Name: Obtention de microglies humaines à partir de tissus cérébraux humains adultes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Apprenez à isoler des microglies primaires à partir de tissus cérébraux humains adultes avec un rendement élevé d'environ 80%. Cette méthode robuste et économique réduit la perte cellulaire pour vos recherches en neurosciences.

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Le laboratoire de SJ a été créé grâce à des subventions institutionnelles de l’IITJ et est financé par des subventions du Département de la biotechnologie (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) et du Ministère de l’électronique et des technologies de l’information du Gouvernement de l’Inde (no 4(16)/2019-ITEA). Les sections de tissu cérébral humain ont été obtenues du All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur après l’autorisation du comité d’éthique institutionnel. Nous remercions Mayank Rathor, B.Tech Student membre de design and Arts Society IIT Jodhpur, pour son soutien en vidéographie.

Tous les tissus ont été acquis après l’autorisation éthique des comités d’éthique de l’Institut indien de technologie Jodhpur et de l’Institut indien des sciences médicales (AIIMS) Jodhpur.
1.Acquisition et traitement de tissus (Jour 0)
<ol><li>Recueillir le tissu dans un tube de 50 ml contenant 10 ml de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) (2 mM CaCl2•2H2O, 10 mM glucose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2•6H2O, 202 mM saccharose)20. Assurez-vous que le tube est conservé sur la glace si le tissu doit être transféré à un autre endroit. REMARQUE : Préparer l’ACSF dans de l’eau distillée autoclavée. Filtrez-le avec un filtre à seringues de 0,22 μm dans le capot laminaire. Ceci peut être stocké pendant 1 mois à 4 °C.</li>
	<li>Essuyez soigneusement le tube de collecte avec 70 % d’alcool et transférez-le dans une chambre à écoulement d’air laminaire aseptique.</li>
	<li>Jetez soigneusement l’aCSF et pesez les tissus dans un état aseptique. Le poids des tissus est essentiel pour calculer le volume de trypsin-EDTA nécessaire pour les étapes suivantes.</li>
	<li>Gardez le tissu dans l’aCSF frais chaud à 37 °C pendant 5 minutes. Cette étape est essentielle pour éviter la mort cellulaire.</li>
	<li>Jeter l’aCSF et laver les tissus une fois avec 1x PBS (saline tamponnée de phosphate) à 37 °C. Assurez-vous que tout le sang est lavé avec des lavages répétés PBS (au besoin).</li>
	<li>Incuber le tissu dans un PBS chaud, à 37 °C, pendant 5 min.</li>
	<li>Jeter pbs soigneusement et transférer le tissu dans une boîte de Pétri stérilisée. PBS peut être enlevé avec une pipette. Cela permettra d’éviter toute perte de tissu.</li>
	<li>Couper le tissu en petits morceaux (au moins 1 mm3)à l’aide d’un scalpel stérile. Les tissus finement coupés en dés fournissent une surface supérieure des tissus pour la dissociation des tissus par la trypsin-EDTA assurant un rendement plus élevé.</li>
	<li>Transférer le tissu en dés dans un tube de 50 ml contenant 10 ml/g de tissu de 0,25 % de trypsin-EDTA et mélanger en pipeting à travers une pipette sérologique de 10 mL. Ajouter 2 mL de trypsin/EDTA dans une boîte de Pétri et laver soigneusement la plaque à l’aide de la pipette. Ajoutez cette trypsin au tube de faucon. Cela minimise la perte de tissus et de cellules pendant le dés.</li>
	<li>Incuber le tube sur un shaker pendant 30 minutes à 37 °C à 250 tr/min. Cette étape augmente la dissociation des cellules des tissus.</li>
	<li>À la fin de l’incubation, ajouter 10 mL de milieu neutralisant (50% DMEM/50% F12 avec de la glutamine, 1% de pénicilline-streptomycine, 10% FBS) pour neutraliser la trypsine. Mélanger avec une pipette sérologique de 10 mL. La quantité de supports neutralisants ajoutées doit être égale à la quantité de trypsine utilisée.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 2 000 x g à 4 °C pendant 10 minutes.</li>
	<li>Jeter le supernatant et re-suspendre le granulé dans 1 mL de milieu de culture (50% DMEM/50% F12 avec de la glutamine, 1% de pénicilline-streptomycine, 20% L929 supernatant, 10% FBS). NOTE : Les cellules L929 sont de culture dans DMEM (DMEM avec glutamine, 1% pénicilline-streptomycine, 10% FBS). La méthode de culture recommandée par l’ATCC doit être suivie pour la culture cellulaire. Le superflu doit être prélevé dans la fiole de culture qui est d’au moins 75% confluent. Il peut être collecté en vrac et stocké à -80 °C pour prévenir la dégradation des facteurs de croissance. Il est recommandé d’ajouter le supernatant L929 séparément dans des flacons au lieu d’ajouter au milieu de culture de stock.</li>
	<li>Plaquez les cellules dans une fiole T-25, adaptée aux cellules adhérentes, et ajoutez 4 ml de milieu de culture supplémentaire. Incuber la fiole à 37 °C avec 5% de CO2. Secouez soigneusement la fiole pour disperser homogènement le tissu. Évitez d’amener le milieu au cou de la fiole, tout en secouant, car cela peut augmenter les risques de contamination.</li>
</ol>2.Culture cellulaire (Jour 2)
<ol><li>Recueillir les supports de la fiole de culture T-25 préparée le jour 0 dans trois tubes de centrifugeuse de 1,5 mL en recueillant un volume égal de supports dans chaque tube. Laver la fiole une fois avec 1 x PBS. Agiter doucement la fiole pour enlever les fragments de tissu restants laissés. Évitez les secousses sévères de la fiole car les fragments de reste n’affecteront pas négativement la culture. Ajoutez 5 mL de supports de culture fraîche à la fiole.</li>
	<li>Centrifuger le support collecté à 1 466 x g (4000 tr/min) à 4 °C pendant 4 minutes.</li>
	<li>Jeter le supernatant de chaque tube et ajouter 1 ml de milieu de culture à l’un des tubes. Bien mélanger avec la pipette. Ajoutez en série les supports mixtes avec des cellules à d’autres tubes. Mélanger soigneusement avec la pipette et mettre les cellules en commun dans un tube.</li>
	<li>Plaquez les cellules dans une fiole T-25 séparée, adaptée aux cellules adhérentes. Ajouter 4 ml de milieu de culture et incuber la fiole à 37 °C avec 5% de CO2.</li>
</ol>3.Culture cellulaire (Jour 4)
<ol><li>Jetez les supports des deux flacons et ajoutez 5 ml de supports culturels frais à la fiole.</li>
	<li>Incuber la fiole à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 2 jours.</li>
</ol>4. Culture cellulaire (Jour 6)
<ol><li>Les cellules seront prêtes pour d’autres expériences.</li>
</ol>

<ol><li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+-+more+than+just+brain+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li>
<li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+Beyond%3A+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li>
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<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li>
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<li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Microglie assurer l’homéostasie dans le cerveau normal et jouer un rôle central dans la pathophysiologie de diverses maladies neurologiques4. Les microglies sont au cœur du neurodéveloppement et de la formation des synapses2. Les études microgliale se sont avérées essentielles dans la compréhension du développement et de la progression de diverses maladies neurologiques4. Les microglies de rongeurs sont le modèle de choix prédominant pour les études ...

Le système nerveux central (SNC) est construit à partir d’un réseau complexe de neurones et de cellules gliales1. Parmi les cellules gliales, les microglies fonctionnent comme les cellules immunitaires innées du SNC2,3. Les microglies sont responsables du maintien de l’homéostasie dans le SNC4en bonne santé . Les microglies jouent également un rôle important dans le neurodéveloppement, en élaguant les synapses2. Les microglies sont au cœur de la pathophysiologie de plusieurs maladies neurologiques, y compris, mais pas limitée à; Maladie d’Alzheimer5, maladie de Parkinson6, ACCIDENT VASCULAIRE CÉRÉBRAL7, Sclérose en plaques8, lésion cérébrale traumatique9, douleur neuropathique10, lésions de la moelle épinière11 et tumeurs cérébrales telles que les gliomes12.
Les études liées à l’homéostasie et aux maladies du SNC utilisent des microglies de rongeurs en raison d’une pénurie de protocoles d’isolement des microglies primaires humaines efficaces et rentables13. Les microglies de rongeurs ressemblent à des microglies humaines primaires dans l’expression de gènes tels que Iba-1, PU.1, DAP12 et M-CSF récepteur et ont été efficaces dans la compréhension normale ainsi que le cerveau malade13. Fait intéressant, l’expression de plusieurs gènes immunitaires connexes tels que TLR4, MHC II, Siglec-11 et Siglec-3 varie entre les microglies humaines et les rongeurs13. L’expression de plusieurs gènes varie également dans l’expression temporelle et dans les maladies neurodégénératives chez les deux espèces14,15. Ces différences significatives font de la microglie humaine un modèle essentiel pour étudier la fonction de microglie dans l’homéostasie et la maladie. La microglie humaine primaire peut également être un outil efficace pour le dépistage préclinique des candidats potentiels16. Les raisons mentionnées ci-dessus soulignent le besoin croissant de protocoles rentables pour l’isolement des microglies humaines primaires.
Nous avons développé un protocole pour l’isolement de la microglie humaine primaire du tissu humain adulte de cerveau recueilli à la suite de la fenêtre chirurgicale créée pour les résections de tumeur ou d’autres résections chirurgicales. La méthode ici est considérablement différente des méthodes existantes. Nous avons pu isoler et culturer des microglies après un temps de transit d’environ 75 minutes entre le site de collecte des tissus et le début du protocole d’isolement en laboratoire. Nous avons utilisé le supernatant des cellules fibroblastiques L929 pour favoriser la croissance de microglies isolées. Cette méthode se concentre spécifiquement sur la culture et le développement de microglies primaires seulement. La culture qui en résulte est d’environ 80% de microglies. Alors que d’autres protocoles fournissent une culture enrichie de microglies par centrifugation gradient de densité, cytométrie de flux et perles magnétiques, le protocole est un moyen rapide, simple, robuste et rentable à la culture primaire microglie humaine17,18,19,20. La capacité d’utiliser le tissu cérébral adulte vivant enlevé chirurgicalement au lieu des tissus fixes du cerveau des cadavres prouve un avantage supplémentaire de cette méthode contrairement aux procédures existantes18,21.

<table><tbody><tr><td>Solution antibiotique-antimycosique</td><td>Himedia</td><td>A002</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse (4 &deg ; C)</td><td>Sigma</td><td>146532</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger</td><td>Abdos</td><td>P10203</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubateur</td><td>New Brunswik</td><td>Galaxy 170 S</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td></td><td>Himedia GRM077</td><td></td></tr><tr><td>DMEM milieu avec glutamine</td><td>Himedia</td><td>AL007S</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Himedia</td><td>RM9955</td><td></td></tr><tr><td>Flacon tube (50 ml)</td><td>Thermo Fsiher Scientific&nbsp ;</td><td>50CD1058</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescéine Ricinus communis agglutinin-1</td><td>Vecteur</td><td>FL-1081</td><td></td></tr><tr><td>Microscope fluorescent</td><td>Leica</td><td>DM2000LED</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield avec DAPI</td><td>Sigma</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps GFAP</td><td>GA5</td><td>3670S</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur d’incubateur</td><td>New Brunswik Scientific</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>L929 lignée cellulaire</td><td>ATCC</td><td>NCTC clone 929 [cellule L, L-929, dérivé de la souche L] (ATCC&nbsp ; CCL-1)</td><td></td></tr><tr><td>Flux d’air laminaire</td><td>Thermo Fsiher Scientific&nbsp ;</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Himedia</td><td>MB040</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate monosodique</td><td>Merck</td><td>567545</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de nutriments F-12 Jambon Moyen</td><td>Himedia</td><td>Al106S</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Duran Groupe</td><td>237554805</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée</td><td>au phosphate Himedia</td><td>ML023</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td> <td>de potassiumHimedia</td><td>MB043</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique</td><td>Matériel de laboratoire</td><td>LW-SP1010</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Himedia</td><td>MB045</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Himedia</td><td>MB025</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue (0,2&mu ;, 25 mm de diamètre)</td><td>Axiva</td><td>SFPV25R</td><td></td></tr><tr><td>T-25 Fioles de culture tissulaire adaptées à la culture cellulaire adhérente.</td><td>Himedia</td><td>TCG4-20X10NO</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %)</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>Référence 25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

obtention de microglies humaines à partir de tissus cérébraux humains adultes

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Les microglies résident les cellules immunitaires innées du système nerveux central (SNC). Les microglies jouent un rôle essentiel pendant le développement, dans le maintien de l’homéostasie, et pendant l’infection ou les blessures. Plusieurs groupes de recherche indépendants ont mis en évidence le rôle central que jouent les microglies dans les maladies auto-immunes, les syndromes autoinflammatoires et les cancers. L’activation de la microglie dans certaines maladies neurologiques peut participer directement aux processus pathogènes. Les microglies primaires sont un outil puissant pour comprendre les réponses immunitaires dans le cerveau, les interactions cellule-cellule et les phénotypes dysrégulés de microglie dans la maladie. Les microglies primaires imitent mieux les propriétés microgliales in vivo que les lignées cellulaires microgliales immortalisées. Les microglies adultes humains présentent des propriétés distinctes par rapport aux microglies foetales et rongeurs humaines. Ce protocole fournit une méthode efficace pour l’isolement des microglies primaires du cerveau humain adulte. L’étude de ces microglies peut fournir des informations critiques sur les interactions cellule-cellule entre les microglies et d’autres populations cellulaires résidentes dans le SNC, y compris les oligodendrocytes, les neurones et les astrocytes. En outre, les microglies de différents cerveaux humains peuvent être cultivées pour la caractérisation des réponses immunitaires uniques pour la médecine personnalisée et une myriade d’applications thérapeutiques.

En utilisant le protocole mentionné ci-dessus (Figure 1), nous avons été en mesure d’isoler les microglies humaines primaires des tissus cérébraux vivants réséqués chirurgicalement. Les cellules cultivées ont été tachées de ricinus communis agglutinine-1 (RCA-1) lectine pour microglie (vert) et avec des protéines acides fibrillaires gliales (GFAP) pour les astrocytes (rouge) (Figure 2) comme décrit précédemment<sup class...

Ce protocole est une méthode efficace, rentable et robuste d’isoler les microglies primaires des tissus cérébraux vivants, adultes et humains. Les microglies humains primaires isolés peuvent servir d’outil pour étudier les processus cellulaires dans l’homéostasie et la maladie.

Obtention de microglies humaines à partir de tissus cérébraux humains adultes

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

L’objectif global du protocole est d’isoler les cellules primaires des microglies des tissus cérébraux humains adultes vivants. Dans notre cas, ceci a été rassemblé comme fenêtre chirurgicale pendant la chirurgie. Ceci est accompli en recueillant d’abord les tissus cérébraux dans la glace froide PBS, le tissu est ensuite en dés en petits morceaux cube de 1 mm, et je viens de le faire avec l’aide de trypsine EDTA.Par la suite, les cellules sont récoltées par centrifugation et plaquées dans un flacon adapté à la culture des cellules androgènes pendant 48 heures. Les cellules sont récoltées une fois de plus dans le flacon et cultivés jusqu’à nouvel usage. Les cellules primaires des microglies humaines peuvent maintenant être caractérisées par l’immunocytochimie et utilisées pour d’autres expériences.Le principal avantage de notre protocole pour isoler les cellules de microglies des tissus cérébraux humains adultes est qu’il fournit effectivement les cellules primaires adultes de microglies humaines d’une manière très rentable. Le protocole est robuste et il réduit la perte de cellules en réduisant le nombre d’étapes utilisées dans les protocoles existants. Recueillir les tissus dans un tube Falcon de 50 mL contenant 10 mL d’aCSF glacé.Essuyez soigneusement le tube de collecte avec 70% d’alcool et transférez-le dans une chambre d’écoulement d’air laminaire aseptique. Jetez soigneusement l’aCSF et pesez les tissus dans le tube Falcon. Calculez le poids environ des tissus en déduisant le poids du tube Falcon vide.Chaud frais aCSF à 37 degrés centigrades. Gardez le tissu au chaud aCSF pendant cinq minutes. Cette étape est essentielle pour éviter la mort cellulaire.Jetez soigneusement l’aCSF. Et laver les tissus une fois avec 1X PBS réchauffé à 37 degrés centigrades. Assurez-vous que tout le sang est emporté par des lavages répétés de PBS au besoin.Incuber le tissu dans du PBS chaud pendant 5 minutes. Jetez soigneusement la moitié du PBS. Transférer le tissu avec le reste du PBS dans une boîte de Pétri stérilisée.Retirer soigneusement le reste du PBS avec une pipette de 1 mL. Cela permettra d’éviter la perte de tissu. Couper ce problème en petits morceaux cubes d’au moins 1 mm à l’aide d’un scalpel stérile.Ajouter 2 mL de 0,25% trypsine EDTA à la boîte de Petri et bien laver l’assiette à l’aide de pipette. Transférer le tissu en dés dans un tube Falcon de 50 mL contenant 10 mL par gramme de tissu de 0,25% trypsine EDTA. Mélanger au pipetage à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.Incuber le tube sur un shaker pendant 30 minutes à 37 degrés centigrades et la vitesse de 250 rpm. Ajouter 10 mL de milieu neutralisant pour neutraliser la trypsine. Bien mélanger avec une pipette sérologique de 10 mL.Centrifugeuse du tube à 2000G à 4 degrés centigrades pendant 10 minutes. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille dans 1 mL de milieu de culture. Déposer les cellules dans un flacon T25 adapté aux cellules androgènes et ajouter 4 mL de milieu de culture supplémentaire.Le milieu culturel contiendra 20%L929 supernatant et 1% streptomycine. Il est recommandé d’ajouter le supernatant L929 séparément dans les flacons au lieu d’ajouter au milieu de culture des stocks. Nous en avons fini avec le flacon pour éliminer homogènement le tissu.Évitez d’amener les médias au cou du flacon tout en secouant car cela peut augmenter les risques de contamination. Incuber le flacon à 37 degrés centigrades avec 5% de CO2 pendant 48 heures. Recueillir les médias à partir de flacon de culture T25 préparé le jour 0 dans des tubes de centrifugeuse.Centrifugeuse les médias recueillis à 1466G à 4 degrés centigrades pendant 4 minutes. Pendant que les supports collectés sont centrifugés, lavez le flacon jour 0 une fois avec 1X PBS. Secouez doucement le flacon pour enlever les fragments de tissu restants.Évitez les secousses dures de la fiole car tout fragment de reste n’affectera pas négativement la culture. Ajouter 5 mL de culture fraîche dans le flacon. Jeter le surnatant des tubes centrifugés.Ajouter 1 mL de culture moyenne à l’un des tubes et bien mélanger avec la pipette. Ajouter en série les supports mélangés avec des cellules à d’autres tubes et bien mélanger. Déposer les cellules dans un flacon T25 séparé adapté aux cellules androgènes.Ajouter 4 mL de médias de culture frais à la fiole. Incuber les deux flacons à 37 degrés centigrades avec 5% de CO2 pendant 48 heures. Jetez les médias des deux flacons et ajoutez des supports culturels frais de 5 mL.Incuber les flacons à 37 degrés centigrades à 5% de CO2 pendant 48 heures. Le sixième jour, les cellules seront prêtes pour d’autres expériences. Dans les images représentées ici.Premier panneau de la section A astrocytes tachés de GFAP, de couleur verte. Dans le deuxième panneau, de la section A microglia tache avec RCA, vert en couleur. Dans la section B microglies tachées de RCA, qui est de couleur verte, et les astrocytes sont tachés de GFAP, de couleur rouge.La superposition des images montre des microglies et des astrocytes ensemble. Il est clair d’après les images que la majorité des cellules de la culture préparées sont des microglies. Les images ont été quantifiées par un contrôle aveugle et le résultat est représenté dans la section C.Les résultats ont montré qu’environ 80% des cellules de la culture préparées sont des cellules microgliales.Cette technique peut être effectuée en environ une heure et demie. Après cette procédure devrait avoir une bonne compréhension de la façon dont je sélectionne l’amorçage microglies à partir de tissus cérébraux humains adultes, qui peuvent être utilisés pour des expériences en aval.

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Isoler les microglies primaire à partir de l'hétérogénéité cellulaire du cerveau est essentielle pour enquêter sur leur rôle dans les deux conditions physiologiques et pathologiques. Ce protocole décrit une isolation mécanique et technique mixte de culture cellulaire qui fournit un rendement élevé et de haute pureté, viables primaires pour les cellules...

Isolement primaire microglies de cultures mixtes de cellules gliales de tissus de cerveau de rat nouveau-né

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La vidéo a démontré la méthode d’isolement et de culture de cellules à partir du cerveau d’une souris néonatale. Il impliquait une dissociation enzymatique et mécanique du cerveau, suivie d’une culture dans un milieu de croissance dépourvu de facteur de croissance neuronale pour obtenir une population gliale mixte.

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Nous présentons des méthodes pour l'isolement / culture efficace et rapide de la microglie viable du cortex cérébral néonatal et la moelle épinière adulte. La dissection et le placage de la microglie corticale peuvent être accomplies dans les 90 minutes, avec la récolte des microglies subséquente aura lieu ~ 10 jours suivant la dissection initiale.

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Une des clés de réussite de l'enquête de la biologie de la microglie est la préservation de la microglie immunofunction ex vivo lors de l'isolement de tissu du SNC. Isoler la microglie par les résultats serrant rotatifs dans des cultures de cellules de grande pureté et immunofonctionnel évaluée par imagerie de fluorescence, immunocytochimie, et ELISA activation de la microglie suivante avec le lipopolysaccharide stimuli pro-inflammatoires (LPS) et Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolation des corticale microglie avec immunophénotype préservée et fonctionnalité De murins nouveau-nés

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Le protocole présenté ici permet la transplantation de microglies humaines induites dérivées de cellules souches pluripotentes (iPSMG) dans le cerveau par voie transnasale chez des souris immunocompétentes. La méthode de préparation et de transplantation transnasale de cellules et l’administration d’un mélange de cytokines pour le maintien de l’iPSMG est présentée.

Transplantation de microglies dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans le cerveau de souris immunocompétentes par voie transnasale non invasive

Ce protocole décrit le processus de différenciation des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) en cellules de type microglie pour l’expérimentation in vitro . Nous incluons également une procédure détaillée pour générer des synaptosomes humains à partir de motoneurones inférieurs dérivés de l’iPSC qui peuvent être utilisés comme substrat pour des tests de phagocytose in vitro utilisant des systèmes d’imagerie de cellules vivantes.

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Nous décrivons un protocole permettant d’isoler les cellules microgliales de l’hypothalamus de souris (ou de petites structures cérébrales équivalentes) en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS), dans un délai relativement court. La microglie hypothalamique triée par MACS peut être utilisée pour l’analyse ex vivo et peut être utilisée pour effectuer des essais in vitro .

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Cette étude définit une nouvelle approche pour l’établissement de cellules microgliales (iMG) dérivées de monocytes humains qui permettent l’évaluation indirecte de l’inflammation cérébrale. Il s’agit d’un modèle cellulaire qui pourrait être bénéfique pour la recherche axée sur l’inflammation potentielle du cerveau et les troubles neuropsychiatriques associés.

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Apprenez à isoler des microglies primaires à partir de tissus cérébraux humains adultes avec un rendement élevé d'environ 80%. Cette méthode robuste et économique réduit la perte cellulaire pour vos recherches en neurosciences.

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