un kit commercial qRT-PCR en une étape, utilisant des sondes d’hybridation selon les instructions du fabricant. Utilisez la sonde dans les amorces décrites par Coronado et son collègue 2010 pour détecter une région conservée du RABV en utilisant les conditions de cycle thermique suivantes. Effectuer des dilutions périodiques de l’ARNm transcrit in vitro en pipetant périodiquement un microgramme par microlitre d’ARNm en tubes jusqu’à ce que six dilutions découplées soient obtenues.Préparez des tubes à un volume de 100 microlitres en triplicate pour une utilisation dans la création de la courbe standard. Effectuez qRT-PCR comme décrit précédemment. Effectuez qRT-PCR dans un cycleur thermique avec un rotor en traitant les différents échantillons de cerveau simultanément avec les réactions de fonctionnement pour créer une courbe standard et en utilisant des contrôles positifs, des contrôles négatifs et des supernatants isolés de la culture cellulaire.Pour évaluer la limite de détection, d’efficacité des tests et de sensibilité du test, utilisez une courbe standard en triplicate dans les mêmes conditions. Pour la détection du gène RABV N, utilisez l’ARN à partir d’échantillons sur le terrain, de contrôles positifs, de contrôles négatifs et de supernatants de culture cellulaire pour effectuer qRT-PCR à l’aide du kit PCR décrit précédemment. Pour déterminer le nombre de copies du génome rabv présent dans les échantillons de cerveau bovin, obtenir des données de CT à partir de la courbe standard et des échantillons biologiques, et de ceux interpolés à partir de l’équation de courbe d’étalonnage Ce chiffre montre les tissus cérébraux bovins présentant une coloration positive en fonction de l’immunofluorescence directe.Les résultats montrent 100%100%83.3%66%et 50%positivité pour RABV dans le cortex, thalamus, medulla, pons, et corne respectivement. Ces résultats confirment les résultats précédents, et au moins trois des structures disséquées de chaque cerveau étaient positives pour RABV. D’autre part, l’équation de la courbe standard montre la relation entre la quantité de contenu génétique RABV dans l’échantillon et la taille du fragment amplifié par pcr.La quantité de contenu génétique RABV dans les nanogrammes a été déduite par interpolation des valeurs de CT dans la courbe d’étalonnage en utilisant l’équation présentée dans ce chiffre. À l’aide de cette équation, la limite de détection d’une fois 10 à la cinquième microgramme par microlitre d’ARN viral correspondait à 36 copies du génome du RABV. Ces résultats démontrent que l’analyse est sensible et peut être utilisée pour détecter le virus dans des échantillons qui contiennent un faible nombre de copies du gène RABV N.L’efficacité de l’essai a été calculée à l’aide de la pente de la courbe standard, qui était de 3,28. Les échantillons utilisés pour qRT-PCR ont montré l’amplification du gène RABV N. Pour déterminer le nombre de copies virales présentes, les valeurs de CT pour chaque échantillon ont été interpolées à l’aide de l’équation de la courbe d’étalonnage.Les résultats obtenus en nanogrammes ont été substitués à la formule décrite ici. Ce tableau montre les résultats comparatifs entre qRT-PCR et DFA. Les résultats des analyses qRT-PCR étaient compatibles avec ceux obtenus à l’aide de DFA.Selon les résultats obtenus dans le test qRT-PCR dans les cas C et D, le thalamus est la structure qui possède le plus grand nombre de copies du gène RABV N. Ceci suggère que l’infection tôt des neurones hypothalamic et thalamic soit importante dans le développement de la maladie, étant donné que ces neurones contrôlent les fonctions végétatives d’un animal. Les numéros de copie du gène RABV N qui ont été détectés dans chaque structure de chaque échantillon sont: la sensibilité et la spécificité du test qRT-PCR, nous sommes tous deux à 100%, car tous les échantillons étaient positifs.Ce résultat est compatible avec les diagnostics initiaux des échantillons. qRT-PCR est une technique très sensible. Certaines des étapes sont essentielles pour obtenir les meilleurs résultats.L’un d’eux est la manipulation appropriée des échantillons pour l’extraction de l’ARN. Cette étape est cruciale car l’ARN est facilement dégradé et les résultats pourraient donc être affectés. Envisagez de maintenir l’échantillon dans des conditions froides, environ quatre degrés centigrades pendant le processus.En outre, considérez que plusieurs séries d’application de PCR sont effectuées comme mentionné dans la transcription in vitro. L’analyse qRT-PCR menée dans cette étude pourrait détecter aussi peu que 36,3 copies du gène RABV N par milligramme de tissu. Les structures cérébrales les plus appropriées pour qRT-PCR comprenaient le cortex et le thalamus.Ceci est basé sur les observations selon laquelle des concentrations plus élevées du gène RABV N ont été détectées dans ces structures, et qu’elles se sont également révélés positives à l’aide du test de référence RABV. Le test a été en mesure de détecter des concentrations très faibles, 0,00023 fois 10 à la neuvième copie du virus dans divers échantillons. En plus de quantifier les particules virales dans l’échantillon, le test semble fournir un bon outil alternatif de diagnostic et de recherche pour la détection du RABV présenté ici.

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Le test immunohistochimique rapide direct (DRIT) offre une alternative reconnue par l'Organisation mondiale de la santé animale et de l'Organisation mondiale de la santé (OIE/OMS) au test direct d'anticorps fluorescents (DFA) pour le diagnostic de la rage. Ce test permet des applications sur le terrain qui peuvent être effectuées en environ 1 h sur les impressions cérébrales à l'aide de la microscopie légère.

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L'objectif de ce protocole est de démontrer des techniques d'autopsie sûres chez les petits et grands animaux afin d'obtenir des échantillons de tissus satisfaisants pour les tests de dépistage de la rage.

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Nous présentons un protocole complet pour le diagnostic post mortem de la rage animale dans des conditions de terrain utilisant un essai immunochromagraphic rapide de diagnostic (RIDT), de l’échantillonnage de biopsie de cerveau à l’interprétation finale. Nous décrivons également d’autres applications utilisant le dispositif pour l’analyse moléculaire et le génotypage viral.

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Nous présentons ici un protocole de test d’immunohistochimie pour la détection de l’antigène du virus de la rage en tant que test de diagnostic alternatif pour les tissus fixés au for formel.

Test d’immunohistochimie pour la détection de l’antigène du lyssavirus à partir de tissus fixés au for formel

Nous présentons ici un flux de travail rapide et rentable pour caractériser les génomes du virus de la rage (RABV) à l’aide de la technologie nanopore. Le flux de travail vise à soutenir la surveillance fondée sur la génomique à l’échelle locale, en fournissant des informations sur les lignées de RABV en circulation et leur placement dans les phylogénies régionales afin d’orienter les mesures de lutte contre la rage.

Séquençage du génome entier pour la caractérisation rapide du virus de la rage à l’aide de la technologie des nanopores

Ce protocole fait la démonstration de l’essai RT-PCR (transcription inverse en chaîne par polymérase en temps réel du pan-lyssavirus LN34), de la collecte de tissus à l’interprétation des résultats, y compris les mises à jour des séquences d’amorces et des formulations afin d’améliorer les performances des tests pour certains lyssavirus et lagomorphes non enragés. Nous démontrons également la configuration de l’essai pour un format LN34 multiplexé à puits unique (LN34M).

Diagnostic post-mortem de la rage chez les animaux par le test actualisé et multiplexé LN34 Real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

Apprenez la quantification du virus de la rage par qRT-PCR dans les structures cérébrales bovines. Cette méthode sensible détecte le gène N du virus pour améliorer le diagnostic et la recherche en virologie animale.

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