Name: Visualisation de l’ADN Réparation des protéines Interaction par immunofluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Découvrez l'immunofluorescence indirecte pour visualiser les interactions des protéines de réparation de l'ADN dans les cellules HeLa. Cette méthode permet d'analyser la formation des foci protéiques et la colocalisation après irradiation.

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Ce travail a été soutenu par une subvention de la San Antonio Area Foundation. Le Mays Cancer Center est soutenu par NCI cancer center support core grant P30 CA054174. Nous tenons à remercier Stephen Holloway pour son aide à l’approvisionnement des réactifs, et le laboratoire Sung pour fournir l’espace et la capacité de microscopie.

1. Culture cellulaire HeLa
<ol><li>Prétraiter les couvercles ronds en verre de 1 M HCl à 50 °C pendant 16-18 heures. Rincer avec ddH2O et conserver dans 100% EtOH.</li>
	<li>Préparer le milieu de culture cellulaire : ajouter 10 % (v/v) FBS au milieu DMEM.</li>
	<li>Cultiver 4,0 x 104 cellules/puits dans une plaque stérile de 12 puits avec une couverture en verre rond de 18 mm à 37 °C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié. Développer les cellules à 80% de confluence (environ 24 heures).</li>
</ol>2. Traitement cellulaire par rayonnement (IR)
<ol><li>Pour induire la formation de ruptures à double brin, exposez les cellules à 4 Gy γ-irradiation (contrôle : Pas d’irradiation, t=0). Dans la cellule Gamma -40, cela correspond à 4,54 min, à 0,815 Gy par min.</li>
	<li>Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié pour la durée appropriée (points de temps choisis ici t=1, 2, 4, 16 h).</li>
</ol>3. Extraction nucléaire et fixation cellulaire
<ol><li>Préparer des solutions de stock : 0,2 M PIPES (pH 6,8), 5 M NaCl, 2 M de saccharose, 1 M MgCl2, 0,1 M EGTA (pH 8,0).</li>
	<li>Préparer un tampon d’extraction nucléaire (NEB): dissoudre 10 mM PIPES (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM saccharose, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA (pH 8.0) et 0,5% (v/v) Triton X-100 en ddH2O. Mix jusqu’à dissolution complète.</li>
	<li>Préparer 4% (v/v) paraformaldéhyde (PFA): dissoudre 10 mL de 16% PFA solution aqueuse dans 30 mL PBS. Mélanger jusqu’à dissolution complète.</li>
	<li>Au moment opportun (t=0, 1, 2, 4, 16 h), laver les cellules deux fois avec 1 mL de PBS. Retirez complètement PBS.</li>
	<li>Ajouter 200 μL d’ONÉ à chaque puits pour l’extraction des noyaux cellulaires (le cytoplasme est dégradé, il ne reste que le noyau) (figure 2). Incuber pendant 2 minutes à température ambiante et retirer complètement. REMARQUE : Ne dépassez pas 2 minutes.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61447/61447fig02.jpg"> Figure 2 : Extraction nucléaire. Images représentatives des cellules avant (à gauche) et post (droite) extraction nucléaire. Le cytoplasme doit être digéré, mais la structure nucléaire doit rester intacte après l’extraction (à droite). (A) grossissement 20x; barre d’échelle = 20 μm et (B) 40x grossissement; barre d’échelle = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61447/61447fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<ol start="6"><li>Laver les cellules avec 1 mL de PBS. Retirez complètement PBS. Ajoutez PBS soigneusement, les cellules sont très fragiles à cette étape.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de 4 % (v/v) PFA à chaque puits pour la fixation cellulaire. Incuber pendant 10 minutes à 4 °C. Retirez complètement la PFA.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de PBS. REMARQUE : Les cellules peuvent être stockées dans pbs à 4 °C.</li>
</ol>4. Coloration d’immunofluorescence
<ol><li>Préparer la solution de blocage : dissoudre 5 % de BSA (w/v) dans PBS et ajouter 0,3 % (v/v) Triton X-100. Mélanger jusqu’à dissolution complète.</li>
	<li>Préparer la tampon de dilution : dissoudre 1 % de BSA (w/v) dans pbs et ajouter 0,3 % (v/v) Triton X-100. Mélanger jusqu’à dissolution complète.</li>
	<li>Pour le blocage, ajoutez 200 μL de solution de blocage à chaque puits. Incuber pendant 2 heures à température ambiante ou 16-18 heures à 4 °C. REMARQUE : Si l’anticorps de chèvre est utilisé, ajoutez 5 % de sérum de chèvre à la solution de blocage.</li>
	<li>Diluer l’anticorps primaire dans le tampon de dilution (1:500; voir tableau 2 pour la liste des anticorps) et vortex jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé. REMARQUE : Si l’anticorps de chèvre est utilisé, ajoutez 1% de sérum de chèvre au tampon de dilution.</li>
	<li>Dans une boîte d’humidité/incubation, adhérez à un morceau de parafilm. Ajouter 10 μL d’anticorps primaires (en une seule goutte). Aligner un bord du couvercle avec la goutte et baisser lentement sur le parafilm, pour que le liquide se répande tout au long (éviter les bulles si possible). Incuber pendant 2 heures à température ambiante.</li>
	<li>Laver les couvercles trois fois dans PBS pendant 1 minute.</li>
	<li>Diluer l’anticorps secondaire dans le tampon de dilution (concentration finale : 2 μg/mL) et vortex jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé.</li>
	<li>Appliquer 10 μL d’anticorps secondaires tels que décrits pour les anticorps primaires. Incuber pendant 2 heures à température ambiante. REMARQUE : Protégez-vous de la lumière.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Anticorps</td>
			<td>Société</td>
			<td>Référence</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
<tr>
<td>53BP1</td>
			<td>Signalisation cellulaire</td>
			<td>4937</td>
			<td>Lapin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-Mouse IgG H&amp;L (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150103</td>
			<td>Âne</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-phospho-Histone H2A. X (Ser139), clone JBW301</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td>Souris</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-Rabbit IgG H&amp;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150081</td>
			<td>Chèvre</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Anticorps utilisés. Liste des anticorps utilisés dans cette étude.
<ol start="9"><li>Laver les couvercles trois fois dans PBS pendant 1 minute.</li>
	<li>Laver les couvercles avec H2O pendant 1 minute.</li>
	<li>Contrestain DE L’ADN avec DAPI : appliquer 10 μL de 300 nM DAPI (comme décrit pour les anticorps), incuber pendant 30 minutes à température ambiante, puis monter sur une lame de verre avec un milieu de montage à base de glycérol. Sinon, ajoutez une goutte (10 μL) de support de montage antifade commercial contenant du DAPI sur une diapositive et appliquez un couvercle. Appuyez doucement sur le couvercle et retirez l’excès de liquide autour de lui avec une serviette en papier.</li>
	<li>Sceller les couvercles avec du vernis à ongles transparent et les laisser sécher pendant 20 minutes.</li>
	<li>Stockez les diapositives à 4 °C.</li>
</ol>5. Acquisition d’images
<ol><li>Placez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif 60x. Utilisez DAPI pour localiser les noyaux à travers un morceau d’œil.<ol>
<li>Pour l’acquisition d’images XYZ, logiciel d’acquisition ouverte et certains paramètres : Type de scanner : Galvano ; Mode scanner : Aller-retour; Taille de l’image: 512×512; Mode PMT: VBF; Moyenne pmt : cadre (4 fois); Analyse séquentielle PMT : ligne.</li>
		<li>Sélectionnez le colorant et les détecteurs : Canal (CH1), Colorant (DAPI), Détecteur (SD1) Canal (CH2), Colorant (Alexa Fluor 488), Détecteur (HSD3) Canal (CH3), Colorant (Alexa Fluor 647), Détecteur (HSD4)</li>
		<li>Sélectionnez ON dans « Z ».</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajustez l’image en direct. Appuyez sur le bouton En direct de la fenêtre En direct.<ol>
<li>Ajuster la mise au point et définir l’intensité laser (%), la sensibilité (HV), le gain et le décalage sur la fenêtre d’outils « PMT ».<ol>
<li>Ajuster l’intensité laser (%): pour la luminosité et le blanchiment. Plus l’intensité laser est élevée, plus le signal est fort, mais le spécimen se photoblera.</li>
			<li>Ajuster la sensibilité (HV): niveau de bruit. Plus le HV est élevé, plus le signal est fort, mais l’image sera bruyante si elle est trop haute. REMARQUE : Maintenez toujours la tension constante.</li>
			<li>Ajuster le décalage : niveau d’arrière-plan.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sélectionnez Démarrer/Fin (15 tranches) pour les piles Z.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Démarrer l’acquisition.<ol>
<li>Sélectionnez le dossier pour enregistrer des images. Appuyez sur le bouton Démarrer LSM pour commencer à acquérir l’image. Appuyez sur le bouton Série Done pour compléter l’acquisition d’image.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Analyse des données
<ol><li>Pour l’analyse d’image, ouvrez le logiciel d’analyse.<ol>
<li>Appuyez sur la fenêtre de l’outil Batch, sélectionnez les images à analyser et sélectionnez le dossier de sortie.</li>
		<li>Appuyez sur la fenêtre de l’outil Analyse et sélectionnez Projection (affichez la projection d’intensité maximale à partir de 15 tranches).</li>
		<li>Sous Paramètre Entrée/Sortie, sélectionnez le lot créé.</li>
		<li>Appuyez sur Processus pour que les images soient traitées.</li>
		<li>Exporter des images sous forme de fichiers .tiff.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour la quantification des foyers nucléaires, ouvrez CellProfiler.<ol>
<li>Ouvrez le pipeline de quantification γH2AX et 53BP1 foyers (voir Informations supplémentaires).</li>
		<li>Graphiques à l’aide d’un logiciel de table.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour l’analyse de co-localisation, ouvrez CellProfiler.<ol>
<li>Ouvrez le pipeline colocalisation (voir Informations supplémentaires). Un fichier de feuille de calcul sera créé et enregistré à l’emplacement préféré. Toutefois, les graphiques eux-mêmes ne seront pas automatiquement enregistrés. Il est suggéré de prendre un instantané des fenêtres pour garder pour enregistrer les résultats.</li>
		<li>Graphiques à l’aide d’un logiciel de table.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+and+human+health%3A+the+roles+of+BRCA1%2C+BRCA2%2C+and+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), 016600(2015).</li>
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<li>Dray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+enhancement+of+the+meiotic+DMC1+recombinase+by+RAD51+associated+protein+1+%28RAD51AP1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for enhancement of the meiotic DMC1 recombinase by RAD51 associated protein 1 (RAD51AP1).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (9), 3560-3565 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à révéler.

L’analyse du moment et de l’efficacité de la réparation des dommages à l’ADN par microscopie s’est avérée essentielle pour comprendre le fonctionnement de la machinerie de réparation de l’ADN, dans les cellules normales et dans les pathologies humaines telles que le cancer.
Le développement d’anticorps spécifiques qui permettent la détection de protéines activées dans leur version phosphorylé (tels que γH2AX, pRPA, pRAD50 et autres10,23</sup...

Les cellules humaines sont constamment exposées à une variété d’agents d’ADN endommageant de diverses origines. Les sources exogènes consistent principalement en l’exposition aux radiations, aux produits chimiques (y compris les agents chimiothérapeutiques et certains antibiotiques) et aux virus, tandis que les principales sources endogènes comprennent des erreurs dans la réplication de l’ADN et le stress oxydatif. Les effets directs de l’exposition génotoxique peuvent aller d’une base modifiée à une rupture potentiellement mortelle à double brin d’ADN (DSB), selon le stress et la dose d’exposition. En fin de compte, les dommages non réparés ou mal réparés à l’ADN peuvent entraîner l’accumulation de mutations, les réarrangements génomiques, l’instabilité du génome et éventuellement conduire à la carcinogenèse1. Les cellules de mammifères ont développé des voies complexes pour reconnaître des types spécifiques de dommages à l’ADN2,3 et les réparer en temps opportun, synchronisés avec la progression du cycle cellulaire.
Le rayonnement ionisant (IR) endommage la double hélice de l’ADN et crée des ruptures à double brin (DSB), l’une des formes les plus nocives de dommages à l’ADN. Le complexe MRN (MRE11, RAD50, NBS1) fonctionne comme un capteur d’ADN se termine et active la protéine kinase ataxie telangiectasia muté (ATM)4,5. Suite à l’activation initiale de l’ATM par les extrémités de l’ADN, ATM déclenche une cascade d’événements DDR sur le site de la pause, initiant avec un événement clé, la phosphorylation de la variante histone H2AX6. La phosphorylation H2AX sur les résidus S139 l’active en γH2AX, couvrant les régions jusqu’à des mégabases autour de la lésion de l’ADN6,7,8,9. Cet événement augmente l’accessibilité de l’ADN, conduisant au recrutement et à l’accumulation d’autres protéines de réparation d’ADN7. Étant donné que γH2AX est abondamment et spécifiquement induit par les DSB environnants, il peut être facilement visualisé à l’aide d’anticorps spécifiques, et est couramment utilisé comme marqueur de substitution pour les DSB dans le domaine de la réparation de l’ADN. Une fois la rupture signalée, les cellules activent leurs voies de réparation de l’ADN et traitent les dommages causés par l’ADN. La protéine MDC1 (mediator de la protéine de point de contrôle des dommages de l’ADN 1) lie directement γH2AX10, interagit avec atm11 et aussi avec NBS112,13. Il contribue à accroître la concentration du complexe MRN à l’ORD et à lancer une boucle de rétroaction positive aux guichets automatiques. γH2AX est rapidement enlevé une fois la rupture réparée, ce qui permet la surveillance du dégagement d’ORD. Suivie d’une microscopie, la diminution du γH2AX au fil du temps fournit une mesure indirecte des ruptures résiduelles et de l’efficacité de la réparation de l’ADN.
Les cellules eucaryotes peuvent réparer les DSB par plusieurs voies, les deux principales étant l’assemblage final non homologue (NHEJ) et la recombinaison homologue (HR) (Figure 1). NHEJ ligates essentiellement ADN double brin se termine sans l’utilisation de l’homologie étendue et fonctionne tout au long du cycle cellulaire14,15. Hr devient prédominant pendant les phases S et G2, et est autrement réprimé, car il nécessite une sœur chromatid comme un modèle homologue pour la réparation14,16. Le choix de la voie entre le NHEJ et le HR dépend non seulement de la proximité physique du chromatid sœur, mais aussi de l’extension de la résection d’extrémité de l’ADN17, qui inhibe le NHEJ.
La réparation d’ADN homologie-dépendante initie par la dégradation nucléolytique du brin de 5' des extrémités de rupture pour produire 3' queues d’ADN à un brin (ssDNA), un processus appelé résection de 5'-3'. Le complexe MRN initie la résection finale de l’ADN et la résection est traitée en combinaison avec BLM/EXO1 (protéine du syndrome de Bloom/exonucléase 1) ou BLM/DNA2 (réplication de l’ADN hélicase/nucléase dépendante de l’ATP)18,19,20,21,22. La résection finale de l’ADN est améliorée par le CtIP (protéine d’interaction CtBP) par son interaction directe avec le complexeMRN 23 et le recrutement de BRCA1 (protéine de susceptibilité de type 1 du cancer du sein)24,25. La protéine de réplication A (RPA) se lie rapidement à l’ADN SsDN exposée et est ensuite déplacée par la protéine recombinase RAD51 pour former un filament de nucléoprotéine qui catalyse la recherche homologue et l’invasion de brin26,27,28.
L’initiation de la résection est une étape critique pour le choix de la voie de réparation. Une fois la résection commencée, les extrémités d’ADN deviennent de pauvres substrats pour la liaison par l’hétérodimer Ku70/Ku80 (composant de la voie NHEJ) et les cellules sont engagées à HR17,29,30. L’hétérodimère Ku70/Ku80 se lie aux extrémités de l’ORD, recrutant des ADN-PKcs et p53 Binding Protein 1 (53BP1)29,30. 53BP1 agit comme un obstacle à la résection en G1, bloquant ainsi hr tout en faisant la promotion de NHEJ31,32, mais il est supprimé d’une manière BRCA1-dépendante dans la phase S, permettant par conséquent la résection de se produire33,34. Par conséquent, 53BP1 et BRCA1 jouent un rôle opposé dans la réparation de l’ORD, avec 53BP1 étant un facilitateur NHEJ tandis que BRCA1 agit permettant des pauses pour réparer par hr.
En laboratoire, la formation d’ORD peut être induite par le rayonnement ionisant (IR). Bien que cet exemple utilise une dose élevée de 4 Gy, 1 Gy et 2 Gy également créer une quantité significative de DSBs, adapté à l’analyse de la formation de foyers par des protéines abondantes. Il est important de noter que le type et la dose de rayonnement utilisé peuvent conduire à différentes lésions dans l’ADN et dans la cellule: tandis que l’IR induit DSBs, il peut également causer des ruptures de brin unique ou la modification de la base (voir35,36 pour une référence sur le transfert d’énergie linéaire irradiation (LET) et le type de dommages à l’ADN). Pour déterminer la cinétique de la formation de foyers induits par rayonnement ionisant (IRIF) et leur dégagement, qui indiquent la réparation des dommages et l’inversion du DDRactivé 8,9,37,38, la formation de foyers peut être surveillée à différents points de temps après rayonnement ionisant. Le moment de l’activation et le dégagement de toutes les protéines majeures de dommages d’ADN est connu39, et beaucoup sont étudiés en tant que marqueurs de substitution des événements principaux. Par exemple, pRPA, qui possède une forte affinité pour l’ADN SsDN est utilisé comme un substitut de la résection de rupture, protéines MRN (MRE11, RAD50, NBS1) et exonucleases peuvent être utilisés pour évaluer l’efficacité de la résection aussi. Bien que RAD51, BRCA1, BRCA2 (protéine de susceptibilité de type 2 du cancer du sein) et PALB2 (partenaire et localisateur de BRCA2) puissent être surveillés pour évaluer l’efficacité des RH, la présence des protéines Ku ou 53BP1, sont utilisés comme marqueurs de NHEJ (Figure 1).
Comme les protéines des machines de réparation de l’ADN se recrutent les unes les autres à la rupture et s’assemblent dans des super-complexes, l’ADN-protéine et les interactions protéines-protéines peuvent être déduites en suivant leur localisation individuelle au fil du temps et en analysant la co-localisation des protéines, telle que visualisée par des signaux qui se chevauchent dans la cellule40,41,42. Dans les lignées cellulaires, l’introduction de mutations ponctuelles ou la suppression dans des gènes spécifiques de réparation de l’ADN, soit par l’édition du génome, soit par surexpression de mutants à base de plasmide, permet d’enquêter sur des résidus spécifiques et leur rôle possible dans la reconnaissance des dommages à l’ADN (p. ex., co-localisation avec γH2AX) ou d’assemblage complexe (co-localisation avec une autre ou plusieurs protéines), ainsi que leur impact sur la réparation de l’ADN. Ici, nous utilisons l’immunofluorescence indirecte comme moyen d’étudier la formation et la résolution des DSB en suivant les foyers γH2AX au fil du temps. Nous présentons également un exemple de formation de foyers et d’analyse de co-localisation par un acteur majeur de la réparation de l’ORD : p53 Binding Protein 1 (53BP1)32. Comme mentionné précédemment, 53BP1 est considéré comme central pour le choix de la voie de réparation de l’ADN. Après l’accumulation de 53BP1 et sa co-localisation avec γH2AX fournit des informations précieuses sur la phase de cycle cellulaire, l’accumulation de dommages d’ADN, et la voie utilisée pour réparer les DSB. Le but de l’immunolocalisation indirecte est d’évaluer l’efficacité de la réparation des dommages à l’ADN dans les lignées cellulaires, à la suite de l’IR comme dans cette étude, ou après l’exposition à diverses contraintes dans les cellules, de croisement d’ADN au blocage de la fourche de réplication (une liste d’agents d’endommagement de l’ADN est fournie dans le tableau 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61447/61447fig1v2.jpg"> Figure 1 : Ruptures de ruptures à double brin d’ADN (DSB) voies de réparation. La réparation d’ORD implique deux voies principales : la recombinaison homologue (HR, gauche) et l’assemblage non homologue (NHEJ, à droite). Après la pause, les protéines sont activées pour marquer la rupture (γH2AX), participer à la résection finale (MRN), enrober le ssDNA réséqué (pRPA), promouvoir la recombinaison (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) ou limiter la résection et promouvoir la SSDNA (pRPA), promouvoir la recombinaison (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) ou limiter la résection et promouvoir la resEJ (53BP1). D’autres protéines participent à la réparation des dommages, mais les protéines énumérées sont systématiquement suivies d’immunofluorescence indirecte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61447/61447fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Agent d’endommagement d’ADN</td>
			<td>Mécanisme d’action</td>
			<td>Dose recommandée</td>
		</tr>
<tr>
<td>rayons γ/rayons X</td>
			<td>Rayonnement Formation de ruptures à double brin avec certains effets cellulaires incontrôlés</td>
			<td>1-4 Gy</td>
		</tr>
<tr>
<td>
36 Ions Ar</td>
			<td>Rayonnement Formation de pauses à double brin</td>
			<td>270 keV/μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>α-particules</td>
			<td>Rayonnement Formation de pauses à double brin</td>
			<td>116 keV/μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bleomycine</td>
			<td>Inhibiteur de la synthèse de l’ADN</td>
			<td>0,4 à 2 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Camptothécine</td>
			<td>Inhibiteur de la topoisomérase I</td>
			<td>10-200 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cisplatine</td>
			<td>Agent alcalin (induisant des liens croisés intrastrand)</td>
			<td>0,25 à 2 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Doxorubicine</td>
			<td>Agent intercalaire Inhibiteur de la topoisomerase II</td>
			<td>10-200 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etoposide</td>
			<td>Inhibiteur de la topoisomerase II</td>
			<td>10 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hydroxyurea</td>
			<td>Inhibiteur de la synthèse de l’ADN (par ribonucléotide reductase)</td>
			<td>10-200 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Méthane de méthyle</td>
			<td>Agent alcalin</td>
			<td>0,25 à 2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mitomycine C</td>
			<td>Agent alcalin</td>
			<td>0,25 à 2 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lumière ultraviolette (UV)</td>
			<td>Formation de dimers thymidine (générant une distorsion de la chaîne d’ADN)</td>
			<td>50-100 mJ/cm2
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Agents génotoxiques. Exemples d’agents d’ADN nuisibles, leur mécanisme d’action et les dommages induits en fonction de la concentration de travail suggérée.

<table><tbody><tr><td>16 % (v/v) de paraformaldéhyde (PFA) solution aqueuse</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td> La <td>qualité de microscopie du PFA garantit les meilleures images. Si vous utilisez du « PFA fait maison », filtrez avant utilisation.</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>La fraction de choc thermique est recommandée, pour éviter les précipitations/le bruit de fond.</td></tr><tr><td>Coverglass #1, rond de 18 mm (lamelles)</td>Les lamelles <td>NC0308920</td> <td>Neuvitro</td><td>doivent être nettoyées et stérilisées avant d’être utilisées, avec du HCl ou de l’éthanol.</td></tr><tr><td>DMEM, High Glucose [(+) 4,5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Pyruvate de sodium]</td><td>Gibco</td><td>11965118</td><td>Ajustez le milieu de culture aux besoins de la lignée cellulaire utilisée.</td></tr><tr><td>DPBS, sans calcium, sans magnésium</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>PBS pour la culture tissulaire.</td></tr><tr><td>Éthylène glycol-bis(&bêta ;-aminoéthyl éther)-N,N,N&prime ;,N&prime ;-acide tétraacétique (EGTA)</td><td>Research Products International</td><td>E57060</td><td>Tampon d’extraction nucléaire.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>104370028</td><td>La qualité du FBS peut être évaluée en testant la formation de foyers gH2AX. Si des traces d’endotoxine génotoxique sont présentes dans le lot, gH2AX sera positif en l’absence de stress.</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl2)</td><td>Research Products International</td><td>M24000</td><td>Tampon d’extraction nucléaire.</td></tr><tr><td>Pipérazine-N,N&prime ;-bis(acide 2-éthanesulfonique) (PIPES)</td><td>Research Products International</td><td>P40150</td><td>Tampon d’extraction nucléaire.</td></tr><tr><td>SlowFade Diamond Antifade Mountant avec DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36973</td><td>300 nM DAPI avec support de montage VECTASHIELD Antifade peut être utilisé à la place.</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Research Products International</td><td>S23020</td><td>Tampon d’extraction nucléaire.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Research Products International</td><td>S24060</td><td>Tampon d’extraction nucléaire.</td></tr><tr><td>Les lames de microscope Fisherbrand</td><td></td><td>1255015</td> les <td>lames en polysinus peuvent être utilisées à la place.</td></tr><tr><td>Plaques à puits multiples traitées TC, taille 12 puits</td><td>Costar</td><td>3513</td><td>L’ensemencement sur lamelles se fait en plaque à 12 puits.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AmericanBio</td><td>AB02025</td><td>Tampon d’extraction nucléaire.</td></tr><tr><td>L’enzyme TrypLE Express (1X), le Gibco sans rouge de phénol</td><td></td><td>12604021</td> la <td>trypsine-EDTA peuvent être utilisés à la place.</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,5 %), pas de rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td>TrypLE peuvent être utilisés à la place.</td></tr></tbody></table>

visualisation de l’adn réparation des protéines interaction par immunofluorescence

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Les cellules de mammifères sont constamment exposées à des produits chimiques, des radiations et des sous-produits métaboliques naturels, qui créent des types spécifiques d’insultes à l’ADN. Les agents génotoxiques peuvent endommager l’épine dorsale de l’ADN, la briser ou modifier la nature chimique des bases individuelles. Suite à l’insulte à l’ADN, les voies de réponse aux dommages à l’ADN (DDR) sont activées et les protéines impliquées dans la réparation sont recrutées. Une pléthore de facteurs sont impliqués dans la détection du type de dommages et l’activation de la réponse de réparation appropriée. L’incapacité d’activer et de recruter correctement des facteurs de DDR peut conduire à l’instabilité génomique, qui sous-tend de nombreuses pathologies humaines, y compris le cancer. Les études sur les protéines DDR peuvent fournir des informations sur la réponse aux médicaments génotoxiques et les mécanismes cellulaires de la résistance aux médicaments.
Il existe deux façons principales de visualiser les protéines in vivo : l’observationdirecte, en taguant la protéine d’intérêt avec une protéine fluorescente et en la suivant par imagerie vivante, ou l’immunofluorescence indirecte sur des échantillons fixes. Bien que la visualisation des protéines étiquetées fluorescentes permette une surveillance précise au fil du temps, le marquage direct dans le terminus N ou C peut interférer avec la localisation ou la fonction des protéines. L’observation des protéines dans leur version endogène non modifiée est préférable. Lorsque les protéines de réparation d’ADN sont recrutées à l’insulte de l’ADN, leur concentration augmente localement et elles forment des groupes, ou « foyers », qui peuvent être visualisés par immunofluorescence indirecte à l’aide d’anticorps spécifiques.
Bien que la détection des foyers protéiques ne fournisse pas de preuve définitive de l’interaction directe, la co-localisation des protéines dans les cellules indique qu’elles se regroupent jusqu’au site des dommages et peuvent éclairer la séquence des événements nécessaires à la formation complexe. Une analyse minutieuse des foyers se chevauchent dans les cellules exprimant des versions sauvages ou mutantes d’une protéine peut fournir des indices précieux sur des domaines fonctionnels importants pour la fonction de réparation de l’ADN. Enfin, la co-localisation des protéines indique des interactions directes possibles qui peuvent être vérifiées par co-immunoprécipation dans les cellules, ou retrait direct à l’aide de protéines purifiées.

Le jour 2, ou 24 h après les cellules d’ensemencement sur les couvercles, les cellules ont subi une division et sont confluentes à 80%. Des baisses ou des mutations spécifiques dans les protéines de réparation de l’ADN peuvent augmenter le temps de doublement, ou sensibiliser les cellules au traitement génotoxique, et la densité d’ensemencement ainsi que les doses de traitement devraient être ajustées en conséquence. Pour déterminer les meilleures conditions de travail, le moment de la réponse aux dommages à l’ADN peut ê...

Suite à des dommages à l’ADN, les cellules humaines activent des voies de réparation essentielles pour restaurer l’intégrité de leur génome. Ici, nous décrivons la méthode de l’immunofluorescence indirecte comme un moyen de détecter les protéines de réparation de l’ADN, d’analyser leur recrutement spatial et temporel, et d’aider à interroger l’interaction protéine-protéine sur les sites de dommages à l’ADN.

Visualisation de l’ADN Réparation des protéines Interaction par immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

L’immunofluorescence indirecte permet de détecter les protéines de réparation de l’ADN, les photos du recrutement spatial et temporel et elle aide à interroger les interactions proteinprotein sur le site des dommages à l’ADN. Suite à des dommages à l’ADN, les protéines de réparation de l’ADN sont recrutées à l’insulte de l’ADN tandis que leur concentration augmente localement, et ils forment des groupes appelés foyers qui peuvent être visualisés par immunofluorescence indirecte sur des échantillons fixes. Cette technique peut être utilisée pour détecter les foyers protéiques, ainsi que pour quantifier la colocalisation du présent dans les cellules.Cela peut aider à expliquer la séquence des événements nécessaires à la formation complexe et à la réparation de l’ADN. des interactions protéinées particulières peuvent être associées à de telles expériences. La démonstration de la procédure sera Barbara De La Pena, une photo postdoc très talentueux de mon laboratoire Commencer par la croissance de 40.000 cellules HeLa dans chaque bien plus de 12 plaque de puits avec un 18 millimètres de couverture en verre rond coverslip à 80% confluency.Après avoir exposé les cellules à quatre irradiations gamma grises, lavez-les deux fois avec un millilitre de PBS. Retirez ensuite complètement le PBS et ajoutez 200 microlitres de NDB à chaque puits. Incuber les cellules pendant deux minutes à température ambiante, puis retirer la BND.Gardez à l’esprit que le temps d’incubation peut varier en fonction de la lignée cellulaire, mais ne doit généralement pas dépasser deux minutes. Lavez les cellules avec un millilitre de PBS. Retirez ensuite complètement le PBS et ajoutez 200 microlitres de 4%PFA à chaque puits pour la fixation cellulaire.Incuber les cellules pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez ensuite le PFA et ajoutez un millilitre de PBS à chaque puits. Retirez complètement le PBS, puis ajoutez 200 microlitres de solution de blocage à chaque puits et incubez les cellules pendant deux heures à température ambiante ou de 16 à 18 heures à quatre degrés Celsius.diluer le tampon primaire d’anticorps et de dilution et le vortex jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé dans une boîte d’humidité et ici un morceau de parafilm et ajouter 10 microlitres d’anticorps primaires en une seule goutte. Alignez un bord du coverslip du puits avec la goutte et abaissez-le lentement sur le parafilm répandant le liquide. incuber le coverslip pendant deux heures à température ambiante.Après le lavage d’incubation, le couvercle glisse trois fois dans PBS pendant une minute par lavage. diluer l’anticorps secondaire et le tampon de dilution et le vortex jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé appliquer 10 microlitres d’anticorps secondaires à chaque coverslip comme précédemment décrit et l’incuber pendant deux heures à température ambiante protégée de la lumière. Laver le couvercle glisse trois fois avec PBS et une fois avec de l’eau pendant une minute par lavage.Montez-les ensuite sur des toboggans en verre avec un support de montage à base de glycérol contenant des glissements de couvercle de joint DAPI avec du vernis à ongles transparent et laissez-les sécher pendant 20 minutes. Placez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif de 60 x et utilisez DAPI pour localiser les noyaux à travers l’oculaire pour l’acquisition d’images XYZ, ouvrir le logiciel d’acquisition et définir le type de scanner comme galvano le type de scanner comme aller-retour et 512 par 512 taille d’image. Dans le mode de jeu de panneau PMT à la moyenne VBM à l’encadrement et l’analyse séquentielle à la ligne.Ensuite, réglez le colorant et les détecteurs de chaleur réglé canal un à DAPI et SD un, canal deux à alexafluor 488 et HSD trois, et canal trois à alexafluor à 647 et HSD quatre sélectionner sur Z.To ajuster l’image en direct, appuyez sur le bouton en direct sur la fenêtre en direct et ajuster la mise au point. Ensuite, utilisez la fenêtre d’outil PMT pour définir la sensibilité à l’intensité laser, gagner et compenser pour les piles z, sélectionnez début à fin et 15 tranches. Sélectionnez le dossier pour enregistrer des images et appuyez sur le bouton Démarrer LSM pour commencer à acquérir.Une fois terminé, appuyez sur le bouton de la série fait pour compléter l’acquisition de l’image. Ouvrez le logiciel d’analyse puis appuyez sur la fenêtre de l’outil de lot et sélectionnez les images à analyser. Rendez-vous à la fenêtre de l’outil d’analyse et sélectionnez projection, qui affichera la projection d’intensité maximale à partir de 15 tranches.Dans le paramètre de sortie d’entrée, sélectionnez le lot créé et le dossier de sortie. Processus de presse pour que les images soient traitées et exportent les images sous forme de fichiers TIFF. Effectuer la quantification nucléaire avec cellprofiler selon les instructions manuscrites.Les cellules non traitées avec le rayonnement présentent très peu de signes gamma H2AX expo. En l’absence de protéines essentielles de réparation de l’ADN, l’accumulation gamma de H2AX peut être observée lors des ruptures d’ADN. L’accumulation de ruptures non réparées peut conduire les cellules à devenir pré hypotoniques indiquées par les noyaux gamma solides H2AX.Après l’irradiation, les noyaux présentent un grand nombre de ruptures à double brin auxquelles le gamma H2AX se localise est extrêmement rapide. Bien que peu ou pas de foyers soient observés en l’absence d’un rayonnement, le nombre de foyers a été quantifié à une heure deux quatre et 16 heures après un rayonnement et pour la lutte contre les radiations de la NDA. Selon la question biologique soulevée et le type de données requises, différentes options de traçage devraient être considérées Comme la colocalisation peut être étudiée en multiplexant les anticorps primaires élevés chez différentes espèces animales et en utilisant des anticorps secondaires, sont étiquetés avec des fluorophores distincts.Superposition de vert et rouge, donne lieu à des points chauds jaunes, les deux protéines d’intérêt sont présents dans les mêmes pixels. L’analyse quantitative de la colocalisation peut être réalisée par une approche basée sur l’objet ou par une approche statistique qui effectue des analyses basées sur le coefficient de corrélation d’intensité. Une combinaison d’anticorps primaires élevés chez différentes espèces animales, peut être utilisée dans ce protocole.Assurez-vous que les anticorps sont compatibles et n’interfèrent pas les uns avec les autres. Vous devez définir correctement l’anticorps secondaire à utiliser contre chacun des anticorps primaires et tenir compte d’un chevauchement spectral particulier lors de la sélection de la force moins à utiliser. La colocalisation ou les protéines indiquent des interactions directes possibles.Ceci peut être vérifié par précipitation granulaire dans les cellules, ou par mise vers le bas directe utilisant des protéines purifiées in vitro.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Dans cette vidéo, nous décrivons la méthode d’immunofluorescence pour visualiser la localisation des protéines de réparation de l’ADN γH2AX et 53BP1 aux sites de cassures d’ADN double brin dans les noyaux cellulaires irradiés.

Visualisation par immunofluorescence des interactions entre les protéines de réparation de l’ADN

Dans cette vidéo, nous décrivons la technique de microscopie par immunofluorescence pour détecter des protéines spécifiques de réponse aux dommages de l’ADN localisées sur les sites de cassures double brin de l’ADN dans les cellules mononucléées humaines. Les protéines sont reconnues par des anticorps primaires spécifiques, qui à leur tour se lient à des anticorps secondaires marqués au fluorophore qui deviennent fluorescents lors de la visualisation microscopique, permettant de visualiser les...

Microscopie d’immunofluorescence pour l’analyse des cassures double brin de l’ADN

L’imagerie spectroscopique électronique permet d’imager et de distinguer l’acide nucléique de la protéine à une résolution nanométrique. Il peut être combiné avec le système miniSOG, qui est capable de marquer spécifiquement les protéines marquées dans des échantillons de microscopie électronique à transmission. Nous illustrons l’utilisation de ces technologies en utilisant des foyers de réparation de cassures double brin à titre d’exemple.

Visualisation des miniSOG protéines marquées de réparation d&#39;ADN en combinaison avec Electron imagerie spectroscopique (ESI)

Ici, il est démontré comment le dosage in situ de ligature de proximité (PLA) peut être utilisé pour détecter et visualiser les interactions directes protéines-protéines entre ATM et p53 dans des cultures de cellules en suspension exposées au stress génotoxique.

Détection et visualisation des complexes protéiques induits par endommagement de l&#39;ADN dans des cultures cellulaires en suspension utilisant l&#39;essai de ligature de proximité

Laser microirradiation est un outil utile pour l’étude de la réparation de l’ADN dans les cellules vivantes. Une approche méthodologique pour l’utilisation des lasers UVA pour induire diverses lésions de l’ADN est montrée. Nous avons optimisé une méthode pour microirradiation locale qui gère le cycle cellulaire normal ; ainsi, les cellules irradiées passent par mitose.

Avancée des Techniques de microscopie confocale afin d’étudier les interactions entre protéines et cinétique aux lésions de l’ADN

Ce manuscrit fournit un protocole pour l’analyse des cassures double brin de l’ADN par la microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1.

La microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 pour l’analyse de la Formation et la réparation des cassures Double brin de l’ADN

Étude cinétique de réparation des dommages ADN nécessite un système d’induire des lésions à des régions sub nucléaires définies. Les auteurs décrivent une méthode pour créer des sauts de double-brin localisées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser équipé d’un laser à 405 nm et fournir des procédures automatisées afin de quantifier la dynamique des facteurs de réparation à ces lésions.

Enquête sur le recrutement de protéines aux lésions de l’ADN à l’aide de 405 Nm Laser Micro-irradiation

Réparation des cassures double brin de l’ADN est un processus dynamique, qui exige non seulement la formation de complexes de réparation sur les sauts, mais également leur résolution après que la lésion est adressée. Ici, nous utilisons la microscopie d’immunofluorescence pour les pauses bicaténaire transitoires et de longue durée comme outil de disséquer ce mécanisme de maintenance du génome.

Caractériser les processus de réparation de l’ADN à des cassures de l’ADN bicaténaires durables et transitoires de la microscopie par Immunofluorescence

La réponse aux dommages causés par l’ADN par rayonnement activé par le faisceau mixte de neutrons utilisé dans la thérapie de capture de neutrons de bore (BNCT) n’a pas été entièrement établie. Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour détecter les foyers induits par rayonnement (RIF) des protéines de réparation par la coloration d’immunofluorescence dans les lignées cellulaires du cancer du côlon humain après irradiation avec le faisceau mélangé à neutrons.

Imagerie d’immunofluorescence des dommages d’ADN et des foyers de réparation dans les cellules cancéreuses du côlon humain

Le présent protocole décrit des méthodes d’évaluation des protéines de réparation des dommages à l’ADN dans les organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de patientes. Vous trouverez ici des méthodes complètes de placage et de coloration, ainsi que des procédures de quantification détaillées et objectives.

Visualisation des protéines de réparation des dommages à l’ADN dans les organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de patients par des tests d’immunofluorescence

Le protocole suivant présente la détection de foyers d’ADN simple brin dans la phase G1 du cycle cellulaire en utilisant la synchronisation du cycle cellulaire suivie d’une coloration immunofluorescente RPA2.

Visualisation des foyers d’ADN monocaténaire dans la phase G1 du cycle cellulaire

Découvrez l'immunofluorescence indirecte pour visualiser les interactions des protéines de réparation de l'ADN dans les cellules HeLa. Cette méthode permet d'analyser la formation des foci protéiques et la colocalisation après irradiation.

Visualisation de l’ADN Réparation des protéines Interaction par immunofluorescence

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