Différenciation et caractérisation des progéniteurs neuronaux et des neurones à partir de cellules souches embryonnaires de souris

En plus du protocole de différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en cellules neuronales, nous montrons également un ensemble d’expériences qui peuvent analyser de manière exhaustive le processus de différenciation. Ces techniques sont pertinentes pour le développement embryonnaire ectodermique précoce, offrant aux chercheurs des options pour analyser la différenciation des cellules neuronales. Lors de cette procédure, il est essentiel de commencer avec des cellules souches dans un état optimal.

Il est donc important que les EB, les MPC et les neurones soient cultivés dans des milieux frais et optimaux. La démonstration visuelle de ce protocole est importante, car il contient des détails infimes qui peuvent affecter son succès et son efficacité, en particulier la partie différenciation. Commencez par mettre en place une culture cellulaire en goutte suspendue.

Pour une plaque de culture cellulaire de 10 centimètres, ajustez la concentration à 500 cellules par 20 microlitres de milieu de différenciation. Préparez suffisamment de suspension cellulaire pour 50 gouttelettes de 20 microlitres. À l’aide d’une micro-pipette ou d’une pipette à répéteur, placez des gouttelettes de 20 microlitres de suspension cellulaire sur le couvercle d’une plaque de culture tissulaire, en veillant à ce que les gouttelettes ne soient pas trop proches les unes des autres, afin d’éviter qu’elles ne fusionnent.

Remplissez l’assiette de cinq à 10 millilitres de PBS et remettez soigneusement le couvercle sur l’assiette. Incuber la culture dans l’incubateur à 37 degrés Celsius. Après deux jours, collectez les gouttelettes du couvercle et placez-les dans une plaque de suspension de culture cellulaire de 10 centimètres remplie de 10 millilitres de milieu de différenciation, puis placez la plaque sur un agitateur orbital réglé à basse vitesse dans l’incubateur.

Après deux jours supplémentaires, centrifugez les cellules à 200 fois G pendant trois minutes et retirez le surnageant. Pour induire la différenciation du corps embryoïde en cellules progénitrices neurales, réintroduisez les cellules dans un milieu de différenciation avec de l’acide rétinoïque à cinq micromolaires. Incuber la plaque pendant deux jours, puis remplacer la moitié minimale du milieu par du milieu frais, en inclinant la plaque et en la pipetant.

Collectez les cellules deux jours plus tard en les centrifugeant à 200 fois G pendant trois minutes et en retirant le surnageant. Fixez les corps embryoïdes et les cellules progénitrices neurales avec 4 % de PFA dans du PBS pendant 30 minutes à température ambiante. Retirez ensuite le PFA et lavez les cellules dans du PBS pendant cinq minutes.

Incuber les cellules en série dans des solutions de PBS 10, 20 et 30 % de saccharose, à une température de 25 à 28 degrés Celsius, chaque incubation durant 30 minutes ou plus jusqu’à ce que les cellules se déposent au fond du tube. Et utilisez-le pour transférer l’échantillon au centre d’un cryomoule, en pipetant l’excès de liquide. Ajoutez soigneusement la température de coupe optimale ou la solution OCT dans le moule, sans remettre l’échantillon en suspension, puis retirez les bulles excessives à l’aide d’une pipette.

Placez le moule avec l’échantillon sur un mélangeur de laboratoire à basse vitesse pendant 15 minutes, ce qui déposera les corps embryoïdes et les cellules progénitrices neurales au fond de la solution OCT. Ensuite, congelez rapidement l’échantillon en plaçant le moule dans de l’azote liquide. Bloquez des sections OCT ou des chambres de culture contenant des neurones dans 10 % de sérum d’âne normal et 0,1 % de Triton X-100 dans du PBS pendant une heure à température ambiante.

Ensuite, incubez les échantillons dans de l’anticorps primaire, dilué dans 5 % de sérum d’âne normal, et 0,05 % de Triton X-100 dans du PBS, à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, laver les échantillons dans du PBS avec 0,1 % de Triton X-100 trois fois pendant cinq minutes par lavage. Incuber avec de l’anticorps secondaire, dilué dans 5 % de sérum d’ânesse normal, et 0,05 % de Triton X-100 dans du PBS, pendant une heure à température ambiante.

Répétez les lavages dans Triton X-100 et PBS, puis incubez l’échantillon dans un DAPI d’un microgramme par millilitre. Montez l’échantillon à l’aide d’une lamelle et d’un peu de support de montage, laissez-le sécher et imagez-le avec un microscope à fluorescence. Pour effectuer la différenciation des neurones, les cellules E14 ont été cultivées sur des fibroblastes embryonnaires de souris irradiés aux rayons gamma jusqu’à ce que la population de fibroblastes se dilue.

La pluripotence des cellules E14 a été confirmée par coloration à la phosphatase alcaline. Après la différenciation, les corps embryonnaires avaient une forme ronde dont la taille augmentait continuellement. Au 10e jour, les cellules progénitrices neurales se différenciant en neurones avaient une forme cellulaire allongée.

Des expériences d’immunofluorescence ont été réalisées sur des cellules progénitrices neurales au huitième jour et sur des neurones au 12e jour. Une coloration positive a été observée pour l’imbrication dans les cellules progénitrices neurales et pour les neurofilaments dans les neurones. Une lignée de cellules souches embryonnaires de souris exprimant un rapporteur GFP piloté par le promoteur Sox1 a été différenciée, et la cytométrie en flux a été réalisée sur les cellules souches embryonnaires et les cellules progénitrices neurales.

Il a été constaté que 58,7 % du total des cellules au stade NPC sont positives à la GFP, tandis que 0 % sont positives à la GFP au stade ESC. Des expériences de séquençage d’ARN ont été réalisées sur des cellules souches embryonnaires E14, des corps embryoïdes et des cellules progénitrices neurales. Les gènes de la carte thermique de la séquence d’ARN ont été triés en fonction de leurs niveaux d’expression.

L’analyse de l’ontologie génétique des quatre groupes de gènes a montré qu’ils correspondent à des fonctions ou des voies cellulaires distinctes. Lors de l’exécution de ce protocole, l’EBS doit apparaître sous la forme de masses sphériques de cellules noircies. Pour vous assurer que EBS se développe avec un tel tel, changez le milieu le premier jour, si le milieu commence à devenir jaunâtre.

La même approche est importante pour la culture des MPC, car les EB et les MPC sont à un stade critique du développement embryonnaire précoce. D’autres tests génomiques fonctionnels, tels que ChIPseek et les tests de capture de confirmation de la chromatine à partir des différentes étapes de la différenciation neuronale, peuvent être effectués pour comprendre les processus biologiques sous-jacents. L’intégration par des tests de génomique chimique et fonctionnelle dans le processus de différenciation des neurones permet aux chercheurs de mieux délimiter les mécanismes moléculaires du développement embryonnaire précoce.