Name: Enregistrement intracellulaire in vivo des motoneurones spinaux de rat identifiés par type pendant la stimulation trans-spinale à courant direct (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Découvrez l'enregistrement intracellulaire in vivo des motoneurones spinaux de rat sous stimulation trans-spinale à courant direct. Cette méthode permet d'évaluer les propriétés membranaires et les motifs de décharge rythmique dans un système nerveux mature.

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Ces travaux ont été soutenus par la subvention du National Science Center no 2017/25/B/NZ7/00373. Les auteurs souhaitent reconnaître le travail de Hanna Drzymała-Celichowska et Włodzimierz Mrówczyński, qui ont tous deux contribué à la collecte et à l’analyse des données des résultats présentés dans cet article.

<ol><li>Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ergogenic+Effects+of+Transcranial+Direct+Current+Stimulation+on+Exercise+Performance%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance.</a> Frontiers in Physiology. 8, 90(2017).</li>
<li>Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+induces+lasting+fatigue+resistance+and+enhances+explosive+vertical+jump+performance%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance.</a> PloS One. 12 (4), 0173846(2017).</li>
<li>Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+%28tsDCS%29+selectively+inhibits+the+synaptic+efficacy+of+nociceptive+transmission+at+spinal+cord+level%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level.</a> Neuroscience. 393, 150-163 (2018).</li>
<li>Parazzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+current+density+generated+by+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+%28tsDCS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neurophysiology%3A+Official+Journal+of+the+International+Federation+of+Clinical+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS).</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).</li>
<li>Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+feasibility+and+effect+of+anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+on+chronic+neuropathic+pain+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury.</a> Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).</li>
<li>Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+spinal+direct+current+simulation+for+spasticity+therapy+following+spinal+cord+injury%3A+mechanistic+insights+contributing+to+long-term+treatment+effects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects.</a> The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).</li>
<li>de Araújo, A. V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+anodal+transcranial+direct+current+stimulation+to+improve+muscle+strength+and+motor+functionality+after+incomplete+spinal+cord+injury%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis.</a> Spinal Cord. , (2020).</li>
<li>de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+transcranial+direct-current+stimulation+with+gait+training+in+patients+with+neurological+disorders%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroengineering+and+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review.</a> Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114(2019).</li>
<li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gamma+and+alpha+spinal+motor+neurons+activity+by+trans-spinal+direct+current+stimulation%3A+effects+on+reflexive+actions+and+locomotor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity.</a> Physiological Reports. 4 (3), (2016).</li>
<li>Bolzoni, F., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+and+postsynaptic+effects+of+local+cathodal+DC+polarization+within+the+spinal+cord+in+anaesthetized+animal+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations.</a> The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).</li>
<li>Cogiamanian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+Spinal+Direct+Current+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation.</a> Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).</li>
<li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-spinal+direct+current+stimulation+alters+muscle+tone+in+mice+with+and+without+spinal+cord+injury+with+spasticity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).</li>
<li>Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+long-lasting+subcortical+facilitation+by+transcranial+direct+current+stimulation+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat.</a> The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).</li>
<li>Manuel, M., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha%2C+beta+and+gamma+motoneurons%3A+functional+diversity+in+the+motor+system%27s+final+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway.</a> Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).</li>
<li>Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+unit+recruitment+order+during+voluntary+and+electrically+induced+contractions+in+the+tibialis+anterior%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior.</a> Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).</li>
<li>Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+and+behaviour+of+motor+units+in+the+tibialis+anterior+during+voluntary+contractions%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Applied+Physiology+%3D+Revue+Canadienne+De+Physiologie+Appliquee%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions.</a> Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).</li>
<li>Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+properties+of+motoneurons+innervating+different+muscle+unit+types+in+rat+gastrocnemius%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius.</a> Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).</li>
<li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-spinal+direct+current+stimulation+modifies+spinal+cord+excitability+through+synaptic+and+axonal+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms.</a> Physiological Reports. 2 (9), (2014).</li>
<li>Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics%2C+high-frequency+oscillations%2C+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li>
<li>Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+limits+of+cathodal+transcranial+direct+current+stimulation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neurophysiology%3A+Official+Journal+of+the+International+Federation+of+Clinical+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).</li>
<li>Bączyk, M., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effects+of+direct+current+are+reproduced+by+intermittent+depolarization+of+myelinated+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers.</a> Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).</li>
<li>Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motoneuron+firing+properties+are+modified+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> Journal of Applied Physiology. 126 (5), Bethesda, Md. 1232-1241 (2019).</li>
<li>Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+modifications+of+motoneuron+firing+properties+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> European Journal of Neuroscience. , (2019).</li>
<li>Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+the+ratio+of+injected+current+to+electrode+area+tell+us+about+current+density+in+the+brain+during+tDCS%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neurophysiology%3A+Official+Journal+of+the+International+Federation+of+Clinical+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).</li>
<li>Rahman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+effects+of+acute+direct+current+stimulation%3A+somatic+and+synaptic+terminal+effects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects.</a> The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).</li>
<li>Bikson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+uniform+extracellular+DC+electric+fields+on+excitability+in+rat+hippocampal+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro.</a> The Journal of Physiology. 557, Pt 1 175-190 (2004).</li>
<li>Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+control+of+motor+outputs+by+intrinsic+and+externally+induced+electric+field+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).</li>
<li>Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-current+relationships+of+rat+hindlimb+alpha-motoneurones%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones.</a> The Journal of Physiology. 573, Pt 3 663-677 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas de conflit d’intérêts à divulguer.

S’il est exécuté correctement, la partie chirurgicale du protocole décrit doit être complétée dans un délai d’environ trois heures. Il faut prendre un soin particulier dans le maintien des conditions physiologiques stables d’un animal pendant la chirurgie, en particulier la température corporelle et la profondeur de l’anesthésie. Outre les considérations éthiques évidentes, un manque d’anesthésie appropriée peut entraîner des mouvements excessifs des membres pendant la dissection nerveuse ou laminectomie et conduire à de...

La stimulation trans-spinale à courant direct (tsDCS) gagne en reconnaissance comme méthode puissante pour modifier l’excitabilité du circuit spinal dans la santé et la maladie1,2,3. Dans cette technique, un courant constant est passé entre une électrode active située au-dessus de segments de la colonne vertébrale sélectionnés, avec une électrode de référence située soit ventrally ou plus rostrally4. Plusieurs études ont déjà confirmé que tsDCS peut être utilisé dans la gestion de certaines conditions pathologiques, telles que la douleur neuropathique5, spasticité6, lésion de la moelle épinière7 ou pour faciliter la réadaptation8. Les chercheurs suggèrent que le tsDCS évoque des altérations de la distribution des ions entre l’espace intracellulaire et l’espace extracellulaire à travers la membrane cellulaire, ce qui peut faciliter ou inhiber l’activité neuronale en fonction de l’orientation actuelle9,10,11. Cependant, jusqu’à récemment, il manquait une confirmation directe de cette influence sur les motoneurons.
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour mener l’enregistrement intracellulaire in vivo des potentiels électriques des motoneurones lombaires spinaux dans le rat anesthésié avec application simultanée de tsDCS, afin d’observer des changements dans la membrane de motoneuron et les propriétés de tir en réponse à la polarisation anodale ou cathodale du réseau neuronal spinal. Les enregistrements intracellulaires ouvrent plusieurs domaines d’investigation des propriétés des neurones, non disponibles pour les techniques extracellulaires précédemment utilisées9,12. Par exemple, il est possible de mesurer avec précision la réponse de la tension de la membrane motoneuron au flux de courant direct induit par tsDCS, d’indiquer le seuil de tension pour la génération de pointes ou d’analyser les paramètres potentiels d’action. En outre, cette technique nous permet de déterminer les propriétés de la membrane passive motoneuron, telles que la résistance aux entrées, et d’observer la relation entre le courant de stimulation intracellulaire et la fréquence de tir rythmique des motoneurons. L’identification antidromique du motoneuron enregistré, basée sur la stimulation des nerfs fonctionnellement identifiés (c.-à-d. les nerfs fournissant des efferents aux fléchisseurs ou aux extenseurs) nous permet d’identifier en outre les types d’unités motrices innervés (rapides ou lentes), ce qui donne l’occasion de tester si la polarisation influence différemment les éléments individuels du système neuronal rachidien mature. En raison d’une intervention chirurgicale étendue précédant l’enregistrement et des exigences élevées en matière de stabilité et de fiabilité des enregistrements, cette technique est très difficile, mais permet une évaluation directe et à long terme des caractéristiques électrophysiologiques d’un motoneuron : avant, pendant et après l’application de tsDCS, ce qui est crucial pour déterminer à la fois ses actions aiguës et ses effets persistants13. Comme un motoneuron active directement les fibres musculaires extrafusales14 et prend part au contrôle de rétroaction d’une contraction musculaire et a développé la force15,16 toute influence observée de tsDCS sur l’unité motrice ou les propriétés contractiles musculaires peuvent être liées à des modulations de l’excitation motoneuron ou des caractéristiques de tir.

<table><tbody><tr><td>Durgs and solutions</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Atropinum sulfuricum</td><td>Polfa Warszawa</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>346351-NaHCO3</td><td>Merck</td><td></td> <td>106329-Pancuronium</td></tr> <tr><td>Jelfa</td><td>PharmaSwiss/Valeant-Bloqueur</td><td></td> <td>neuromusculaire</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodium</td><td>Biowet Pu ?awy Sp. z</td> <td>o.o-Agent</td> <td>anesthésique principal</td></tr><tr><td>Citrate de pottasium</td><td>Chempur</td><td>6100-05-06-Tetraspan</td><td></td></tr><tr><td></td> Solution <td>Braun-HES</td><td></td><td></td></tr><tr><td><</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>strong>Matériel chirurgical--<tr><td>-21 Lame</td><td>FST</td><td>10021-00</td><td>Lame</td></tr> <tr><td>de scalpelCautériseur</td><td>FST</td><td>18010-00-Tubes</td><td></td></tr> <tr><td>thoraciques</td><td>Mila</td><td>CT1215-Dumont</td><td></td></tr> <tr><td>#4 Pince</td><td>FST</td><td>11241-30</td><td>Pince</td></tr><tr><td>musculaire Dumont #5 Pince</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>Pince Dura</td></tr><tr><td>Dumont #5F Pince</td><td>FST</td><td>11255-20</td><td>Pince nerveuse</td></tr><tr><td>Dumont #5SF Pince</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>Pince Pia</td></tr><tr><td>Pince</td><td>FST</td><td>11008-13</td><td>Pince émoussée</td></tr><tr><td>Pince</td><td>FST</td><td>11053-10</td><td>Pince à peau</td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>FST</td><td>13013-14-Rongeur</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>FST</td><td>16021-14</td><td>Pour laminectomie</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>Ciseaux à veine</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>FST</td><td>15002-08</td><td>Ciseaux Dura</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>FST</td><td>14184-09</td><td>Pour coupe de trachée</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>FST</td><td>104075-11</td><td>Ciseaux</td></tr><tr><td>musculaires Ciseaux</td><td>FST</td><td>14002-13</td><td>Ciseaux</td></tr> cutanés <tr><td>Tube trachéal</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Cathéter veineux</td> sur mesure <td>Vygon</td><td>1261.201-Pince</td><td></td></tr> à <tr><td>canulation de vaisseau</td><td>FST</td><td>18403-11</td><td>- </td></tr><tr><td>Pince pour vaisseaux</td><td>FST</td><td>18320-11</td><td>Pour le clampage veineux</td></tr><tr><td>Sonde de dilatation des vaisseaux</td><td>FST</td><td>10160-13</td><td>Pour la dissection</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> veineuse <tr><td>Matériaux sugrgiques</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Mousse gel</td><td>Pfizer</td><td>GTIN 00300090315085</td><td>Agent hémostatique</td></tr><tr><td>Suture en soie 4.0</td><td>FST</td><td>18020-40-Suture</td><td></td></tr> <tr><td>en soie 6.0</td><td>FST</td><td>18020-60</td><td>-</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Axoclamp 2B</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>abandonnés</td><td>Amplificateur intracellulaire / nouveau modèle Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>CapStar-100 Moniteur de CO2 en fin de marée</td><td>CWE</td><td>11-10000</td><td>Gaz analyseur</td></tr><tr><td>Herbe S-88</td><td>A-M</td><td>Systèmes abandonnés</td><td>Stimulateur à courant constant</td></tr><tr><td>Systèmes de couverture homéothermique avec sonde flexible</td><td>Appareil de Harvard</td><td>507222F</td><td>Système de chauffage</td></tr><tr><td>ISO-DAM8A</td><td>WPI</td><td>74020</td><td>Amplificateur extracellulaire</td></tr><tr><td>Microdrive</td><td>-</td><td>-</td><td>Sur mesure/remplacement IVM/Scientifica</td></tr><tr><td>P-1000 Microélectrode extracteur</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td>Extracteur de microélectrodes</td></tr><tr><td>SAR-830/AP Ventilateur pour petits animaux</td><td>CWE</td><td>12-02100</td><td></td></tr><tr><td>Cadre de support</td> de respirateur<td>-</td><td>-</td>Base standard de <td>laboratoire sur mesure/de remplacement 51601/Stoelting</td></tr><tr><td>Pinces vertébrales</td><td>-</td><td>-</td><td>Adaptateur de colonne vertébrale de rat sur mesure/de remplacement 51695/Stoelting</td></tr><tr><td>TP-1 DC stimulator</td><td>WiNUE</td><td>-</td><td>tsDCS stimulateur</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fort>Divers</fort></td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-1B150-4 capillaires en verre</td><td>WPI</td><td>1B150-4</td><td>Pour la production de microélectrodes</td></tr><tr><td>Coton</td><td></td> <td>--</td><td>-</td></tr> <tr><td>Tube flexible-</td><td></td><td>-Pour</td> <td>le raccordement</td></tr> <tr><td>du respirateur et de l’analyseur de CO2MicroFil</td><td>WPI</td><td>MF28G67-5</td><td>Pour le remplissage de micropipettes</td></tr><tr><td>Fil d’argent</td><td>-</td><td>-</td><td>Pour électrodes nerveuses</td></tr></tbody></table>

enregistrement intracellulaire in vivo des motoneurones spinaux de rat identifiés par type pendant la stimulation trans-spinale à courant direct

In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation

L’enregistrement intracellulaire des motoneurones spinaux in vivo fournit une « norme d’or » pour déterminer les caractéristiques électrophysiologiques des cellules dans le réseau spinal intact et détient des avantages significatifs par rapport aux techniques classiques d’enregistrement in vitro ou extracellulaire. Un avantage des enregistrements intracellulaires in vivo est que cette méthode peut être effectuée sur des animaux adultes avec un système nerveux entièrement mature, et donc de nombreux mécanismes physiologiques observés peuvent être traduits à des applications pratiques. Dans cet article méthodologique, nous décrivons cette procédure combinée avec la stimulation de courant constant appliquée à l’extérieur, qui imite les processus de polarisation se produisant dans les réseaux neuronaux spinaux. La stimulation trans-spinale à courant continu (tsDCS) est une méthode novatrice de plus en plus utilisée comme intervention neuromodulatoire en réadaptation après diverses lésions neurologiques ainsi que dans le sport. L’influence du tsDCS sur le système nerveux reste mal comprise et les mécanismes physiologiques derrière ses actions sont largement inconnus. L’application du tsDCS simultanément avec des enregistrements intracellulaires nous permet d’observer directement les changements des propriétés de la membrane du motoneuron et les caractéristiques de la cuisson rythmique en réponse à la polarisation du réseau neuronal de la colonne vertébrale, ce qui est crucial pour la compréhension des actions tsDCS. En outre, lorsque le protocole présenté inclut l’identification du motoneuron en ce qui concerne un muscle innervé et sa fonction (fléchisseur contre extenseur) ainsi que le type physiologique (rapide par rapport à lent), il fournit l’occasion d’étudier sélectivement l’influence de tsDCS sur les composants identifiés des circuits rachidiens, qui semblent être affectés différemment par la polarisation. La procédure présentée se concentre sur la préparation chirurgicale pour les enregistrements intracellulaires et la stimulation en mettant l’accent sur les étapes qui sont nécessaires pour atteindre la stabilité de préparation et la reproductibilité des résultats. Les détails de la méthodologie de l’application anodal ou cathodal tsDCS sont discutés tout en prêtant attention aux questions pratiques et de sécurité.

Les paramètres des potentiels d’action et plusieurs propriétés membranaires peuvent être calculés sur la base d’enregistrements intracellulaires lorsque des conditions stables de pénétration cellulaire sont assurées. La figure 1A présente un potentiel d’action orthodrémique typique évoqué par la stimulation intracellulaire, qui répond à tous les critères d’inclusion des données (le potentiel de membrane de repos d’au moins -50 mV, et l’amplitude des pointes supérieure à 50 mV, avec un dépass...

Ce protocole décrit l’enregistrement intracellulaire in vivo des motoneurons lombaires de rat avec la stimulation simultanée de courant direct trans-spinal. La méthode nous permet de mesurer les propriétés de la membrane et d’enregistrer le tir rythmique des motoneurons avant, pendant et après la polarisation anodale ou cathodale de la moelle épinière.

Enregistrement intracellulaire in vivo des motoneurones spinaux de rat identifiés par type pendant la stimulation trans-spinale à courant direct

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological ...

Ce protocole utilise des enregistrements intracellulaires de motoneurones rachidiens, pour étudier directement l’influence de la stimulation trans-spinale du courant direct sur la fonction des réseaux rachidiens. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’effectuer des enregistrements intracellulaires sur un système nerveux mature. Faciliter la traduction des observations expérimentales à des applications pratiques.Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de la pédale, un rat Wistar mâle anesthésié de six mois, utilisez un microscope disséquant et une lame numéro 21, pour faire une incision longitudinale de la peau du sternum au menton. Et utilisez la dissection émoussée pour exposer la veine jugulaire droite. Placez deux ligatures de 4 à 0 sous la section de la veine sans ramer les points.Et faire un nœud lâche sur l’extrémité proximale du segment veineuse. Et un nœud lâche sur l’extrémité distale du segment. Serrez la veine proximale au coeur, et ligate l’extrémité distale de la veine.Utilisez des ciseaux d’iris pour faire une incision entre la pince et la ligature distale. Et, tenant un rabat de la veine, introduire un cathéter pré-rempli au point où la veine est bloquée par la pince. Retirez ensuite la pince et poussez le cathéter plusieurs millimètres dans la veine.Pour un placement de tube trachéal, utilisez des forceps contondants pour séparer les deux glandes mandibulaires couvrant les muscles sternohyoid. Et séparez les muscles sternohyoid à la ligne médiane, pour exposer la trachée. Placez trois ligatures de 4 à 0 sous la trachée et faites deux nœuds sous le point d’insertion du tube trachéal et un nœud au-dessus.Puis insérez un tube trachéal dans la trachée sous le troisième cartilage trachéal. Et fixez le tube en place avec les ligatures pré-préparées. Pour disséquer les nerfs des membres postérieurs, utilisez une lame numéro 21 pour faire une coupure longitudinale sur le côté postérieur du membre postérieur du membre arrière gauche, du tendon d’Achille à la hanche.Et utilisez des ciseaux pour faire une coupe entre les régions antérieures et postérieures de la fossa popliteal, à l’arrière de l’articulation du genou. Couper deux têtes du biceps femoris, pour exposer le nerf sciatique. Et séparer la tête latérale de la tête médiale du muscle gastrocnemius, pour exposer le nerf tibial et ses branches.Ensuite, utilisez le nombre 55 forceps, pour disséquer soigneusement le gastrocnemius médial et le gastrocnemius latéral et les nerfs soleus. Les déconnecter des tissus environnants tout en maintenant leur connexion avec les muscles respectifs. Pour effectuer la laminectomie, utilisez une lame numéro 21 pour faire une incision longitudinale du sacrum jusqu’aux vertèbres thoraciques.Et identifier la vertèbre Th13, comme un segment thoracique le plus bas avec une insertion de nervures. Ensuite, utilisez des rongeurs fins pour enlever les processus épineux et laminae du Th13 aux vertèbres L2, pour exposer les segments lombaires de la moelle épinière. Pour fixer la colonne vertébrale, placez le rat dans un cadre sur mesure sur un coussin chauffant de 37 degrés Celsius, relié à un système de chauffage en boucle fermée.Et utilisez les volets cutané pour former une piscine profonde au-dessus de la moelle épinière exposée. Placez les pinces métalliques sous les procédés transversaux Th12 et les procédés épineux L3 et remplissez la piscine d’huile minérale de 37 degrés Celsius. Utilisez les volets cutanés pour faire une piscine profonde d’huile minérale sur les nerfs tibial, médials et gastrocnemius latéral et soleus.Et placez les nerfs sur le fil d’argent bipolaire stimulant les électrodes. Connectez ensuite les électrodes à un stimulateur d’impulsion carrée à l’aide de canaux de stimulation distincts pour chaque nerf. Pour un placement d’électrode de surface, sous le microscope disséquant, placez une électrode de boule d’argent sur le côté caudal gauche de la moelle épinière exposée.Avec une électrode de référence insérée dans les muscles du dos. Et connectez les deux électrodes à l’amplificateur différentiel DC. Utilisez un stimulateur à courant constant pour stimuler le gastrocnemius médial et les nerfs gastrocnemius et soleus latériaux, avec des impulsions carrées d’une durée de 0,1 milliseconde répétées à une fréquence de trois hertz et observez les volées afferentes.À la fin de la simulation, déplacez l’électrode de surface de façon rostrale et répétez la stimulation pour identifier les segments rachidiens auxquels les amplitudes des volées sont les plus élevées pour chaque nerf. Après avoir déterminé l’emplacement de la volée maximale, livrer un bloqueur neuromusculaire par voie intraveineuse pour paralyser le rat. Tandis qu’un assistant relie le tube trachéal à un ventilateur externe en ligne avec un nominateur compatible de chapeau de rongeur.Pour ouvrir le dura et le pia mater, utilisez le nombre 55 forceps pour soulever doucement le dura mater, et coupez le tissu caudally du segment L5, rostrally jusqu’au segment L4. Ensuite, utilisez une paire de forceps 5SF ultra minces, pour faire une petite tache dans le pia, couvrant la colonne dorsale entre les vaisseaux sanguins. Exactement au niveau de la volée maximale afferent de la gastrocnemius médiale et gastrocnemius latéral et nerf soleus.Pour placer les électrodes de stimulation à courant direct trans-spinal, placez une éponge saline trempée sur le côté dorsale des vertèbres Th12. Et utilisez la manipulation fine pour appuyer sur l’éponge avec une électrode active de stimulation de courant direct trans-spinal. Montez ensuite une microélecrode mise en commun personnalisée, sur le micro manipulateur, permettant un mouvement de pas d’un à deux microns et un étalonnage stéréotaxique.Et conduire une pointe de micropipette dans un patch sélectionné dans le pia, à un angle latéral médial de 15 à 20 degrés. Pour enregistrer la membrane motoneurone et les propriétés de cuisson, en mode pont de l’amplificateur intracellulaire, stimuler les branches nerveuses respectives pour identifier le motoneuron sur la base de l’apparence tout ou rien, du potentiel d’action antidromique. Dans le mode de pince actuelle discontinue de l’amplificateur intracellulaire avec un mode de vitesse de commutation actuel de quatre à huit kilohertz, utilisez un courant dépolarisant intracellulaire de 0,5 milliseconde, pour évoquer un potentiel d’action orthodontique, dans le motoneuron.Pour calculer la résistance à l’entrée cellulaire, stimulez un motoneuron, avec 40 courtes impulsions de 100 millisecondes de courant hyperpolarisant d’un nanogramme. Pour déterminer la valeur de base réelle comme amplitude minimale du courant dépolarisant nécessaire pour obtenir un seul pic, stimulez un motoneuron avec des impulsions d’ondes carrées de 50 millisecondes à des amplitudes croissantes. Injectez ensuite des impulsions d’ondes carrées de 500 millisecondes de courant dépolarisant, à des amplitudes croissantes.En 0,1 à deux étapes d’ampli nano, pour évoquer les décharges rythmiques des motoneurones. Pour une stimulation trans-spinale de courant direct, commencez les procédures de polarisation par application trans-spinale du courant direct, tout en maintenant une pénétration stable du motoneuron. Ici, un potentiel typique d’action orthotrope, évoqué par la stimulation intracellulaire qui répond à tous les critères d’inclusion des données est montré.Dans cette analyse, une réponse cellulaire à une impulsion actuelle hyperpolarisante de 100 millisecondes d’un nanogramme. À partir de laquelle la résistance d’entrée de crête et de plateau d’un motoneuron, peut être déterminée à partir de la déviation de tension, peut être observée. Cette trace de tension élargie d’un pic de base réel, présente un seuil de tension clairement marqué de la pointe.Indiquant le niveau de dépolarisation membranaire auquel les canaux de sodium fermés par tension sont activés pour initier le potentiel d’action. Ces graphiques fournissent des exemples de traces de tension intracellulaire. De deux motoneurones, stimulés intracellulairement avec des impulsions carrées de 500 millisecondes de courant dépolarisant.Avant, pendant et après une application de stimulation trans-spinale à courant direct. La stimulation directe trans-spinale anodale de courant s’est trouvée pour agir vers une excitabilité accrue de motoneuron et des fréquences plus élevées de tir rythmique. Tandis que la stimulation directe trans-spinale cathodale de courant, a agi à l’inhibition de tir.En outre, les effets des deux types de stimulation trans-spinale de courant direct, ont survécu à la période de polarisation. Des données inexactes peuvent être acquises, si les critères d’inclusion des données sont compromis en raison de la pénétration imparfaite des cellules. Un défaut de compenser la résistance et la capacitance des microélecrodations ou une instabilité de la moelle épinière.Il est impératif qu’aucun dommage n’est fait à la moelle épinière pendant la dissection car les dommages peuvent avoir comme conséquence le choc spinal, rendant d’autres enregistrements impossibles. Il est possible de prélever des échantillons de tissus pour une analyse chimique histologique ou immunométologique. Par exemple, la mesure de l’expression c-fos peut être utilisée comme un proxy de l’activité neuronale.

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Enregistrement intracellulaire in vivo des motoneurones spinaux de rat identifiés par type pendant la stimulation trans-spinale à courant direct (Vidéo) | JoVE Journal

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