Amélioration de la méthode UPLC-UV pour la quantification de la vitamine C dans les variétés delaitue (Lactuca sativa L.) et Crop Wild Relatives(Lactuca spp.)

La vitamine C est un indicateur de la valeur nutritive des fruits et légumes. Nous avons besoin d’une méthode facile et fiable pour la quantifier, en particulier dans la laitue, le légume feuilux le plus consommé dans le monde. Cette méthode prévient la dégradation de la vitamine C, et fournit une extraction améliorée et une quantification rapide et fiable des acides ascorbiques et déshydroascorbiques, grâce à sa précision et sa sensibilité.

Cette méthode peut être utilisée dans la technologie alimentaire pour créer des étiquettes de faits nutritionnels, en médecine pour étudier les effets des aliments sur la santé et dans la sélection des plantes, afin d’augmenter la teneur en vitamine C chez différentes espèces. Jose Angel Aranjuelo et Arantzazu Castellanos, deux analystes de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure avec Ines Medina Lozano. Pour préparer les échantillons de plantes, récoltez au moins une feuille externe et une feuille intérieure par plante et congelez immédiatement les feuilles dans de l’azote liquide, avant de les placer dans un entrepôt de moins 80 degrés Celsius.

Pour lyophiliser les échantillons de plantes congelées, placez les tubes d’échantillon non plafonnés sur les plateaux dans la chambre de sécheuse du lyophilisateur et programmez le lyophilisateur tel qu’indiqué. Maintenir la température du condenseur à moins 80,2 degrés Celsius, et la constante du vide à 112 Lorsque le matériau est complètement sec, ajouter des boules d’acier inoxydable de 10 millimètres de diamètre aux échantillons lyophilisés, dans des tubes en polypropylène de 20 millilitres. Et utilisez un vortexer multi-tube, au moment et à l’intensité appropriés, pour moudre les échantillons dans une poussière fine.

Pour préparer des solutions standard et de dilution de l’acide ascorbique, pesez exactement 10 milligrammes d’acide ascorbique standard sur un équilibre de précision. Et à 90 millilitres de phase mobile à l’échantillon. Utilisez un agitateur magnétique pour dissoudre l’échantillon et utilisez un flacon volumétrique pour mesurer avec précision 100 millilitres de la solution qui en résulte.

Ajout d’eau ultrapure supplémentaire, acidifiée au pH 2 avec de l’acide formique, si nécessaire. Ensuite, préparez cinq dilutions du stock, pour obtenir une courbe d’étalonnage. En travaillant sous une faible intensité lumineuse, ajouter un échantillon de sol lyophilisé de 50 milligrammes et cinq millilitres de solvant d’extraction, à un tube de centrifugeuse en polypropylène de 15 millilitres et vortexer la solution pendant cinq secondes.

Après avoir secoué l’échantillon pendant 10 minutes sur un shaker orbital à 2000 révolutions par minute, transférer le tube dans un bain ultrasonique pendant 10 minutes, à température ambiante et recueillir l’échantillon par centrifugation. Puis filtrer le supernatant à travers un filtre à cellulose régénéré de 0,22 micron, dans un flacon d’ambre de cinq millilitres, pour extraire les acides ascorbiques et déshydroascorbiques dans l’extrait un. Pour préparer la dilution pour déterminer la concentration d’acide ascorbique dans les échantillons de feuilles, ajouter 200 microlitres d’extrait un, et 800 microlitres d’eau ultrapure dans un flacon de chromatographie liquide ambrée de deux millilitres, et fermer le flacon avec un bouchon PTFE/silicone.

Pour l’extraction totale de l’acide ascorbique, transférer 200 microlitres de l’extrait un, dans un flacon de chromatographie liquide ambrée de deux millilitres, et ajouter 200 microlitres de solution réducteur au flacon. Fermez le flacon avec une prise et vortex la solution pendant cinq secondes. Après une incubation de 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière, utilisez 200 microlitres d’acide sulfurique molaire de 0,4 molar, pour arrêter la réaction et stabiliser l’acide ascorbique, à un pH acide.

Pour préparer la dilution pour déterminer la concentration totale d’acide ascorbique dans les échantillons, ajouter 400 microlitres d’eau ultrapure, au total extrait d’acide ascorbique deux. Fermez le flacon à l’aide d’une prise. Au moins une heure avant le début de l’expérience, confirmez que toutes les solutions de travail ont été chargées dans le système UPLC et allumez les trois modules UPLC.

Lorsque le processus d’étalonnage interne est terminé, ouvrez le logiciel et chargez le programme instrumental. Une fois le logiciel chargé, cliquez sur Quaternary Solvent Manager et cliquez sur le bouton de la souris droite pour sélectionner la console de lancement, pour accéder à la console de gestion UPLC. Cliquez sur Système, Contrôle et Démarrage, pour procéder à la préparation et à la stabilisation de l’instrument UPLC, et cliquez sur Solvants Prime, QSM, vérifiez A, B, C, D, Seal Wash et Duration of Prime, plus de cinq minutes, pour purger toutes les lignes UPLC, pendant au moins cinq minutes.

Cliquez sur SM, vérifiez Wash Solvent plus de 45 secondes. Vérifiez purge solvant, et 35 cycles pour purger et nettoyer l’injecteur. Pour équilibrer l’UPLC aux conditions de méthode, vérifiez equilibrate à la méthode et QSM, et réglez le flux à 0,3 millilitres par minute.

Solvant A à 2%solvant B à 0%solvant C 98%et solvant D à 0%Encore en équilibre à méthode et SM et définir l’échantillon à 5 degrés Celsius, et la colonne à 30 degrés Celsius. Toujours dans Equilibrate to Method and Other, sélectionnez Lampe allumée et cliquez sur Démarrer. Laissez l’équipement se stabiliser pendant au moins une heure.

Pour vérifier la stabilité, cliquez sur Launch Console System et QSM et sélectionnez QSM System Pressure, uniquement pour vérifier la pression dans la colonne. S’il n’y a pas de tendances identifiables dans les changements de pression, et que la valeur delta est inférieure à 10 livres par pouce carré de pression, dans l’écran de démarrage rapide, remplissez la matrice avec les noms des normes et des échantillons à analyser. Pour déterminer la concentration d’acide ascorbique dans les normes, injectez cinq microlitres de chaque dilution dans l’instrument UPLC, et effectuez la chromatographie, à partir de la plus diluée, à la solution la plus concentrée comme indiqué dans le tableau.

Pour déterminer l’acide ascorbique et la concentration totale d’acide ascorbique dans les échantillons de feuilles, injectez cinq microlitres de l’extrait dilué un et en extrayez deux respectivement, dans l’instrument UPLC pour l’analyse chromatographic. Pour calculer l’acide ascorbique et les concentrations totales d’acide ascorbique, dans le logiciel cliquez sur Quickstart, Browse Project, Channels, le nom de la norme ou l’échantillon et le canal PDA un, 245 nanomètres à 1,2 nanomètres. Pour ouvrir les chromatogrammes standard et échantillon, cliquez sur le point de départ du chromatogramme et faites-le glisser jusqu’au point final, pour intégrer le pic correspondant dans les normes et les échantillons.

Ensuite, utilisez les données des dilutions standard de l’acide ascorbique, pour construire une courbe d’étalonnage, pour représenter les valeurs d’absorption chromatographiquement déterminées et interpoler les valeurs d’absorption de l’échantillon, pour obtenir l’acide ascorbique et la concentration totale d’acide ascorbique, selon la formule. La quantification de la vitamine C dans les matrices de Lactuca, nécessite le développement d’une approche chromagraphique qui peut assurer des résultats fiables. Ici, un chromatogramme résultant d’une présentation de protocole non optimisé et d’un pic d’acide ascorbique, ainsi qu’un non identifié à l’épaule du mineur peuvent être observés.

Néanmoins, après avoir amélioré les conditions d’extraction et chromatographiques, un pic d’acide ascorbique résolu sans interférences de composés inconnus peut être atteint. En outre, l’utilisation de l’équipement ultraviolet UPLC, au lieu de HPLC ultraviolet, réduit la rétention et les temps de fonctionnement. Les interférences dans les pics d’acide ascorbique, entraînent constamment une sous-estimation de la teneur en vitamine C, en raison d’une séparation insuffisante pendant le processus chromatographique.

Comme les zones de pointe qui se chevauchent sont intégrées par une chute verticale au point le plus profond entre elles. En outre, l’utilisation d’un protocole non optimisé empêche l’extraction de toute conclusion utile, à partir des résultats. Comme tous les échantillons semblent avoir une teneur similaire en vitamine C, sous l’une de ses formes.

En revanche, l’utilisation du protocole optimisé permet la détection de différences statistiquement significatives entre les différents types d’échantillons. Assurez-vous de recueillir plusieurs échantillons, de préserver correctement les échantillons, de minimiser l’exposition de l’échantillon aux agents oxydants et de quantifier les deux formes de vitamine C.La teneur totale en vitamine C peut être quantifiée non seulement chez n’importe quelle espèce végétale, mais aussi, dans n’importe quel fruit dans n’importe quel fruit et légume, ou même les aliments transformés avec peu de modifications techniques.