Évaluation de l’expression du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I sur les neurones primaires de l’hippocampe murin par cytométrie en flux

Ce protocole utilise la cytométrie en flux pour évaluer quantitativement l’expression extracellulaire du CMH de classe 1 sur les neurones primaires cultivés à partir de souris. L’immunomarquage NC2 pour l’expression de MHC1 peut également être effectué pour éviter une perte de signal due à des changements protéiques, tertiaires, structurels, de perméabilisation ou de dénaturation. En plus de diriger les réponses immunitaires aux infections, le CMH de classe 1 module les connexions synaptiques neuronales.

Cependant, les facteurs qui régulent l’expression du CMH de classe 1 sont encore inconnus. Les étapes de dissection cérébrale embryonnaire demandent de la pratique pour être maîtrisées. Lors de l’apprentissage de la technique, prenez soin de pratiquer la dissection sans vous soucier du temps ou du processus de culture ultérieur.

Pour isoler l’hippocampe embryonnaire, placez le premier cerveau embryonnaire de souris récolté sous un microscope à stéréo-dissection. Et utilisez deux paires de pinces Dumont numéro 5 stériles pour pincer les bulbes olfactifs et retirer soigneusement les méninges. Une fois que les méninges ont été complètement retirées, le côté supérieur du cortex s’ouvrira latéralement pour exposer l’hippocampe.

Utilisez la pince pour pincer l’hippocampe loin du cortex attaché et transférez soigneusement l’hippocampe isolé dans un tube conique stérile de 15 millilitres contenant cinq millilitres de milieu Hibernate-E sur de la glace. Lorsque tous les hippocampes ont été rassemblés dans un seul tube de 15 millilitres, sédimentez le tissu cérébral par centrifugation. Remplacez le surnageant par 0,5 millilitre de dissociation de papaïne fraîchement préparée par embryon et mélangez le tube plusieurs fois par inversion.

Placez le tissu à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, en mélangeant les échantillons par inversion toutes les 10 minutes avant de recueillir à nouveau le tissu par centrifugation. Remplacez le surnageant par un volume égal de milieu Hibernate-E frais et utilisez une pipette Pasteur en verre entièrement ouverte et polie au feu pour triturer le tissu 10 fois. Après avoir laissé le tissu se stabiliser pendant deux minutes, transférez le surnageant dans un nouveau tube conique de 50 millilitres.

Ajoutez un volume égal d’Hibernate-E Medium dans le tissu et utilisez une pipette Pasteur en verre semi-ouverte polie au feu pour triturer le tissu 10 fois. Après avoir laissé le tissu se stabiliser pendant encore deux minutes, accumulez le surnageant dans le tube de 50 millilitres. Ajoutez un volume égal de milieu Hibernate-E aux tissus et triturez le tissu 10 fois avec une pipette Pasteur en verre poli au feu quart ouverte.

Après avoir laissé le tissu se déposer pendant deux minutes, accumulez le surnageant dans le tube de 50 millilitres. Recueillir les cellules dissociées dans le surnageant par centrifugation. Et remettez en suspension la pastille dans cinq millilitres de milieu de croissance neuronale pour le comptage Diluez les cellules à une densité finale de placage de cinq fois 10 à la cinquième cellule viable par millilitre de milieu de croissance neuronale et ajoutez un millilitre de cellules à chaque puits d’une plaque revêtue de poly-D-lysine à 12 biens.

Placez ensuite la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire, en remplaçant la moitié du milieu par un volume égal de milieu frais deux fois par semaine pendant toute la durée de vie de la culture. Pour évaluer la capacité des neurones cultivés à exprimer le CMC1, au jour approprié de la culture, remplacer 0,5 millilitre de surnageant dans chaque puits par 0,5 millilitre de milieu de croissance neuronal frais complété par 200 unités par millilitre d’interféron bêta pour une incubation de six à 72 heures dans l’incubateur de culture cellulaire. À la fin de l’incubation, laver chaque puits une fois avec un milieu neurobasal froid sans suppléments avant d’ajouter 0,5 millilitre de milieu neurobasal froid non supplémenté complété par un microgramme par millilitre de bloc FC et un microgramme par millilitre d’anticorps anti-MHC1 conjugué à la fluorescence dans chaque puits.

Après une incubation de 45 minutes à quatre degrés Celsius, protégez-le de la lumière. Lavez bien chaque fois avec du Dulbeccos PBS froid. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de tampon de dissociation cellulaire sans enzyme à température ambiante dans chaque puits et agitez pour déloger les cellules.

Confirmez la dissociation à l’aide d’un microscope de culture tissulaire inversé et ajoutez 0,5 millilitre de tampon FACS dans chaque puits. Triturez les cellules pour disperser les amas et transférez tout le volume de chaque puits dans des tubes de microcentrifugation individuels de 1,7 millilitre. Récupérez les cellules par centrifugation et remettez en suspension la pastille dans 100 microlitres de tampon FACS frais par tube.

Transférez chaque suspension dans des puits individuels d’une plaque à fond en U de 96 puits et ajoutez 100 microlitres de réactif fixateur dans chaque puits. Triturez plusieurs fois pour éviter l’agglutination des cellules et incubez la plaque pendant 15 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. A la fin de l’incubation, centrifuger pour collecter les cellules au fond des puits et remettre les granulés en suspension dans 200 microlitres de tampon FACS frais par puits.

Après centrifugation, remettre les pastilles en suspension dans 100 microlitres de réactif de perméabilisation complété par un anticorps anti-noyaux neuronaux conjugué à la fluorescence par puits. Après avoir mélangé, incubez la plaque pendant 20 minutes à température ambiante avec un balancement à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, collectez les cellules par centrifugation trois fois, en remettant les granulés en suspension dans 100 microlitres de tampon FACS frais entre les centrifugations.

Après le dernier lavage, remettre les cellules en suspension dans 100 microlitres de 2 % de formaldéhyde dans un tampon FACS avec un mélange minutieux. Les neurones peuvent être identifiés par le contrôle séquentiel des événements totaux pour exclure les débris cellulaires et les doublets et par la positivité de leurs noyaux neuronaux. Les cellules neuronales positives aux noyaux peuvent ensuite être analysées pour leur positivité au CMC1.

À partir de ces données, le pourcentage de neurones positifs pour la coloration du CMH1 et l’intensité médiane de la fluorescence peuvent être calculés, révélant que, par exemple, le traitement par l’interféron bêta régule considérablement à la hausse le pourcentage et l’intensité de l’expression des neurones du CMH1. Avec de légères modifications, ces méthodes peuvent être utilisées pour cultiver d’autres populations neuronales comme les neurones corticaux ou pour tester différents marqueurs cellulaires, des molécules stimulantes ou des modifications génétiques.