Name: Imagerie super-résolution pour étudier la co-localisation des protéines et des marqueurs synaptiques dans les neurones primaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Découvrez la microscopie SIM pour étudier la co-localisation protéique dans les neurones primaires de souris. Cette méthode permet d'atteindre une résolution de 100 nanomètres pour analyser les interactions synaptiques.

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Les auteurs tiennent à remercier Edoardo Micotti pour la critique constructive du manuscrit. Cette étude a été soutenue par BrightFocus A2019296F, par Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), par Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) et par le Sk’odowska-Curie Innovative Training Network (JK).

1. Cultures primaires
<ol><li>Les neurones primaires hippocampaux de souris de culture dans les couvertures chambrées (telles que Ibidi μ-Slide 8 Well ou Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) qui correspondent à l’exigence objective pour #1,5 (0,17 mm) couvrent l’épaisseur.</li>
	<li>Pelage de couvercles en chambre avec 100 μL de poly-L-lysine (100 μg/mL).</li>
	<li>Le lendemain, lavez deux fois les couvercles chambrelés à l’une de la solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Pour obtenir des neurones primaires de souris, isoler hippocampi des chiots P1-P423.</li>
	<li>Placez les hippocampes disséqués dans 10 ml de Dissection Media (Tableau 1) et laissez-les déposer au fond du tube.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette stérile, retirez soigneusement le support de dissection, laissant l’hippocampe intact au fond du tube.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de Media 1 (Tableau 1) à l’hippocampe et incuber pendant 30 minutes à 37 °C.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette stérile, retirez soigneusement le média 1, laissant l’hippocampe intact au fond du tube.</li>
	<li>Ajouter 10 ml de media 2 (tableau 1) et laisser le tube de centrifugeuse (plafonné) sous le capot horizontalement pendant 45 minutes.</li>
	<li>Laissez le tube de centrifugeuse reposer verticalement pour permettre au tissu de s’installer au fond du tube.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette stérile, retirez soigneusement le média 2, laissant l’hippocampe intact au fond du tube de centrifugeuse.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de Media 3 (Tableau 1).</li>
	<li>À l’aide d’une pipette p1000 à pointe filtrée, dissocier mécaniquement les cellules du tissu.</li>
	<li>Transférer le supernatant, dans lequel se trouvent les neurones isolés, dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugez la suspension cellulaire pendant 2 min à 300 x g à température ambiante (RT).</li>
	<li>Après la centrifugeuse, les cellules sont situées au fond du tube de centrifugeuse. À l’aide d’une pipette stérile jeter le supernatant.</li>
	<li>Resuspender les cellules dans 1 mL de Media 4.</li>
	<li>Utilisez un filtre de 70 μm pour éliminer les cellules non dissociées.</li>
	<li>Compter les cellules viables dans une chambre Bürker en ajoutant 1 μL de 0,4 % de solution bleue Trypan à 19 μL de la suspension cellulaire.</li>
	<li>Plaquez des cellules à 70 000 cellules/puits dans un volume de 200 μL par puits.</li>
	<li>Laisser les cellules s’attacher pendant 2 h dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2.</li>
	<li>Sortez les couvercles chambrelés de l’incubateur et remplacez soigneusement le support par 200 μL de Culture Media.</li>
	<li>Laissez les couvercles chambrelés dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5% CO2.</li>
	<li>Remplacez un tiers du milieu par des supports de culture frais tous les 5-7 jours.</li>
	<li>Attendez que les neurones primaires hippocampaux soient pleinement mûris (12-14 jours après le placage) pour effectuer des études de co-localisation.</li>
</ol>2. Coloration d’immunofluorescence
<ol><li>Prenez les couvertures chambred de l’incubateur.</li>
	<li>Retirer le milieu.</li>
	<li>Lavez rapidement les puits avec 200 μL de PBS.</li>
	<li>Ajouter 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans pbs (200 μL/puits) aux neurones pour les réparer rapidement.</li>
	<li>Incuber les cellules pendant 15 min à RT.</li>
	<li>Retirez la solution PFA.</li>
	<li>Permeabiliser les cellules en ajoutant PBS avec 0,2% Triton X-100 (200 μL/puits).</li>
	<li>Incuber pendant 1 min à RT.</li>
	<li>Retirer la solution et incuber les échantillons avec 1% d’albumine de sérum bovin (BSA) en PBS (200 μL/well) pendant 1 h à RT pour couvrir passivement toutes les surfaces de liaison libre de la plaque avec une protéine non pertinente pour l’analyse. Un tampon de blocage basé sur BSA sans Triton X-100 réduit le fond d’anticorps plus efficacement que le même tampon avec 0,2% Triton X-100.</li>
	<li>Retirez la solution.</li>
	<li>Ajouter l’anticorps primaire de choix dilué dans une solution PBS contenant 1% de BSA et 0,2% de Triton X-100 (120-200 μL/puits, selon la dilution et la disponibilité des anticorps). Incuber les échantillons pendant 2 h.<ol>
<li>En tant que contrôle négatif, n’ajoutez aucun anticorps primaire à l’un des puits. Plusieurs anticorps de différentes espèces contre différentes cibles peuvent être utilisés en même temps. Utilisez un anticorps contre le MAP2 (un marqueur neuronal) élevé dans le poulet, un anticorps contre le PSD95 ou la synaptophysine élevé dans la souris, et un anticorps contre une protéine cible élevée chez le lapin. Cela permet des analyses SIM tricolores.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laver rapidement les puits trois fois avec pbs (200 μL/puits).</li>
	<li>Ajouter des anticorps secondaires (dyLight et Alexa anticorps secondaires peuvent tous deux être utilisés) dilués dans une solution PBS contenant 1% BSA et 0,2% Triton X-100 (200 μL/bien). Incuber les échantillons pendant 1 h à RT.</li>
	<li>Laver rapidement les puits trois fois avec pbs (200 μL/puits).</li>
	<li>Ajouter le colorant Hoechst à une concentration de 1 μg/mL diluée en PBS (200 μL/puits) pour tacher les noyaux. Incuber les échantillons pendant 10 minutes à RT.</li>
	<li>Lavez rapidement les puits deux fois avec PBS.</li>
	<li>Montez des cellules à l’aide d’un supporteur compatible SIM. Utilisez 10 μL/puits de ProLong Glass Antifade Mountant.</li>
	<li>Couvrir et protéger les cellules à l’aide d’un verre à couverture (p. ex., un verre rond d’un diamètre de 8 mm). Les carrés peuvent également être utilisés.</li>
	<li>Stockez les couvercles en chambre à RT et attendez au moins 48 h avant d’acquérir des images. Diamond Glass nécessite au moins deux jours de séchage avant les acquisitions de super-résolution.</li>
</ol>3. Contrôle de la spécificité des anticorps
REMARQUE : Utilisez deux stratégies pour assurer la spécificité des anticorps. La première stratégie consiste à utiliser au moins deux anticorps différents ciblant le même substrat. La deuxième stratégie est la neutralisation des anticorps par incubation avec la cible protéique purifiée ou l’épitope utilisé pour élever l’anticorps.
<ol><li>Incuber l’anticorps de choix avec cinq fois plus de la cible recombinante ou épitope pendant 1 h à RT dans 1% BSA dans PBS.</li>
	<li>Après l’incubation, utilisez l’anticorps neutralisé à la concentration habituelle pour la coloration comme décrit ci-dessus à partir de 2,11.</li>
</ol>4. Étalonnage du microscope
REMARQUE : Nous utilisons régulièrement un système de microscope à super résolution N-SIM fabriqué par Nikon pour les études de super-résolution. Cependant, plusieurs autres entreprises offrent également des microscopes super-résolution dans leurs catalogues. Bien que des indications spécifiques pour le système N-SIM de Nikon soient décrites, les instructions qui suivent peuvent être généralisées à d’autres systèmes. Avant l’acquisition d’images SIM, le système nécessite un étalonnage approprié avec des perles fluorescentes de taille de sous-résolution spécifiques. Un exemple est les microsphères TetraSpeck. Ces perles sont tachées de différents colorants fluorescents pour permettre l’étalonnage de différents lasers avec un seul échantillon.
<ol><li>Dans un bain d’eau sonicate autour de 1,8 x 108 microsphères fluorescentes pendant 10 minutes. Le système N-SIM de Nikon nécessite un échantillon de perles multicolores peu peuplé pour l’étalonnage. Cela pourrait différer pour d’autres systèmes qui nécessitent une couche dense unique de perles fluorescentes de taille sous-résolution. Ajuster le nombre de particules fluorescentes en conséquence.</li>
	<li>Diluer les microsphères fluorescentes 1:500 dans de l’eau double distillée.</li>
	<li>Soniment une deuxième fois pendant 10 minutes supplémentaires.</li>
	<li>Pipet 15 μL des perles diluées dans un puits d’un couvercle chambré.</li>
	<li>Laissez sécher la solution pendant 5 minutes à RT.</li>
	<li>Ajouter 10 μL de la solution de montage et placer une housse de 8 mm sur le dessus.</li>
	<li>Attendez au moins 48 heures pour permettre un traitement approprié.</li>
	<li>Allumez le microscope et les lasers.</li>
	<li>Laissez le système se réchauffer pour atteindre l’équilibre thermique de tous les composants du microscope. Le système de microscope super-résolution N-SIM nécessite au moins 3 heures.</li>
	<li>Sélectionnez l’objectif 100x.</li>
	<li>Démarrez l’étalonnage en alignant les lasers au centre du bloc de grille de diffraction. Dans le système N-SIM, un bouton micromètre et une caméra dédiée permettent de centrer les faisceaux lumineux vers la cible.</li>
	<li>Insérez le couvercle chambrelé dans le microscope pour la visualisation. Réglez le système sur l’épaisseur du couvercle en chambre en ajustant le collier de correction objectif. Le logiciel NIS, le logiciel propriétaire fourni avec les systèmes de microscope à super résolution N-SIM, a une fonction automatique pour réguler les colliers de correction.</li>
	<li>Ajuster la mise au point de bloc de grille pour chaque canal afin d’assurer l’éclairage structuré concentré sur l’échantillon. Le logiciel NIS fournit une fonction automatique pour cette tâche.</li>
	<li>Ensuite, acquérir des images brutes 3D-SIM des microsphères multicolores. Reconstruire les images brutes pour obtenir une image super-résolu à l’aide du logiciel microscope ou de la plate-forme logicielle open-source pour l’analyse des images biologiques ImageJ24 et le plugin fairSIM25.</li>
	<li>Calculer, pour chaque longueur d’onde séparée, la transformation Fourier de l’image super-résolue obtenue en 4.14. Si l’image transformée ne parvient pas à obtenir un modèle de fleur correct, redémarrez l’étalonnage à partir de 4.11 puisque la super-résolution n’a pas été réalisée.</li>
	<li>Dans l’image super-résolue, sélectionnez une seule microsphère et calculez son profil d’intensité pour chaque canal afin de mesurer la résolution obtenue. Il doit maintenant être proche de 100 nm ultérieurement.</li>
	<li>Ensuite, effectuer l’enregistrement des canaux en superposant une acquisition multicanal des microsphères. Le but est de coluler tous les signaux de canal ultérieurement et axialement. Cela permettra d’éliminer les aberrations chromatiques dues au désalignement des différents canaux et d’aider l’analyse de co-localisation.</li>
	<li>Confirmez la qualité de l’étalonnage à l’aide des fonctions « Étapes de phase d’illumination » et « Mise au point de modèle d’illumination » de SIMcheck26, une suite de plugins pour l’application open-source ImageJ. À cette fin, préparez un couvercle de chambre pour obtenir une couche unique dense de microsphères TetraSpeck et acquérir une image 3D-SIM de l’échantillon. Analyser l’image dans ImageJ et, si des aberrations sont détectées, redémarrez l’étalonnage du microscope à partir de l’étape 4.11.</li>
</ol>5. Acquisition
<ol><li>Commencez à analyser l’échantillon à l’aide d’un objectif 40x en mode confocal ou widefield. Cela permet la navigation à l’échantillon, en maintenant de bons détails et un grand champ de vision.</li>
	<li>Utilisez le signal d’anticorps MAP2 pour identifier une zone représentant les processus neuronaux.</li>
	<li>Acquérir des images de l’échantillon en mode confocal pour déterminer la qualité de la coloration. Une mauvaise qualité confocale se reflétera dans la mauvaise qualité de LA CARTE SIM, ce qui nécessite que les échantillons soient jetés.</li>
	<li>Si la surface et la qualité des images sont satisfaisantes, passez l’objectif à 100x.</li>
	<li>Appliquer de l’huile sur l’objectif 100x.</li>
	<li>Acquérir une image large ou confocale qui sera utilisée plus tard pour évaluer la qualité de l’image super-résolue (Figure 1A,B).</li>
	<li>Passez au mode 3D-SIM.</li>
	<li>À l’aide de fenêtres de dialogue pour définir des paramètres d’acquisition, sélectionnez le paramètre de profondeur de bit le plus élevé disponible pour maximiser les informations sur les couleurs. En règle générale, 16 bits est le choix standard. De plus, pour améliorer le rapport signal/bruit, sélectionnez une valeur basse fréquence pour l’acquisition, comme 1 MHz.</li>
	<li>À l’aide de fenêtres histogrammes, définissez la puissance des lasers pour obtenir une réponse linéaire du signal. Pour éviter la perte d’informations, limitez les pixels saturés dans les images. Le système N-SIM utilise une caméra Andor iXon3. Lorsque vous travaillez à 16 bits, choisissez une intensité cible de 16 000 pour assurer la réponse linéaire de la caméra. Sinon, choisissez une fourchette comprise entre 30 000 et 45 000 pour maximiser la gamme dynamique de l’acquisition.</li>
	<li>Réglez la puissance laser entre 0,1 % et 50 % lors de l’imagerie des échantillons et les temps d’exposition entre 50 ms et 2 s. Les puissances laser supérieures à 50% peuvent causer le photobleaching rapide des fluorophores en usage.</li>
	<li>Commencez à acquérir les images en mode 3D-SIM.</li>
	<li>Utilisez SIMcheck, une suite de plugins gratuits pour ImageJ, pour évaluer la qualité de l’acquisition des images brutes.</li>
	<li>Si SIMCheck ne détecte pas d’artefacts ou de problèmes de qualité, obtenez un minimum de 10 images à partir de 4 répliques techniques pour permettre l’analyse statistique.</li>
</ol>6. Post-production : reconstruction d’images
REMARQUE : Les images acquises par 3D-SIM sont des images brutes qui doivent être traitées pour obtenir des images reconstruites super-résolues. Une reconstitution incorrecte d’images brutes peut mener à des artefacts qui affecteraient l’analyse des échantillons. Une grande attention devrait donc être accordée au choix dû des paramètres de reconstruction.
<ol><li>Traiter les images brutes à l’aide du logiciel d’analyse de reconstruction du microscope pour obtenir une image super-résolue (Figure 1C). Vous pouvez également utiliser le plugin fairSIM photoJ librement disponible pour reconstruire des images brutes.</li>
	<li>Calculez la transformation Fourier des images super-résolues à l’aide du logiciel de reconstruction du microscope ou du plugin SimCheck d’ImageJ. Une bonne image reconstruite doit rapporter, pour chaque canal, une image fleurie. Si les images reconstruites ne parviennent pas à recréer une forme de fleur, redémarrez à partir des images brutes et reconstruisez-les en modifiant les paramètres de reconstruction tels que le filtrage Wiener, l’apodisation et la suppression de l’ordre zéro27. Dans le logiciel NIS, en utilisant l’aperçu pour surveiller comment la modification des paramètres affecte l’image finale résolue, modifier les paramètres i) Contraste de modulation de l’éclairage, ii) Suppression du bruit à haute résolution et iii) Suppression hors mise au point.</li>
	<li>Ensuite, analyser l’image reconstruite pour détecter de manière impartiale les artefacts à l’aide de NanoJ-SQUIRREL28, un plugin basé sur ImageJ pour évaluer la qualité des images super-résolues.</li>
	<li>Si NanoJ-SQUIRREL détecte des artefacts, redémarrez à partir des images brutes et reconstruisez-les en modifiant les paramètres de reconstruction tels que le filtrage Wiener, l’apodisation et la suppression de l’ordre zéro. Dans le logiciel NIS, à l’aide de l’aperçu pour surveiller comment la modification des paramètres affecte l’image finale résolue, modifiez les paramètres Du contraste de modulation d’illumination, suppression du bruit à haute résolution et suppression de la mise au point.</li>
	<li>Utilisez les images super-résolues pour calculer le profil de co-localisation et/ou les coefficients de Pearson et Mander.</li>
</ol>7. Co-localisation avec analyse de profil
REMARQUE : Dans un premier temps pour étudier la co-localisation entre les marqueurs synaptiques et une protéine d’intérêt, prenez une image super-résolue et analysez un seul locus pour déterminer le chevauchement du signal.
<ol><li>Identifiez un seul locus sur l’image super-résolue.</li>
	<li>Obtenez les profils d’intensité des signaux fluorescents du lieu d’intérêt.</li>
	<li>Exporter les données.</li>
	<li>Utilisez GraphPad Prism, ou un logiciel d’analyse similaire, pour normaliser tous les pics de signal et obtenir des intensités de signal comparables pour chaque canal dans le but final de déterminer la co-localisation spécifique au locus.</li>
</ol>8. Quantification des coefficients de Pearson et Mander
REMARQUE : Si l’analyse de profil a suggéré une co-localisation de locus unique, une analyse plus générale de l’image entière peut être effectuée en calculant les coefficients de Pearson et de Mander29,30.
<ol><li>Utilisez JACoP31, un plug-in ImageJ, pour déterminer les deux paramètres de la co-localisation : Pearson et Mander’s.</li>
</ol>9. Analyse statistique
<ol><li>Utilisez GraphPad Prism, ou un logiciel d’analyse et de graphique similaire, pour traiter les données collectées avec JACoP.</li>
	<li>Utilisez au moins 40 images SIM pour chaque condition analysée pour obtenir des graphiques et pour la pertinence statistique.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à révéler.

L’élucidation de la structure et de la composition de la synapse est cruciale pour comprendre les processus physiologiques et pathologiques qui régulent la mémoire et la cognition. Alors que dans l’état normal, les synapses sont les éléments constitutifs de la mémoire, ils sont également à la base de troubles neurologiques complexes tels que la maladie d’Alzheimer32. Le protocole décrit ici sert à étudier la co-localisation des protéines neuronales avec une technique de microscopie super-résolutio...

La compréhension et la vue de la synapse a énormément changé depuis sa première description par Foster et Sherrington en 18971. Depuis lors, notre connaissance de la communication neuronale et les processus moléculaires derrière elle a augmenté de façon exponentielle2. Il est devenu clair que les synapses peuvent être considérées comme un système à deux compartiments : un compartiment pré-synaptique contenant des vésicules pour la libération de neurotransmetteurs et un compartiment post-synaptique avec des récepteurs3. Cette vision simpliste, au cours des vingt dernières années, s’est transformée en un réseau complexe de protéines nécessaires pour transduire la liaison des émetteurs en signalisation4.
Les gains dans la compréhension sont en partie dus aux techniques de super-résolution qui ont surmonté la limite de diffraction de la microscopie légère conventionnelle pour convenir à la dimension des synapses mieux5,6,7,8,9,10. En raison de la limite de diffraction, un microscope optique ne peut pas atteindre une résolution supérieure à 200 nm par la suite11,12. Pour contourner cette limite, des techniques de superrésolution ont été créées, en utilisant différentes approches et en atteignant différentes résolutions limites de sous-diffraction : SIM, STED (Stimated Emission Ecution Exceed Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) et STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM double la résolution spatiale des systèmes de microscopie à large champ à base de laser en insérant une grille de diffraction dans le chemin de faisceaud’excitation 15. La grille mobile diffracts les faisceaux laser pour créer un modèle d’éclairage connu, généralement rayures. Ce motif de lumière volontairement structuré est superposé à la distribution spatiale inconnue du colorant fluorescent (de l’échantillon). Les franges d’interférence formées par les deux modèles codent pour des détails fins autrement indiscernables avec la microscopie normale de large champ. L’image finale super-résolue est obtenue en combinant et décodage avec des méthodes mathématiques plusieurs images brutes du même échantillon obtenus par les traductions et les rotations de la grille de diffraction. La résolution des images super-résolues atteint 100 nm dans le côté et 500 nm dans les directions axiales pour 2D-SIM15 ou 100 nm dans le latéral et 250 nm dans les directions axiales pour 3D-SIM16.
La nouvelle compréhension de la synapse est encore plus importante à la lumière des nombreux troubles neurologiques où le dysfonctionnement synaptique joue un rôle majeur dans l’apparition et la progression17,18. La maladie d’Alzheimer, le syndrome de Down, la maladie de Parkinson, les maladies à prions, l’épilepsie, les troubles du spectre autistique et le syndrome fragile de X, entre autres, ont été liés à des anomalies dans la composition synaptique, la morphologie et la fonction19,20,21,22.
Récemment, à l’aide d’un ensemble d’anticorps spécifiques à sumo, nous avons utilisé sim pour montrer la co-localisation dans les neurones hippocampaux primaires des protéines SUMO avec les marqueurs pré- et post-synaptiques synaptophysine et PSD95 au niveau de super-résolution23. Cela nous a permis de confirmer les preuves biochimiques et confocales de microscopie de la localisation sumo dans les neurones.
Ici, nous décrivons un protocole pour étudier la localisation des protéines dans les neurones primaires hippocampaux de souris. En même temps, ce protocole peut être adapté à différents types de cultures neuronales primaires.

<table><tbody><tr><td>0,4 % de Trypan blue solution&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>70 & micro ; Filtre M&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>Alexa</td><td>Thermo Fisher</td><td></td> <td>Scientific-Anticorps</td></tr> <tr><td>SENP1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-271360</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps B27 Supplément</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine&nbsp ;</td><td>Merck</td><td>5470</td><td>Produit chimique</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck Life Science</td><td>21115</td><td>Lamelles</td></tr> à <tr><td>chambre</td> chimique <td>Ibidi</td><td>80826</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>DyLight</td><td>Thermo Fisher Scientific-Anticorps</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>FBS (Hyclone)</td><td>GIBCO</td><td>SH3007002 (CHA1111L)</td><td>Sérum</td></tr><tr><td>FluoSpheres microsphères modifiées au carboxylate, 0,1 &mu ; m, jaune&ndash ; vert fluorescent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F8803</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merck Life Science</td><td>G8769</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050061</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck Life Science</td><td>H3537</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>L-Cystein&nbsp ;</td><td>Merck Sciences de la Vie&nbsp ;</td><td>C6852-25g</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Merck</td><td>AB15452</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps MEM&nbsp ;</td><td>Technologies de la vie</td><td>21575022</td><td>Medium</td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Merck Life Science</td><td>M8266</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>VWR International</td><td>1 091 371 000</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Life Technologies</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>Medium N-SIM Super Resolution</td><td>Microscope Nikon-Instrument</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Papain</td><td>Merck Life Science& nbsp ;</td><td>P-3125</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde chimique&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Stylo chimique</td></tr><tr><td>/Strep 10x</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate chimique&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Poly-L lysine</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Glass Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>PSD95&nbsp ;</td><td>NeuroMab</td><td>K28/43</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Verre de protection rond</td><td>Thermo</td><td>12052712</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>SUMO1</td><td>Abcam</td><td>ab32058</td><td>Anticorps</td></tr><tr><td>Synaptophysine&nbsp ;</td><td>Merck</td><td>S5768° ;</td><td>anticorps</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp ;</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td>Inhibiteur chimique</td></tr><tr><td>de la trypsine&nbsp ;</td><td>Merck Sciences de la Vie&nbsp ;</td><td>T9003-500MG</td><td>Produit chimique</td></tr></tbody></table>

imagerie super-résolution pour étudier la co-localisation des protéines et des marqueurs synaptiques dans les neurones primaires

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Les synapses sont les éléments fonctionnels des neurones et leurs défauts ou pertes sont à la base de plusieurs troubles neurodégénératifs et neurologiques. Les études d’imagerie sont largement utilisées pour étudier leur fonction et leur plasticité dans des conditions physiologiques et pathologiques. En raison de leur taille et de leur structure, les études de localisation des protéines nécessitent des techniques d’imagerie à haute résolution. Dans ce protocole, nous décrivons une procédure d’étude dans les neurones primaires la co-localisation des protéines cibles avec des marqueurs synaptiques à un niveau de super-résolution utilisant la microscopie d’illumination structurée (SIM). SIM est une technique d’éclairage à motifs qui double la résolution spatiale de la microscopie à large champ, atteignant un détail d’environ 100 nm. Le protocole indique les contrôles et les paramètres requis pour des études de co-localisation robustes et une vue d’ensemble des méthodes statistiques pour analyser correctement les données d’imagerie.

Nous présentons ici le flux de travail standard pour étudier la co-localisation des protéines neuronales. Nous avons d’abord calibré le microscope et ensuite nous avons effectué l’analyse SIM des échantillons. Pour calibrer le système, nous avons utilisé des microsphères fluorescentes de 0,1 μm de diamètre. Lors de l’obtention d’images 3D-SIM super-résolues des perles, les données d’image sous-jacentes sont fourier-transformés pour les re-convertir en une représentation de fréquence spatiale. Dans la...

Ce protocole montre comment utiliser la microscopie à super résolution pour étudier la co-localisation des protéines dans les cultures neuronales primaires.

Imagerie super-résolution pour étudier la co-localisation des protéines et des marqueurs synaptiques dans les neurones primaires

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Les synapses sont les éléments fonctionnels des neurones et leurs défauts ou pertes sont à la base de plusieurs troubles neurodégénératifs et neurologiques. Les études d’imagerie sont largement utilisées pour étudier leur fonction et leur plasticité dans des conditions physiologiques et pathologiques. En raison de leur taille et de leur structure, les études de localisation des protéines nécessitent des techniques d’imagerie à haute résolution.Dans ce protocole, nous décrivons une procédure pour étudier dans les neurones primaires la co-localisation des protéines cibles avec des marqueurs synaptiques à un niveau de super-résolution à l’aide d’une microscopie d’éclairage structurée. SIM est une technique d’éclairage lumineux à motifs qui double la résolution spatiale de la microscopie à champ large, atteignant un détail d’environ 100 nanomètres. Le protocole indique les contrôles et les paramètres requis pour des études de co-localisation robustes et un aperçu des méthodes statistiques pour analyser correctement les données d’imagerie.La clé pour permettre l’analyse à un niveau de super-résolution est, cependant, les reagents utilisés lors de l’acquisition, tels que les coverslips chambés et les solutions de montage compatibles avec l’indice de diffraction de l’objectif. Pour obtenir un neurone primaire hippocampal de souris, isolez hippocampe des chiots P1 à P4. Cellules de plaques à 70 000 cellules par puits dans un volume de 200 microlitres par puits.Attendez que les neurones primaires hippocampaux soient complètement mûris 12 à 14 jours après le placage pour effectuer des études de co-localisation. Ajouter 4% de paraformaldéhyde, PFA, en PBS 200 microlitres par puits aux neurones pour les fixer rapidement. Retirez la solution et incubez les échantillons avec de l’albumine sérique bovine à 1 %, BSA, en PBS à 200 microlitres par puits pendant une heure à température ambiante pour couvrir passivement toutes les surfaces de liaison libre de la plaque avec une protéine non pertinente pour l’analyse.Un tampon de blocage basé sur BSA sans Triton X-100 réduit l’arrière-plan de l’anticorps plus efficacement que le même tampon avec 0,2%Triton X-100. Ajouter l’anticorps primaire. Comme un contrôle négatif, n’ajoutez aucun anticorps primaire à l’un des puits.Cellules de montage à l’aide d’un support compatible SIM, par exemple ProLong Glass Antifade Mountant. Couvrir et protéger les cellules avec un verre de couverture, par exemple, une couverture ronde d’un diamètre de huit millimètres.Les carrés peuvent également être utilisés. Rangez les couvre-couvertures chambés à température ambiante et attendez au moins 48 heures avant d’acquérir des images. Le verre diamant nécessite au moins deux jours de séchage avant les acquisitions à super résolution.Utilisez deux stratégies pour assurer la spécificité des anticorps. Le premier est l’utilisation d’au moins deux anticorps différents ciblant le même substrat. La deuxième stratégie est la neutralisation des anticorps par incubation avec la cible protéique purifiée, ou l’utilisé pour soulever l’anticorps.Nous utilisons régulièrement un microscope à super résolution N-SIM fabriqué par Nikon pour notre analyse. Les instructions qui suivent doivent être destinées à l’acquisition d’images SIM indépendamment du microscope d’utilisation. Il est également important de maximiser les performances du microscope pour effectuer un étalonnage précis des instruments, y compris l’anneau de correction, l’alignement laser et la focalisation du bloc de grille.Avant l’acquisition d’images SIM, le système nécessite un étalonnage approprié avec des perles fluorescentes de taille sous-résolution spécifiques. Un exemple sont les microsphères TetraSpeck. Ces perles sont tachées de différents colorants fluorescents pour permettre l’étalonnage de différents lasers avec un échantillon.Dans un bain d’eau, sonicate environ 1,8 fois 10 à la 8e microsphère fluorescente pendant 10 minutes. Diluer les microsphères fluorescents un sur 500 dans de l’eau distillée double. Sonicate une deuxième fois pendant 10 minutes supplémentaires.Pipette 15 microlitres des perles diluées dans un puits d’un coverslip chambé. Laissez sécher la solution pendant cinq minutes à température ambiante. Ajouter 10 microlitres de la solution de montage, par exempleProLong Glass, et placer un coverslip de huit millimètres sur le dessus. Attendez au moins 48 heures pour permettre un traitement approprié. Allumez le microscope et les lasers.Laissez le système se réchauffer pour atteindre l’équilibre thermique de tous les composants du microscope et le système de microscope sim super-résolution nécessite au moins trois heures. Sélectionnez l’objectif 100X. Démarrez l’étalonnage en alignant les lasers au centre du bloc de râpage de diffraction.Dans le système N-SIM, un bouton de micromètre et une caméra dédiée permettent de centrer les faisceaux lumineux vers la cible. Insérez le coverslip chambé du microscope pour la visualisation. Réglez le système à l’épaisseur du coverslip chambé en ajustant le couvercle de correction objectif.NIS Software, le logiciel propriétaire fourni avec des systèmes de microscope à super résolution N-SIM, a une fonction automatique pour réguler la correction des couleurs. Ajustez la mise au point du bloc de râpage pour chaque canal afin d’assurer un éclairage structuré ciblé du motif sur l’échantillon. Le logiciel fournit une fonction automatique pour cette tâche.Acquérir des images SIM 3D brutes des microsphériques multicolores. Calculez pour chaque longueur d’onde séparée la transformation Fourier de l’image super-résolue. Si l’image transformée n’obtient pas un motif floral correct, redémarrez l’étalonnage puisque la super-résolution n’a pas été atteinte.Dans l’image super-résolue, sélectionnez une seule microsphère et calculez son profil d’intensité pour chaque canal afin de mesurer la résolution obtenue. Il devrait maintenant être proche de 100 nanomètres latéralement. Effectuez l’enregistrement des canaux en superposant une acquisition multicanal des microsphériques.L’objectif est de collimate tous les signaux de canal latéralement et axially. Cela permettra d’éliminer les aberrations chromatiques dues au désalignement des différents canaux et d’aider à l’analyse de co-localisation. Confirmez la qualité de l’étalonnage en utilisant l’étape de phase d’éclairage des fonctions et la mise au point à motifs d’éclairage de SIMcheck, une suite de plugins pour l’application open source ImageJ.Commencez à analyser l’échantillon à l’aide d’un objectif 40X en mode confoccal ou champ large. Cela permet la navigation de l’échantillon, le maintien de bons détails et un grand champ de vision. Utilisez le signal d’anticorps MAP2 pour détecter une zone représentant les processus neuronaux.Obtenez des images de l’échantillon en mode confoccal pour déterminer la qualité de la coloration. Passez à l’objectif 100X. Appliquer de l’huile sur l’objectif 100X.Acquérir une image large ou confoccale qui sera utilisée plus tard pour évaluer la qualité de l’image super-résolue. Passez en mode SIM 3D. À l’aide de fenêtres de dialogue pour définir les paramètres d’acquisition, sélectionnez le réglage de profondeur de bit le plus élevé disponible pour maximiser l’information sur les couleurs.Typiquement, 16 bits est le choix standard. De plus, pour améliorer le rapport signal-bruit, choisissez une valeur d’acquisition à basse fréquence, comme un mégahertz. À l’aide de fenêtres d’histogramme, réglez la puissance laser pour obtenir une réponse linéaire du signal pour éviter la perte d’informations, limitez les pixels saturés dans les images.Le système N-SIM utilise une caméra Andor iXon3. Lorsque vous travaillez à 16 bits, choisissez une intensité cible de 16 000 pour assurer la réponse linéaire de la caméra. Sinon, choisissez une fourchette comprise entre 30 000 et 45 000 pour maximiser la gamme dynamique des acquisitions.Réglez la puissance laser entre 0,1% et 50% lors de l’imagerie des échantillons et les temps d’exposition entre 50 millisecondes et deux secondes. Les puissances laser supérieures à 50% peuvent provoquer un photobleaching rapide des fluorophores utilisés. Commencez à acquérir les images en mode SIM 3D.Utilisez SIMcheck, une suite de plugins gratuits pour ImageJ, pour évaluer la qualité des acquisitions des images brutes. Si SIMcheck ne détecte aucun artefact ou problème de qualité, obtenez un minimum de 10 images à partir de répliques techniques complètes pour permettre une analyse statistique. Les images acquises sont des données brutes qui doivent être traitées pour obtenir des images SIM reconstruites qui seront utilisées pour une analyse plus approfondie.Dans le protocole, nous suggérons d’utiliser la synaptophysine et psd-95 comme marqueurs pré et post synaptiques. Des marqueurs supplémentaires peuvent toutefois être utilisés. Un énorme corps de littérature soutient l’utilisation d’autres protéines, telles que la drebrin et le basson comme marqueurs synaptiques.Les images 3D sim acquises sont des images brutes qui doivent être traitées pour obtenir des images reconstruites super-résolues. Une reconstruction incorrecte des images brutes peut mener à des artefacts qui affecteraient l’analyse des échantillons. Il convient donc d’accorder une grande attention au bon choix des paramètres de reconstruction.Traiter les images brutes à l’aide du logiciel d’analyse de reconstruction du microscope pour obtenir une image super-résolue. Alternativement, utilisez un plugin imageJ fairSIM librement disponible pour reconstruire les images brutes. Calculez la transformation fourier des images super-résolues à l’aide du logiciel de reconstruction au microscope ou du plugin ImageJ SIMcheck.Une bonne image reconstruite doit revenir, pour chaque canal, à une image fleurie. Si les images reconstruites ne parviennent pas à recréer une forme fleurie, redémarrez à partir des images brutes et reconstruisez-les en modifiant les paramètres de reconstruction, tels que le filtrage linéaire, l’apodisation et la suppression de l’ordre zéro. Dans le logiciel NIS utilisant l’aperçu pour surveiller comment la modification des paramètres affecte l’image finale résolue, modifiez le contraste de modulation de l’éclairage du paramètre, la suppression du bruit à haute résolution et la suppression hors foyer.Analyser l’image reconstruite pour détecter impartialement les artefacts à l’aide de NanoJ-SQUIRREL, un plugin basé sur l’ImageJ, pour évaluer la qualité des images super-résolues. Dans notre analyse de la co-localisation, nous avons utilisé deux approches. La première est une approche visuelle basée sur l’analyse de profil qui montre des événements simples de co-localisation et qui identifie la contribution de chaque canal.Dans un premier temps, pour étudier la co-localisation entre les marqueurs synaptiques et une protéine d’intérêt, prenez une image super-résolue et analysez un seul locus pour déterminer le chevauchement du signal. Identifiez un seul locus sur l’image super-résolue. Obtenez les profils d’intensité des signaux fluorescents au lieu d’intérêt.Si l’analyse de profil a suggéré une co-localisation unique du locus, une analyse plus générale de l’ensemble de l’image peut être effectuée en calculant les coefficients de Pearson et mander. Utilisez JACoP, un plugin ImageJ, pour déterminer deux paramètres de co-localisation, pearson et mander. Après avoir calibré le système et évalué la qualité des images reconstruites, nous avons ensuite commencé à analyser les cultures neuronales primaires tachées d’un anticorps contre MAP2, un marqueur neuronal, PSD-95, un marqueur postsynaptique, et notre protéine cible SUMO1.Nous avons d’abord analysé l’échantillon effectuant la microscopie confoccale à quatre canaux avec un objectif de 40X. Lors de la sélection d’une zone représentant les processus neuronaux, nous sommes passés à un objectif 100X. Nous avons acquis des images confoccales et SIM d’une même zone afin d’évaluer la qualité de la reconstruction avec NanoJ-SQUIRREL et d’effectuer une analyse de co-localisation.L’élucidation de la structure et de la composition de la synapse est cruciale pour la compréhension des processus physiologiques et pathologiques qui régulent la mémoire et la cognition. Alors que dans l’état normal synapses sont les éléments constitutifs de la mémoire, ils sont également à la base de troubles neurologiques complexes, tels que l’une des formes les plus courantes de démence maladie d’Alzheimer. Le protocole décrit ici permet l’étude de la composition protéique des synapses avec une technique de microscopie à super résolution appelée microscopie à éclairage structuré.

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Ce protocole de détails comment quantifier le numéro de synapses neuronales dans la culture à la fois dissociées et dans les sections du cerveau en utilisant l'immunocytochimie. En utilisant des anticorps spécifiques du compartiment, nous appelons les terminaux présynaptiques ainsi que des sites de spécialisation post-synaptiques. Nous définissons les synapses comme des points de colocalisation entre les signaux générés par ces marqueurs.

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On décrit une méthode pour l'étiquetage des neurones avec des colorants fluorescents dans prédéterminées fonctionnels micro-domaines du néocortex. Tout d'abord, l'imagerie optique intrinsèque de signal est utilisé pour obtenir une carte fonctionnelle. Puis microscopie à deux photons est utilisée pour l'étiquette et les neurones d'image dans un domaine micro-de la carte.

Etiquetage des neurones ciblés dans une fonction spécifique à micro-domaine du néocortex par combinaison du signal intrinsèque et à deux photons d&#39;imagerie

Cet article décrit un protocole de travail à l'image épines dendritiques de neurones de l'hippocampe in vitro utilisant structuré Illumination Microscopy (SIM). Microscopie de super-résolution utilisant la carte SIM offre une résolution d'image de façon significative au-delà de la limite de diffraction de la lumière dans les trois dimensions de l'espace, ce qui permet l'imagerie des épines dendritiques individuelles avec l'amélioration de détail.

Imagerie épines dendritiques des neurones de l&#39;hippocampe de rat primaire utilisant structuré Illumination Microscopy

Nous décrivons comment mettre en œuvre photoactivée microscopie localisation (PALM) à base des études de vésicules dans fixes, des neurones en culture. Les éléments clés de notre protocole comprennent l'étiquetage des vésicules avec des chimères photoconvertible, la collecte des images brutes faiblement échantillonnées avec un système de microscopie de super-résolution, et de traitement des images brutes afin de produire une image de super-résolution.

Super-résolution d&#39;imagerie de neurones vésicules à cœur dense

Cette vidéo montre la procédure de craniotomie qui permet l’imagerie chronique des neurones dans le cortex rétrosplénial de souris à l’aide de la microscopie à deux photons in vivo dans la lignée transgénique Thy1-GFP. Cette approche est combinée à l’injection d’un virus adéno-associé exprimant mCherry dans l’hippocampe dorsal. Ces techniques permettent un suivi à long terme de la plasticité structurelle dépendante de l’expérience dans les RSC.

Simultanée à deux photons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

Ici , nous montrons comment quantifier le nombre et la répartition spatiale des zones actives synaptiques dans Drosophila melanogaster photorécepteurs, mis en évidence avec un marqueur moléculaire codé génétiquement, et leur modulation après une exposition prolongée à la lumière.

Analyse Synaptic Modulation de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorécepteurs après exposition à la lumière prolongée

Ici, nous décrivons une procédure pour la compensation des tissus, marquage fluorescent et l’imagerie à grande échelle du tissu de cerveau de souris qui, ainsi, permet la visualisation de l’organisation en trois dimensions des types de cellules dans le néocortex.

Imagerie tridimensionnelle à grande échelle de l’organisation cellulaire dans le néocortex de souris

Nous décrivons ici une approche quantitative pour déterminer la répartition d’une protéine synaptique par rapport à une protéine de marqueur à l’aide d’immunofluorescence souillant, microscopie confocale et analyse assistée par ordinateur.

Quantifier la répartition hétérogène d’une protéine synaptique dans le cerveau de souris à l’aide d’Immunofluorescence

Ici, nous démontrons comment combiner la transfection des neurones primaires de rongeurs de l’hippocampe avec l’imagerie confocale de cellules vivantes pour analyser les effets induits par les protéines pathologiques sur le transport axonal et identifier les voies mécanistes médiant ces effets.

Utilisation de l’imagerie de cellules vivantes pour mesurer les effets de protéines pathologiques sur le transport axonal dans les neurones primaires de l’hippocampe

Découvrez la microscopie SIM pour étudier la co-localisation protéique dans les neurones primaires de souris. Cette méthode permet d'atteindre une résolution de 100 nanomètres pour analyser les interactions synaptiques.

Imagerie super-résolution pour étudier la co-localisation des protéines et des marqueurs synaptiques dans les neurones primaires (Vidéo) | JoVE Journal

Imagerie super-résolution pour étudier la co-localisation des protéines et des marqueurs synaptiques dans les neurones primaires

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