Name: Culture et dosage de populations de Caenorhabditis elegans à grande échelle au stade mixte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Apprenez à cultiver des populations massives de Caenorhabditis elegans sur plaques de culture à grande échelle pour la recherche omique. Cette méthode permet une manipulation minimale et garantit des résultats expérimentaux reproductibles.

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Nous remercions les membres du laboratoire Edison pour les discussions utiles et les commentaires sur ce manuscrit; en particulier, B.M. Garcia. Certaines souches ont été fournies par la CCG, qui est financée par le Bureau des programmes d’infrastructure de recherche des NIH (P40 OD010440), et cendr, qui est financé par NSF Living Collections CSBR 1930382. Ce travail a été soutenu par une subvention des NIH (U2CES030167).

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<li>Golden, J., Riddle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218 (4572), 578-580 (1982).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Une variété de navires peuvent être utilisés comme LSCP. Dans ce protocole, un plat de cuisson en verre standard a été utilisé. Les LSPCs utilisés avaient des dimensions extérieures de 35,56 x 20,32 cm, des dimensions intérieures de 27,94 x 17,78 cm et une profondeur d’environ 4,45 cm et étaient munis d’un couvercle. Ainsi, la quantité de bactéries utilisée ici a été optimisée pour un LSCP avec les dimensions ci-dessus pour produire une grande population de vers à stade mixte. Le volume et la concentration bactériens peuvent être ajustés pour répondre aux besoins expérimentaux.
La contamination par des moisissures, des champignons ou d’autres sources bactériennes peut se produire à n’importe quelle étape de la méthode LSCP, alors manipulez les échantillons avec soin. Avant de commencer toute étape du protocole, assurez-vous que l’espace de travail est nettoyé avec 70% d’éthanol et 10% d’eau de Javel. Si disponible, traiter les zones utilisées avec de la lumière UV pendant 30 min et allumer un filtre à air HEPA 30 min avant de commencer chaque étape.
En cultivant le LSCP dans un environnement contrôlé(c’est-à-diredans une salle de TDM réglée à 20 °C), l’utilisateur peut plus facilement suivre la croissance de l’échantillon et documenter la contamination potentielle. Si la surface du LSCP est contaminée, soit éliminer la contamination dans la mesure du possible et laisser l’échantillon continuer à croître, soit jeter l’échantillon s’il n’est pas possible de contrôler la contamination. Il est impératif de s’attaquer rapidement à la contamination afin de réduire la croissance indésirable et de s’assurer qu’elle ne surpasse pas les vers pour les ressources.
Cette méthode est destinée à ceux qui veulent cultiver des cultures de population mixte à grande échelle de C. elegans. Bien qu’il puisse être possible de cultiver des populations synchronisées de vers sur le LSCP comme cela a été fait sur des boîtes de Pétri disponibles dans le commerce et en culture liquide, les auteurs n’ont pas testé cette option. De plus, si les utilisateurs souhaitent cultiver plus d’environ 2,4 millions de vers en moyenne dans un échantillon donné, une méthode différente est recommandée4. Le succès de la croissance dépend de la souche traitée dans le pipeline. Les auteurs ont réussi à développer des populations d’environ 2,4 millions de vers dans au moins cinq répétitions biologiques de 15 souches de C. elegans, ce qui indique que la méthode est robuste.
Avant de commencer l’expérience, notez que l’âge et la santé d’un ver donné peuvent influencer la fécondité et le temps de croissance de la population ultérieur. Assurez-vous que les vers sont maintenus dans des conditions saines avec un minimum de stress avant d’être utilisés dans ce pipeline. On suppose que des échantillons de stock ont été créés, congelés et conservés à -80 °C pour réduire la dérive génétique au fil du temps.
Selon les besoins d’une expérience donnée, le nombre d’adultes gravides partants sur un LSCP peut être modifié. La modification du nombre d’adultes gravides partants dans le LSCP modifiera le taux de croissance et, par conséquent, le temps de récolte. Cinq adultes gravides sont utilisés pour ensemencer chaque LSCP pour les raisons suivantes : (1) Un moyen simple, rapide et efficace d’ensemencer de nombreuses souches de C. elegans sur des LSCP en même temps était nécessaire et (2) pour réduire les différences d’âge parmi les adultes gravides cueillis qui pourraient mener à l’hétérogénéité de croissance.
Cette méthode permet à l’utilisateur de récolter de grandes populations de vers avec tous les stades du cycle de vie présents. Avec les méthodes actuelles disponibles, la collecte d’échantillons à grande échelle de C. elegans nécessite une synchronisation de l’eau de Javel pour obtenir le nombre de vers souhaités pour le travail en aval. Compte tenu de cette approche, on peut maintenant cultiver autant de vers que possible auparavant dans des fermenteurs ou des cultures liquides à grande échelle sans les difficultés associées à la synchronisation de l’eau de Javel et aux multiples étapes de manipulation. Notre protocole permet de cibler efficacement les souches d’intérêt, d’utiliser un temps de manipulation minimal pour la croissance de l’échantillon lui-même et d’isoler les stades des vers ou de la population au besoin dans les pipelines en aval.
Un LPFC a été utilisé comme outil pour documenter la répartition et la taille de la population dans un LSCP donné. Le LPFC utilisé est un système à flux continu qui analyse, trie et distribue les vers en fonction de leur taille (TOF) et de leur densité optique. Comme un ver donné passe à travers la cellule d’écoulement, le détecteur axial de perte de lumière capture la quantité de lumière de signal bloquée par un laser à semi-conducteurs de 488 nm pendant la durée nécessaire à un ver pour passer à travers, donnant à l’utilisateur la tof et la densité optique du ver. L’optique et les détecteurs de collecte de fluorescence peuvent également être utilisés pour maximiser la sensibilité à la fluorescence et la collecte sur chaque échantillon. Les paramètres de collecte LPFC varient en fonction de l’instrument. Les utilisateurs peuvent utiliser une variété de plates-formes pour capturer la taille des vers et ne sont pas limités à l’utilisation de ce protocole si un LPFC n’est pas disponible.
Les auteurs utilisent des échantillons cultivés selon la méthode décrite ici pour identifier des métabolites inconnus dans diverses souches de C. elegans par chromatographie liquide – spectrométrie de masse, spectroscopie RMN et séquençage de l’ARN. Les auteurs prévoient continuer à utiliser cette méthode pour la croissance d’échantillons dans ce pipeline avec une variété de souches de C. elegans, car de nouvelles souches d’intérêt peuvent être facilement traitées à l’aide de ce pipeline.

C. elegans est un petit nématode libre que l’on trouve dans le monde entier dans une variété d’habitats naturels1. Sa relative facilité de croissance, son temps de génération rapide, son système de reproduction et son corps transparent en font un organisme modèle puissant qui a été largement étudié en biologie du développement, en vieillissement, en neurobiologie et en génétique2,3. Le travail copieux sur C. elegans en fait un candidat de choix à utiliser dans les études -omiques pour relier de manière exhaustive les phénotypes aux composants biologiques complexes et à leurs relations dans un organisme donné.
Pour utiliser C. elegans dans la recherche omique collaborative, une méthode est nécessaire pour générer de grandes populations d’animaux à stade mixte où un seul échantillon peut être divisé et utilisé sur diverses plateformes et instruments pour des analyses comparatives. La création d’un pipeline pour générer un tel échantillon nécessite une conscience aiguë de l’alimentation, de l’environnement, du stress, de la structure de la population, ainsi que de la manipulation et de la collecte des échantillons. Par conséquent, il est crucial d’intégrer des conditions de culture standard et reproductibles dans des pipelines à grande échelle. Dans la recherche de C. elegans, deux méthodes traditionnelles sont utilisées pour la culture des vers - les boîtes de Pétri d’agar et la culture liquide4.
Historiquement, lorsque de grandes quantités de C. elegans sont nécessaires, ils sont cultivés en culture liquide4. Les étapes impliquées dans la génération d’une grande population de vers en culture liquide nécessitent de multiples étapes de manipulation qui incluent souvent la synchronisation de l’eau de Javel pour rompre les cuticules adultes gravides, libérant des embryons pour atteindre la taille de population souhaitée. Toutefois, lorsque la synchronisation de l’eau de Javel est utilisée, la croissance de la population dépend de la taille du recensement et, par conséquent, a une effet sur la croissance et les chiffres de population subséquents. De plus, les souches de C. elegans varient dans leur sensibilité à la cuticule, leur temps d’exposition et leur réponse au stress à la synchronisation de l’eau de Javel, ce qui rend difficile le dosage de nombreuses souches à un moment5,6,7,8,9.
De plus, la croissance des vers en culture liquide nécessite quelques étapes de transfert car il est souvent recommandé de ne cultiver qu’une seule génération de vers avant la récolte, car le surpeuplement peut facilement se produire s’il est cultivé pendant plusieurs générations et entraîner la formation de dauer malgré la présence de nourriture10. La formation de Dauer se produit par de petites molécules de signalisation telles que les ascarosides, souvent appelés « phéromones dauer »11,12,13,14,sont libérées dans des milieux liquides et affectent la croissance de la population. En outre, la croissance de grandes populations de vers en culture liquide entraîne une accumulation excessive de bactéries dans la culture, ce qui crée des difficultés lorsqu’un échantillon propre est nécessaire pour les essais phénotypiques en aval. Enfin, lorsqu’une culture liquide est contaminée, elle est plus difficile à maintenir car les spores fongiques ou les cellules bactériennes sont facilement dispersées dans l’ensemble du milieu15.
L’autre méthode traditionnelle de culture de C. elegans est sur des boîtes de Pétri d’agar. Les boîtes de Pétri disponibles dans le commerce permettent de cultiver facilement plusieurs générations de vers à stade mixte sans les effets rapides de la surpopulation et de la formation élevée de dauer comme on le voit dans les cultures liquides. Cependant, un inconvénient de la croissance des vers sur les boîtes de Pétri traditionnelles est que la plus grande boîte de Pétri disponible dans le commerce ne donne pas de grandes populations de vers pour une étude -omique sans ajouter une étape de synchronisation de l’eau de Javel. En résumé, la culture de populations à stade mixte de C. elegans sur des boîtes de Pétri à gélose convient mieux à la collecte de données omiques, mais nous avions besoin d’une méthode pour générer de très grandes tailles de population sans culture liquide.
Ici, nous présentons une méthode de culture et de collecte de grandes populations de C. elegans au stade mixte sur des plaques de culture à grande échelle (LSCP). La collecte d’échantillons dans ce pipeline permet de recueillir suffisamment d’échantillons pour recueillir des données phénotypiques et de population, ainsi que toutes les données nécessaires aux expériences omiques(c.-à-d.génomique, transcriptomique, protéomique et métabolomique). De plus, la méthode LSCP exige une manipulation minimale des animaux, moins de temps de préparation de l’utilisateur, fournit un contrôle environnemental serré et garantit que la manipulation de chaque échantillon est cohérente tout au long de l’étude pour la reproductibilité globale.

<table><tbody><tr><td>Pipettes sérologiques stériles de 10 mL</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette 10 ul</td><td>VWR</td><td>89079-438</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette 100 ul</td><td>VWR</td><td>89079-442</td><td></td></tr><tr><td>Cylindre gradué de 1000 mL</td><td>VWR</td><td>10124-380</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette 1000 uls</td><td>VWR</td><td>89079-488</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol à 190 degrés</td><td>VWR</td><td>89125-166</td><td></td></tr><tr><td>Flasque Erlenmeyer à large col de 2 L</td><td>VWR</td><td>75804-654</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 50 mL</td><td>VWR</td><td>75874-294</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>05040-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-500G</td><td></td></tr><tr><td>Système d’aspiration de fluide G à contrôle BVC</td><td>Vacuubrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Sigma</td><td>C3045-25G</td><td></td></tr><tr><td>Javel Clorox</td><td>VWR</td><td>89414-502</td><td></td></tr><tr><td>Salle de contrôle de la température du Conviron</td><td>Conviron</td><td></td><td>https://www.conviron.com/environmental-rooms</td></tr><tr><td>Corning Low Volume 384 Well noir avec microplaque à fond plat transparent en polystyrène traitée TC</td><td>VWR</td><td>89089-866</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Accuspin 3R</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaque à fond plat à 24 puits</td><td>VWR</td><td>29443-952</td><td></td></tr><tr><td>Purificateur HEPA Honeywell True 465 sq ft.</td><td>Home Depot</td><td>204390560</td><td></td></tr><tr><td>HT115 E. coli (DE3)</td><td>CGC</td><td>HT115(DE3)</td><td>https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR</td><td>470224-038</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture à grande échelle (LSCP)</td><td>Pyrex</td><td>1090948</td><td>Plat de cuisson en verre Pyrex de 2 pintes avec couvercle rouge</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium</td><td>Sigma</td><td>C86677-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR</td><td>97062-998</td><td></td></tr><tr><td>Lames simples pour microscopes</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>Filtre Millipore</td><td>Millipore</td><td>1.11727.2500</td><td></td></tr><tr><td>Appareils moléculaires ImageXpress</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>Numéro de modèle : IXMConfocal</td><td>https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , les auteurs ont utilisé MetaXpress Software Version 6.5.4.532</td></tr><tr><td>Nystatine (10 mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>N6261-25MU</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Sigma</td><td>P7750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de Petri (6 cm)</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de pipette</td><td>VWR</td><td>613-4180</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>VWR</td><td>0781-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium</td><td>Fisher</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>Microsphères rouges fluorescentes</td><td>Polysciences</td><td>19507-5</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma</td><td>746398-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Fisher</td><td>111357</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibase anhydre</td><td>Fisher</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Jeu de pipettes Gilson standard</td><td>Gilson</td><td>FA10002M, FA10004M, FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycine (100 mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>Union Biometrica COPAS BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>https://www.unionbio.com/biosorter/ , les auteurs ont utilisé : Flow Pilot version 1.6.1.3.</td></tr></tbody></table>

culture et dosage de populations de caenorhabditis elegans à grande échelle au stade mixte

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) a été et reste un organisme modèle précieux pour étudier la biologie du développement, le vieillissement, la neurobiologie et la génétique. Le vaste corpus de travaux sur C. elegans en fait un candidat idéal pour s’intégrer dans des études sur de grandes populations d’animaux entiers afin de disséquer les composants biologiques complexes et leurs relations avec un autre organisme. Afin d’utiliser C. elegans dans la recherche collaborative omique, une méthode est nécessaire pour générer de grandes populations d’animaux où un seul échantillon peut être divisé et analysé sur diverses plateformes pour des analyses comparatives.
Ici, une méthode pour culturer et recueillir une population abondante d’elegans de C. de mélange-étape sur un plat de culture à grande échelle (LSCP) et des données phénotypiques suivantes est présentée. Ce pipeline produit un nombre suffisant d’animaux pour recueillir des données phénotypiques et de population, ainsi que toutes les données nécessaires aux expériences omiques (c.-à-d. génomique, transcriptomique, protéomique et métabolomique). De plus, la méthode LSCP exige une manipulation minimale pour les animaux eux-mêmes, moins de temps de préparation de l’utilisateur, fournit un contrôle environnemental étroit et garantit que la manipulation de chaque échantillon est cohérente tout au long de l’étude pour la reproductibilité globale. Enfin, des méthodes permettant de documenter la taille de la population et la répartition de la population de C. elegans aux stades de vie dans un LSCP donné sont présentées.

La croissance de C. elegans à l’aide de la méthode LSCP donne en moyenne environ 2,4 millions de vers à stade mixte par échantillon sur une base de 12,2 jours. La croissance de C. elegans à l’aide de la méthode LSCP permet aux utilisateurs de générer de grandes populations de stade mixte de C. elegans avec peu de manipulation et de manipulation des animaux, ce qui est idéal pour les études omiques à grande échelle (Figure 1). Une fois qu’un LSCP est devenu plein de vers adultes, a atteint une grande taille de population et a un minimum de bactéries restantes, les utilisateurs peuvent récolter et estimer la taille de la population. Ce point peut également servir de contrôle de la qualité en évaluant si la population est suffisante pour être utilisée dans un pipeline -omique (Figure 2). La dynamique de la population dépend de la souche elle-même, du comportement de la souche(c.-à-d. queles souches fouisseurs avaient tendance à avoir une récupération plus faible des vers) et du succès de croissance(c.-à-d.contamination). La méthode LSCP a été testée sur 15 souches de C. elegans contenant un mélange de mutants du Caenorhabditis Genetics Center (CGC) et de souches sauvages Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource (CeNDR)25. Les génotypes des souches sont décrits dans le tableau supplémentaire 3.
La méthode du LSCP a donné des tailles de population d’environ 94 500 à 9 290 000. La taille moyenne de la population à l’intérieur de la souche de référence PD1074 et de l’ensemble des souches était d’environ 2,4 millions de vers (figure 3). Aucune différence significative n’a été constatée dans la taille estimée des populations entre les souches de C. elegans au cours d’une moyenne de 12,2 jours de croissance du LSCP (figure 4). PD1074 Les LSCPs ont pris entre 10 et 14 jours pour atteindre une population complète à stade mixte. Le temps de croissance moyen sur PD1074 était de 10 jours. La souche à croissance la plus lente a augmenté pendant un maximum de 20 jours, et la souche à croissance la plus rapide a augmenté pendant au moins 10 jours (Figure 4).
Par conséquent, en utilisant cette méthode LSCP, les utilisateurs peuvent facilement intégrer de nouvelles souches d’intérêt dans une étude avec peu de connaissances sur le calendrier de développement et l’expertise de base. Notez que les souches et les phénotypes qui doivent être maintenus par prélèvement, qui présentent des défauts de fécondité, qui sont hétérozygotes ou qui ont des défauts de croissance peuvent ne pas bien fonctionner dans ce pipeline.
La cytométrie en flux de particules volumineuses et l’imagerie des échantillons permettent aux utilisateurs de documenter la distribution de la population. Une grande variété de plateformes peut être utilisée pour mesurer la croissance démographique réussie.
Pour les mesures omiques reproductibles, il est important de cultiver des cultures cohérentes. Les mesures de reproductibilité de la culture sont le nombre de vers et une distribution granurale cohérente pour une souche donnée. Nous montrons la distribution de l’échantillon pour la souche de référence, PD1074 - une variante de la souche N2 Bristol originale, en utilisant les images LPFC23,26 et micromicroscope confocale comme indicateurs du succès de la croissance. Comme les vers ont été mesurés du stade L1 à l’adulte gravide sur la distribution LPFC(figure 5),l’imagerie ultérieure(figure 6)et la variation de la distribution de la population entre les échantillons(figure 7),nous pouvons voir que ce pipeline a généré une population à stade mixte de C. elegans.
Pour examiner de plus près la répartition de la population de nos échantillons à stade mixte, nous avons examiné la répartition de 35 LSP PD1074 en examinant le pourcentage de vers qui se trouvent dans chaque région sur l’ensemble de la distribution du temps de vol (TOF)(c.-à-d.la longueur du corps)(Figure 7A,B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble du pipeline de croissance du ver LSCP. (A) Une fois reçues en laboratoire, toutes les souches ont été préparées et congelées pour un stockage à long terme à -80 °C2. (B) Une plaque « morceau principal » a été préparée à partir d’un ver congelé et conservée à 15 °C pour être utilisée pendant un mois au plus. (C) Chaque échantillon a franchi quatre étapes successives de segmentation afin de réduire le stress générationnel avant de croître sur le LSCP. (D) 5 adultes gravides individuels ont été cueillis dans la plaque de « morceau 4 » de 6 cm à l’étape (D) et blanchis spot sur cinq zones données du LSCP. (E) Le LSCP a été placé dans une salle à température contrôlée et cultivé à 20 °C jusqu’à ce que le LSCP soit plein de vers adultes, atteigne une grande taille de population et qu’il reste un minimum de bactéries. (F) La population de vers a été récoltée et recueillie pour les étapes en aval. (G) Des aliquotes ont été créées à partir du LSCP et ont été gelées pour les applications souhaitées en aval. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig02.jpg"> Figure 2 : Aperçu de la récolte du PCPS et estimation de la taille de la population. (A) 50 mL de M9 ont été utilisés pour laver les vers de la surface ngma. La suspension de ver a été pipetted dans un tube conique de 50 mL. L’étape (A) a été répétée deux fois. (B) 15 mL de suspension de ver ont été versés dans un nouveau tube conique de 15 mL. Les vers ont été granulés par centrifugation. M9 + débris ont été aspirés sans boulette de ver dérangeante. L’étape (B) a été répétée jusqu’à ce que les 150 ml de suspension de ver soient collectés. (C) La pastille de ver a été lavée et centrifugée trois fois avec M9 pour éliminer les débris restants. Une fois l’échantillon propre, la pastille de ver a été remise en suspension dans 10 mL de ddH2O.(D) Une dilution en série de l’échantillon a été créée pour estimer la taille de la population de vers. Le ou les facteurs de dilution qui permettaient de compter les vers avec précision ont été utilisés. Le ou les facteurs de dilution utilisés ont changé en fonction de la taille de la population du LSCP. (E) Une fois le ou les facteurs de dilution choisis, tous les vers des trois répliques aliquotes de cette dilution ont été pipetés sur une lame propre et les vers ont été comptés au microscope de dissection. (F) L’échantillon a été divisé en aliquotes de taille appropriée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig03.jpg"> Figure 3 : La méthode LSCP a généré en moyenne une population de 2,4 millions de vers à stade mixte. Le LSCP donne des tailles de population dans les plus petites croissances de population à environ 94 500 et dans les plus grandes croissances de population à environ 9 290 000. La taille moyenne de la population pour toutes les souches était de 2,4 millions de vers. Les barres sous les noms des souches de C. elegans indiquent si une souche est un mutant de la CCG ou un isolat naturel de Cendr. La taille de l’échantillon LSCP est affichée pour chaque souche. Des comparaisons pour toutes les paires utilisant le test HSD de Tukey ont été effectuées. Aucune différence significative n’a été observée entre la taille estimée des populations de C. elegans (F(14 108) = 0,7, p = 0,77). Les barres colorées indiquent des affichages de couleur standard pour la représentation de la souche C. elegans respective. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig04.jpg"> Figure 4 : La méthode LSCP a généré d’importantes populations de vers à stade mixte en 10 à 20 jours. Un LSCP de C. elegans donné s’est développé jusqu’à ce que l’échantillon soit rempli de vers adultes, atteigne une grande taille de population et ait laissé une pelouse bactérienne minimale. Les LSCPs ont mis entre 10 et 20 jours pour atteindre une population complète à stade mixte, selon la souche. Le temps de croissance moyen entre les souches était de 12,2 jours. La taille de l’échantillon LSCP est affichée pour chaque souche. Chaque barre d’erreur a été construite à l’aide de 1 écart type par rapport à la moyenne. Les niveaux non connectés par la même lettre sont significativement différents. Comparaisons pour toutes les paires à l’aide du test HSD de Tukey. Une différence significative a été trouvée dans la quantité de temps de croissance sur LSCP nécessaire à travers des souches de C. elegans (F (14,108) = 8,8, p < 0,0001 *). Les barres colorées indiquent des affichages de couleur standard pour la représentation de la souche C. elegans respective. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2.jpg"> Figure 5 : Mesure mixte de la population et de la croissance de la souche de référence de type sauvage, PD1074. Une distribution représentative de la LPFC d’une croissance LSCP de la souche de référence de type sauvage, une variante de la souche N2 Bristol originale (PD1074), documente la distribution de la taille et le nombre d’événements d’une population à stade mixte. L’axe des x affiche la longueur (Temps de vol, TOF) des vers triés. L’axe des y affiche la densité optique (extinction optique, EXT) des vers triés. Chaque point de données est un ver qui a été documenté dans l’exemple. Chaque région TOF utilisée pour l’analyse d’image est affichée dans une couleur différente. Vingt régions tof ont été créées (R2 – R21) allant d’un TOF de 50 à 2050. Des détails sur chaque région du TOF se trouvent dans le tableau supplémentaire 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig06.jpg"> Figure 6 : Des images de vers triés à partir de régions TOF allant de R2 à R12 montrent la distribution PD1074 LPFC. Dans la région R2, les vers L1 peuvent être identifiés et dans la région R9, des adultes principalement gravides sont identifiés, couvrant les deux extrêmes larvaires développementaux nous donnant des régions approximatives dans la distribution du cytomètre de flux où les stades sont attendus dans la distribution. La barre d’échelle représente 1 mm. Des images représentatives ont été prises à partir de la distribution LPFC affichée à la figure 5,et les cases colorées correspondent aux régions de la figure 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig07.jpg"> Figure 7 : Répartition de la population dans les régions de temps de vol (TOF) dans la souche de référence de type sauvage, PD1074. Distribution des vers dans toute la région TOF montrant les régions où les vers ont été trouvés. Chaque PD1074 LSCP est représenté sous la forme d’une couleur individuelle. (A) L’axe des x montre les vingt régions TOF (R2 – R21) observées et comptées pour le LSCP, affichant la distribution de taille entière. L’axe des y montre le pourcentage de vers d’un LSCP donné dont la taille corporelle est tombée dans une région TOF donnée. (B) Comme une plus petite fraction de la population de vers se situe entre les régions R7-R21, le log du pourcentage de vers qui se trouvait dans chaque région a été pris pour afficher la distribution de la population. L’axe des x affiche les régions TOF R7-R21. L’axe des y affiche le journal du pourcentage de vers d’un LSCP donné dont la taille corporelle est tombée dans une région TOF donnée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1 : Température quotidienne moyenne (°C) des conditions de croissance dans lesquelles le LSCP a été cultivé et manipulé. Les températures signalées dans la salle à température contrôlée (TDM) ont été documentées et recueillies tout au long de la période de six mois de croissance et de prélèvement de l’échantillon. La température quotidienne moyenne est indiquée ici. Aucune différence significative n’a été observée entre la température à laquelle le PCSV a augmenté pendant la durée du projet (F(5,24) = 2,59, p = 0,0524). La différence de température totale ne s’est pas étendue à plus de 0,003 °C pendant les six mois de croissance et de production de l’échantillon. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453supfig01.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Régions fermées TOF utilisées pour trier les vers en plaques de 384 puits à des fins d’imagerie. Les régions binned ont été créées pour couvrir un TOF de 100 sur l’ensemble de la distribution tof de 50 à 2050. Les régions fermées peuvent être modifiées et optimisées pour répondre à vos besoins. Chaque région TOF utilisée pour l’analyse d’image est affichée dans une couleur différente. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table1_FINAL.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau supplémentaire 2 : Gabarit de plaque de 384 puits des régions tof et disposition de réplique. Chaque échantillon a été trié dans une plaque de 384 puits pour l’imagerie. Quatre répliques ont été créées pour chaque région sélectionnée pour le tri. Les régions fermées peuvent être modifiées et optimisées pour répondre à vos besoins. Voir le tableau supplémentaire 1 pour les régions fermées spécifiques créées et utilisées dans ce protocole. Chaque région TOF utilisée pour l’analyse d’image est affichée dans une couleur différente. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table2_FINAL.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau supplémentaire 3 : Les souches de C. elegans utilisées dans le présent protocole contiennent un mélange de souches de la CCG et du Cendr. La souche, le génotype, la source de la souche et les détails sont décrits dans ce tableau. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table3_FINAL.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Pour utiliser Caenorhabditis elegans (C. elegans) dans la recherche omique, une méthode est nécessaire pour générer de grandes populations de vers où un seul échantillon peut être mesuré sur toutes les plateformes pour des analyses comparatives. Ici, une méthode pour la culture des populations de C. elegans sur des plaques de culture à grande échelle (LSCPs) et pour documenter la croissance de la population est présentée.

Culture et dosage de populations de Caenorhabditis elegans à grande échelle au stade mixte

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Cette technique nous permet de collecter des populations de vers à grande échelle à utiliser pour plusieurs plates-formes omiques avec une manipulation minimale. Cette technique nous permet de collecter des populations mixtes de C.elegans à travers plusieurs expériences omiques pour obtenir une image holistique de chaque échantillon. Pour le blanchiment ponctuel d’adultes gravides sur des plaques de culture à grande échelle, enflammer un pic à vers sur un brûleur Bunsen et utiliser le pic pour ramasser E. coli frais du bord de la pelouse bactérienne sur une plaque de culture à grande échelle.Choisissez un seul adulte gravide dans la plaque du quatrième morceau pour le blanchiment ponctuel et ajoutez cinq microlitres de solution d’hypochlorite alcalin fraîchement préparée dans un coin de la plaque de culture à grande échelle loin de la pelouse d’E. coli. Placez l’adulte gravide dans la solution d’hypochlorite alcaline et appuyez sur le nématode pour perturber la cuticule et libérer les œufs. Lorsqu’un total de cinq adultes ont été placés uniformément autour de la pelouse d’E. coli de la même manière, replacez le couvercle sur la plaque.Pour prélever des échantillons à partir de plaques de culture à grande échelle, versez 50 millilitres de solution M9 sur une surface de plaque de culture à grande échelle et faites pivoter la plaque pour vous assurer que le M9 couvre toute la surface de l’agarose moyenne de croissance des nématodes. Amorcez une pipette sérologique stérile avec M9 et inclinez la plaque de sorte que la population M9 et de vers se rassemble dans un coin de la plaque. Utilisez la pipette apprêtée pour aspirer la suspension de ver et ajoutez les vers à un tube conique de 50 millilitres.Placez le tube sur une bascule pour perturber les touffes bactériennes et les débris. Lorsque tous les vers ont été collectés à partir des trois plaques, transférez 15 millilitres de vers de chaque tube dans chacun des trois tubes coniques de 15 millilitres et sédimentez les vers dans les tubes par centrifugation. Aspirez soigneusement les surnageants sans déranger les pastilles de ver et ajoutez 13 millilitres de suspension de ver à chaque tube.Inversez les tubes pour remettre les pastilles en suspension et laver autant de bactéries et de débris que possible et centrifuger à nouveau les vers. Lorsque chaque population entière de vers a été recueillie, lavez les granulés de vers trois fois dans 10 millilitres de solution M9 fraîche par lavage. Après le dernier lavage, ressuscitez chaque pastille de ver nettoyée dans 10 millilitres d’eau doublement distillée.Pour l’estimation de la taille de la population, diluer rapidement trois aliquotes de 100 microlitres d’échantillon de ver de chaque tube dans 900 microlitres de solution M9 par échantillon et utiliser les aliquotes pour faire des dilutions en série. Placer les suspensions d’échantillons de vers d’origine sur une bascule pour un mouvement continu des cultures pendant le comptage des aliquotes et mélanger les dilutions de vers jusqu’à ce qu’elles soient homogènes. Ajoutez cinq microlitres de solution du premier à 10 échantillons de vers à une lame de microscope en verre et comptez les vers par photomicroscopie.S’il y a moins de 50 vers dans l’échantillon, comptez les dilutions 1:100 et 1:1 000. S’il y a plus de 50 vers, passez à la dilution sérielle suivante. Après avoir compté trois fois chaque réplique aliquote de chaque dilution, faire la moyenne des comptes de dilution pour déterminer la taille estimée de la population du ver.Ensuite, divisez les échantillons de vers en aliquotes expérimentales appropriées et congelez instantanément les échantillons dans de l’azote liquide pour un stockage de moins 80 degrés Celsius. Pour préparer un échantillon de ver pour la cytométrie en flux de particules volumineuses, diluer une aliquote de ver d’environ cinq fois 10 à la quatrième étape mixte à un volume final de 10 millilitres de solution M9 et ajouter 200 microlitres d’un milligramme par millilitre E.coli et une dilution 1:50 de la solution de microsphère fluorescente rouge micromolaire à la suspension de ver. Après une incubation de 20 minutes à température ambiante avec bascule, recueillir les vers et les microsphères par centrifugation et laver les vers deux fois avec une solution M9 fraîche pour éliminer tout excès de bactéries et microsphères non internalisées.Après le deuxième lavage, remettre en suspension le culot dans cinq millilitres de solution M9. Si la pastille semble propre, ajoutez cinq millilitres de M9 complétés par de l’azide de sodium 50 millimolaires aux vers et placez le tube sur une bascule pour redresser et euthanasier les vers pour un comptage et un dimensionnement précis. Pour la documentation sur la répartition de la population, ouvrez le gabarit de plaque calibrée de 384 puits et définissez le gabarit pour distribuer 20 objets à contrôle dans quatre puits afin d’obtenir quatre répétitions techniques de chaque région fermée pour chacune des 20 régions de barre de l’échantillon.Chargez un échantillon de vers de 40 millilitres sur le grand cytomètre de flux de particules et commencez à trier automatiquement l’échantillon tout en remuant continuellement l’échantillon pour éviter la décantation et en distribuant simultanément des objets de l’échantillon dans la plaque calibrée de 384 puits. Une fois que l’échantillon entier a été trié et que le nombre maximal de régions fermées a été distribué dans la plaque de 384 puits, retirez l’échantillon du cytomètre et nettoyez l’instrument. La méthode de plaque de culture à grande échelle a été testée sur 15 souches de C.Elegans, y compris un mélange de mutants du Centre de génétique de Caenorhabditis et de souches sauvages de ressources de diversité naturelle de Caenorhabditis elegans.Dans cette analyse, la méthode des plaques de culture à grande échelle a donné des tailles de population d’environ 94 500 à 9 290 000. La taille moyenne de la population dans la souche de référence PD1074 et entre les souches était d’environ 2,4 millions de vers. Aucune différence significative n’a été constatée dans la taille estimée des populations entre les souches de C. elegans au cours d’une moyenne de 12,2 jours de croissance de plaques de culture à grande échelle.PD1074 les plaques de culture à grande échelle ont pris entre 10 et 14 jours pour atteindre une population à stade mixte complet avec un temps de croissance moyen de 12,2 jours. La souche à croissance la plus lente a augmenté pendant un maximum de 20 jours et la souche à croissance la plus rapide a augmenté pendant au moins 10 jours. Dans cette distribution d’échantillon pour PD1074, les vers ont été mesurés du stade L1 à l’adulte gravid sur un grand cytomètre de flux de particules.L’imagerie et la visualisation subséquentes des variations de la répartition de la population entre les échantillons ont révélé que le pipeline générait une population à stade mixte de C. elegans. Il est important de compter avec précision les vers tout au long de la collecte d’échantillons afin d’obtenir des données comparables entre les croissances et les études. Cette approche de collecte peut être appliquée au séquençage de l’ARN, à la génomique et à d’autres analyses omiques afin d’élargir notre compréhension de la dynamique compliquée qui se produit au sein des populations de C. elegans.Cette technique nous permet de collecter des populations mixtes de C.elegans à travers plusieurs expériences omiques pour obtenir une image holistique de chaque échantillon.

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