Name: Une approche de dissociation à cellule unique pour l’analyse moléculaire de la vessie urinaire chez la souris à la suite d’une lésion de la moelle épinière (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Découvrez une méthode de dissociation tissulaire optimisée pour l'analyse de cellules uniques de la vessie chez la souris après lésion de la moelle épinière. Cette technique génère des suspensions cellulaires à haute viabilité pour la cytométrie en flux.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ces travaux ont été soutenus par des subventions des National Institutes of Health (R01 DK077195 à R.M.A, R01 DK104641 à R.M.A et D.R.B). Nous reconnaissons l’apport précieux du Dr Stuart Orkin de la Division d’hématologie et d’oncologie du Boston Children’s Hospital, du Département de pédiatrie, de la Harvard Medical School et du Dana-Farber Cancer Institute. Nous reconnaissons également le soutien de Kyle Costa dans les soins postopératoires des souris, Mary Taglienti et le Dr Habiballah Shojaeisaadi (Dr Yang Shi Laboratory, Département de pédiatrie, Division de médecine néonaïne, Département de pédiatrie, Division de médecine néonaïne, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School) pour l’assistance technique et des discussions utiles.

<ol><li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+and+functional+analysis+of+human+tumor+immune+infiltration+after+mechanical+and+enzymatic+disaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation.</a> Journal of Immunological Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).</li>
<li>van den Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Seth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+discrete+modes+of+spinal+cord+injury+on+bladder+muscle+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Urology%22%5BJournal%5D)">The impact of discrete modes of spinal cord injury on bladder muscle contractility.</a> BMC Urology. 13, 24(2013).</li>
<li>Doyle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inosine+attenuates+spontaneous+activity+in+the+rat+neurogenic+bladder+through+an+A2B+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Inosine attenuates spontaneous activity in the rat neurogenic bladder through an A2B pathway.</a> Scientific Reports. 7, 44416(2017).</li>
<li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+miRNA-regulated+networks%2C+hubs+of+signaling%2C+and+biomarkers+in+obstruction-induced+bladder+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Characterization of miRNA-regulated networks, hubs of signaling, and biomarkers in obstruction-induced bladder dysfunction.</a> JCI Insight. 2 (2), 89560(2017).</li>
<li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concordant+miRNA+and+mRNA+expression+profiles+in+humans+and+mice+with+bladder+outlet+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Urology%22%5BJournal%5D)">Concordant miRNA and mRNA expression profiles in humans and mice with bladder outlet obstruction.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 6 (6), 219-233 (2018).</li>
<li>Krishna, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contusion+model+of+severe+spinal+cord+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A contusion model of severe spinal cord injury in rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50111(2013).</li>
<li>The Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li>
<li>Gray, C. J., Boukouvalas, J., Szawelski, R. J., Wharton, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline+p-nitroanilide+as+a+substrate+for+papain+and+other+plant+cysteine+proteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline p-nitroanilide as a substrate for papain and other plant cysteine proteinases.</a> Biochemical Journal. 219 (1), 325-328 (1984).</li>
<li>Feodorova, Y., Koch, M., Bultman, S., Michalakis, S., Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+and+reliable+method+for+retina+dissociation+and+separation+of+rod+photoreceptor+perikarya+from+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Quick and reliable method for retina dissociation and separation of rod photoreceptor perikarya from adult mice.</a> MethodsX. 2, 39-46 (2015).</li>
<li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bladder+extracellular+matrix.+Part+I%3A+architecture%2C+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Urology%22%5BJournal%5D)">The bladder extracellular matrix. Part I: architecture, development and disease.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 596-611 (2009).</li>
<li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bladder+extracellular+matrix.+Part+II%3A+regenerative+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Urology%22%5BJournal%5D)">The bladder extracellular matrix. Part II: regenerative applications.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 612-621 (2009).</li>
<li>The ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Yue, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome.</a> Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).</li>
<li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Le modèle de lésion de moelle épinière de souris décrit ici fournit une méthode reproductible pour créer une obstruction fonctionnelle de sortie de réservoir souple due à la perte de coordination entre la contraction de réservoir souple et la relaxation externe de sphincter urétral. Ceci évoque à son tour le remodelage profond de la paroi de réservoir souple dès 2 semaines après blessure caractérisée par l’expansion des compartiments urothelial et lisses de muscle. Les étapes critiques dans la mise en œuvre du modèle SCI chez les rongeurs comprennent (i) une attention rigoureuse à l’expression manuelle de la vessie pendant la période de choc rachidien qui s’ensuit pendant 10\u201214 jours après une blessure; (ii) l’enrichissement nutritionnel pour minimiser la perte de poids; et (iii) l’atténuation du potentiel d’échaudage de l’urine, en particulier pour les expériences qui vont au-delà du retour de l’annulation réflexe. Les limitations du modèle incluent le potentiel pour l’occlusion urétrale chez les souris des caillots sanguins pendant la période de l’hématurie passagère, et en outre chez les souris mâles du coagulum de sperme suivant l’éjaculation rétrograde suivant la chirurgie.
L’approche de dissociation tissulaire décrite ici illustre l’importance de considérer les changements structurels dans les tissus qui découlent de l’insulte expérimentale, dans ce cas le remodelage significatif de tissu suivant SCI qui peut influencer des analyses en aval. Avec l’augmentation des analyses à cellules individuelles, il est essentiel de s’assurer que les différences observées dans l’expression des gènes ne sont pas simplement le résultat de perturbations induites par la dissociation, mais sont vraiment représentatives des changements biologiques sous-jacents pertinents au modèle de la maladie. L’utilisation de données d’expression accessibles au public nous a permis de modifier la formulation des tampons de digestion afin d’assurer une digestion efficace de la matrice extracellulaire tout en maximisant la viabilité. D’autres modifications qui pourraient être considérées dans les applications futures incluent l’ajout de l’actinomycine D, pour arrêter la transcription des gènes tôt immédiats qui sont sensibles au protocole de dissociation15.
La technique de pipetage est cruciale lors de la dissociation des tissus ou du transfert de cellules déjà en suspension. Pour réduire les dommages physiques aux cellules des forces de cisaillement, il est important de pipette doucement et lentement pendant la résuspension cellulaire. Il est généralement recommandé d’utiliser des pointes de pipette à alésage large. Si vous utilisez des pointes standard, il est particulièrement important de pipette suspensions cellulaires doucement pour éviter les forces de cisaillement qui autrement endommager les cellules. L’utilisation de passoires cellulaires est inévitable dans ce protocole, cependant, la concentration cellulaire peut diminuer de 20% ou plus, accompagnée d’une perte de volume de 100 μL ou plus. Nous recommandons que la concentration cellulaire soit déterminée après la tension afin d’assurer un dénombrement précis des cellules.
Dans la cytométrie de débit, les contrôles fmo fournissent une mesure de fond due à la purge du signal des pics d’émission qui se chevauchent. Il ne s’agit pas d’une mesure de liaison non spécifique des anticorps ou d’une coloration de fond qui peut être présente lorsqu’un anticorps est inclus dans ce canal. Pour tenir compte de la liaison anticorps non spécifique, il faut inclure des contrôles appropriés de l’isotype; pour la coloration de fond, il faut inclure des contrôles négatifs. Pris ensemble, ces contrôles assurent une mesure précise des populations cellulaires.

Les perturbations de la fonction normale de la vessie urinaire peuvent entraîner une diminution de la qualité de vie de nombreuses personnes. Afin d’acquérir une meilleure compréhension de la façon dont les blessures ou les maladies font dérailler la fonction normale de la vessie, il est important de sonder l’état biologique normal des cellules dans la vessie et comment elles changent sous perturbation expérimentale. Jusqu’ici, cependant, les populations spécifiques de cellules qui résident dans la vessie urinaire, et comment elles changent avec des dommages, ont été incomplètement caractérisées.
Les méthodes de profilage à cellules simples telles que la cytométrie d’écoulement ou le séquençage de l’ARN unicellule (scRNA-seq) ont le potentiel de faire la lumière sur des types de cellules spécifiques dans la vessie. Toutefois, pour que ces approches soient informatives, les tissus doivent être digérés d’une manière qui n’affecte pas la viabilité, l’expression des gènes et les pourcentages représentatifs de population cellulaire du tissu récolté. Les protocoles qui emploient la désagrégation enzymatique peuvent avoir un impact sur l’expression des marqueurs de surface par l’activité indiscriminée de la protéase1,ce qui a un impact sur l’identification cellulaire par cytométrie de flux, tandis que le processus de dissociation lui-même peut conduire à l’induction de gènes précoces immédiats, comme décrit récemment par Van den Brink etses collègues 2. Les auteurs ont prouvé que bien que la sous-population dissociation-affectée était petite, elle pourrait déclencher un signal contaminant fort dans des études d’expression en vrac dues aux niveaux élevés d’expression des gènes tôt immédiats. En outre, la durée du protocole de dissociation a affecté les niveaux d’expression en vrac détectés des gènes montrés pour être uniques à certaines sous-populations. Ainsi, les ensembles de données à cellules simples générés sans tenir compte de l’impact du protocole de dissociation peuvent produire des changements d’expression génétique découlant de la méthode de dissociation, par opposition à la biologie sous-jacente. Ces observations suggèrent que les données publiées sur la transcriptomics à cellule unique doivent être interprétées avec prudence et que les résultats devraient être validés par des méthodes indépendantes.
Bien que, des méthodes de dissociation dures et longues puissent modifier l’expression des gènes dans lescellules 2; l’isolement efficace des cellules est essentiel pour obtenir une représentation précise des types de cellules présents. Puisque la vessie est un organe complexe comprenant plusieurs types de cellules, certaines populations telles que les cellules urothelial ou stromal peuvent être relativement sous-représentées tandis que d’autres types de cellules telles que les fibroblastes existent dans la matrice extracellulaire et peuvent être difficiles à isoler. La dissociation devient encore plus difficile si la vessie a subi le remodelage et la fibrose significatifs tels que celui observé dans les dommages de moelleépinière 3,4 ou obstruction de sortie de réservoir souple5,6.
Ici, nous décrivons une méthode optimisée de dissociation de tissu pour l’analyse simple en aval de cellules dans la vessie blessée de souris de moelle épinière. En utilisant la cytométrie de flux, nous avons comparé quatre protocoles de digestion enzymatiques pour leur capacité à produire une suspension cellulaire unique, soutenir la viabilité cellulaire et maintenir la proportion correcte de populations cellulaires. Sur la base de cette analyse, nous concluons que la minimisation de la mort cellulaire, des agrégats cellulaires, des acides nucléiques non cellulaires et des inhibiteurs potentiels de l’analyse en aval est essentielle à la réalisation de données de haute qualité.

<table><tbody><tr><td>2.5 X Loupes Loupes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-0 Suture Vicryl, Aiguille 6.5mm 3/8 cercle</td><td>ETHICON</td><td>J546</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu ; m Cell Strainer</td><td>Thermofisher</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Accutase dans BPBS, 0.5mM EDTA</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à aérosol à large orifice Pointes de pipette (1000 &micro ; L)</td> <td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à aérosol à large orifice pointes de pipette (1000 & micro ; L)</td><td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-souris CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, &kappa ;, affinité purifiée</td><td>BioLegend</td><td>118213</td><td></td></tr><tr><td>BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, &kappa ;, Clone 30-F11</td><td>BD Biosciences</td><td>564590</td><td></td></tr><tr><td>BONN Micro Pince à dissectionner, droite, 1x2 dents, 3,75" de longueur, 0,3mm de largeur de pointe, 0,12mm</td> dents <td>ROBOZ Surgical Instrument CompanyInc.</td><td>RS-5172</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>2115-250ML</td><td></td></tr><tr><td>CASTROVIEJO Micro Porte-aiguille de suture, droit avec serrure, longueur 5,75"</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td><td>RS-6412</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Kit de comptage cellulaire, 30 lames à double chambre, 60 unités, avec bleu trypan</td><td>Biorad</td><td>1450003</td><td></td></tr><tr><td>tampon de coloration cellulaire</td><td>BioLegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td></td><td></td>LS004196</tr><tr><td>Collagénase de type III</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004182</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type 6</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS005319</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’apoptose à cellules mortes avec annexine V Alexa Fluor 488 & Iodure de propidium (PI)</td><td>Thermofisher</td><td>V13241</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacine (Baytril)</td><td>Bayer Health Care LLC,NADA</td> <td># 140-913 Approuvé par la FDA. N° de lot : AH01CGP</td><td>Solution injectable à 2,27 %</td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Tubes à centrifuger coniques</td><td>Fisher Scientific</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Tubes à centrifuger coniques</td><td>Fisher Scientific</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-souris Ly-6A/E (Sca-1) Anticorps, rat monoclonal, IgG2a, &kappa ;, affinité purifiée</td><td>BioLegend</td><td>122505</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase à partir de testicules de mouton, type II</td><td>Sigma</td><td>H2126</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (100 & micro ; m)</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-110-917</td><td></td></tr><tr><td>McPHERSON-VANNAS, Ciseaux à ressort de micro-dissection, droits, longueur 4", largeur de pointe de 0,15 mm</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td><td>RS-5630</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-891-7959</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS003119</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris CD19 PE/Cy5, monoclonal de rat, IgG2a, &kappa ;,</td><td>bioLegend</td><td>115509</td><td>canal</td></tr> <tr><td>de décharge purifié par affinitéPE/Cy5 anti-souris CD3&epsilon ; Anticorps, monoclonal de hamster arménien, IgG, Transmission d’affinité BioLegend</td><td></td><td>100309</td><td>Canal de vidange</td></tr><tr><td>Anticorps CD4 anti-souris PE/Cy5, monoclonal de rat, IgG2b, &kappa ;, Pureté d’affinité</td><td>BioLegend</td><td>100409</td><td>Canal de vidage</td></tr><tr><td>PE/Cy5 Anticorps anti-souris CD8a de rat, monoclonal de rat, IgG2a, &kappa ;, BioLegend purifié d’affinité</td><td></td><td>100709</td><td>Canal</td></tr> <tr><td>de vidageAnticorps PE/Cy5 anti-souris NK-1.1, souris monoclonale, IgG2a, &kappa ;, bioLegend 108715 d’affinité purifiée</td><td></td><td></td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-souris TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, &kappa ;, bioLegend purifié par affinité</td><td></td><td>116209</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>anti-souris CD16/CD32 (souris BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, &kappa ;, clone 2.4G2</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse RBC (10X)</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse des globules rouges 1x</td><td>Biolegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à microcentrifuger à bouchon à vis, 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Compteur de cellules automatisé</td><td>Biorad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Pommade antibiotique triple (néomycine/polymyxine B/ bacitracine)</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-7216</td><td>protecteur de la peau</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (10X), sans rouge de phénol</td><td>Thermofisher</td><td>A1217701</td><td></td></tr><tr><td>Vetropolycine pommade oculaire</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>NADA # 065-016. Approuvé par la FDA.</td><td>protéger les yeux pendant l’anesthésie</td></tr></tbody></table>

une approche de dissociation à cellule unique pour l’analyse moléculaire de la vessie urinaire chez la souris à la suite d’une lésion de la moelle épinière

A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

Nous décrivons la mise en œuvre des dommages de moelle épinière chez les souris pour obtenir la dyssynergie de detrusor-sphincter, une obstruction fonctionnelle de sortie de réservoir souple, et le remodelage ultérieur de mur de réservoir souple. Pour faciliter l’évaluation de la composition cellulaire de la paroi vésicale chez les souris blessées au contrôle non blessées et à la moelle épinière, nous avons mis au point un protocole de dissociation optimisé qui favorise la viabilité des cellules élevées et permet la détection de sous-populations discrètes par cytométrie d’écoulement.
Les lésions médullaires sont créées par une transection complète de la moelle épinière thoracique. Au moment de la récolte des tissus, l’animal est perfusé de solution saline tamponnée de phosphate sous anesthésie profonde et les vessies sont récoltées dans le tampon de Tyrode. Les tissus sont émincés avant l’incubation dans le tampon de digestion qui a été optimisé en fonction de la teneur en collagène de la vessie souris tel que déterminé par l’interrogation de bases de données d’expression génétique accessibles au public. Après la génération d’une suspension cellulaire unique, le matériau est analysé par cytométrie d’écoulement pour évaluer la viabilité cellulaire, le nombre de cellules et les sous-populations spécifiques. Nous démontrons que la méthode donne des populations cellulaires avec plus de 90% de viabilité, et une représentation robuste des cellules d’origine mésenchymale et épithéliale. Cette méthode permettra une analyse précise en aval des types de cellules discrètes dans la vessie de souris et potentiellement d’autres organes.

Intervention chirurgicale Le succès de la transection thoracique de moelle épinière est déterminé par l’évaluation d’un certain nombre de paramètres, dont le plus évident est la paralysie postérieur. L’animal ne se déplace qu’à l’aide de ses membres antérieurs, traînant ses limites postérieures. Sinon, les niveaux d’activité, y compris l’alimentation, le toilettage et la vigilance sont généralement normaux. En outre, les animaux perdent le contrôle volitionnel de réservoir souple ayant pour résultat le besoin de l’expression manuelle de réservoir souple par l’investigateur tous les 12 h jusqu’à ce que l’annulation réflexe revienne à 10 à 14 jours après blessure. Après l’euthanasie, les signes additionnels du succès de la blessure se rapportent principalement à l’augmentation du rapport de poids de réservoir souple-corps, indicatif du remodelage de tissu. L’analyse histologique révèle l’hyperplasie dans les compartiments musculaires urothelial etlisses 3.
Préparation de la suspension à cellule unique À l’aide de données d’expression accessibles au public, l’enrichissement du tissu vésical pour les protéines de matrice extracellulaire a été déterminé (figure 2) et utilisé pour éclairer la formulation du mélange de digestion. Puisque les collagènes sont des composants clés de laparoi vésicale 11,12, nous avons d’abord cherché à déterminer le collagène le plus abondant (s) dans la vessie de souris en utilisant des ensembles de données de profilage d’ARN générés par le projet Mouse ENCODE13. Notre analyse a montré que le collagène 1A1, collagène 3A1, collagène 1A2 et collagène 6A1 sont les types de collagène les plus abondants dans la vessie de souris (Figure 2A). Nous avons également utilisé le Tabula Muris (un recueil de données de transcriptome à cellule unique de souris (Mus musculus))8 pour déterminer le niveau d’expression de l’ARNm des collagènes 1, 3, 6 et hyaluronan. Les données permettent une comparaison directe et contrôlée de l’expression des gènes dans les types de cellules partagées entre les tissus. Cette analyse a révélé que l’expression de ces composants de matrice extracellulaire est plus répandue dans les types de cellules mésenchymales plutôt que dans l’urothelium (figure 2B).
Effet de la dissociation sur la viabilité des cellules isolées de la vessie L’analyse de cytométrie de flux a démontré que la digestion enzymatique utilisant les 4 protocoles différents a donné la viabilité de 83%, 86%, 93% ou 90%, respectivement. Ainsi, l’article 3 du protocole a été jugé le plus précieux pour la préservation de la viabilité cellulaire. Nous avons également observé qu’environ 4 % des cellules étaient nécrotiques (PI+/Annexin V-) (Figure 4A). Ces observations mettent l’accent sur l’efficacité du protocole de digestion et l’avantage qui en a résulté sur la viabilité cellulaire.
Effet des lésions médullaires sur différentes populations de cellules de la vessie Nous avons observé une augmentation significative du nombre total de cellules dans les vessies des souris SCI par rapport aux témoins. Le modèle des parcelles à points obtenues à partir des vessies SCI était également légèrement différent compatible avec le remodelage continu de l’organe en raison d’une lésion de la moelleépinière (figure 4B: première colonne). Comparées aux contrôles, les vessies des animaux de SCI ont montré une augmentation significative des cellules CD45-positives.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig01.jpg"> Figure 1 : Achèvement représentatif de perfusion avec la couleur allégée du foie. (A) Démontre la couleur du foie au début de la perfusion. (B) Affiche la couleur du foie allégée à la fin de la perfusion. La souris dans (A) a eu la transection de moelle épinière deux semaines avant perfusion ayant pour résultat l’hypertrophie de réservoir souple et sa saillie hors du bassin à la différence de la souris dans (B) qui n’a pas eu des dommages de moelle épinière ; dans ce cas, la vessie est petite et cachée dans le bassin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig01large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig02.jpg"> Figure 2 : Expression transcriptomique des composants de la matrice extracellulaire (ECM) dans la vessie de la souris. (A) Diagramme à barres de 43 types de collagène différents. L’expression est indiquée par Reads Per Kilobase de transcription, par million de lecture cartographiée (RPKM) (les données sont recueillies à partir de BioProject: PRJNA66167)14. (B) Parcelles de violon de l’expression des gènes dans les types cellulaires obtenus à partir de gouttelettes microfluidiques à base de 3'-end comptant dans un pool d’échantillons de vessies urinaires dissociées mâles et féminins (hommes et femmes). Les dénombrements ont été normalisés pour chaque cellule à l’aide du logarithme naturel de 1+ dénombrement par million de ln (CPM+1)8. Un pseudocomte de 1 CPM a été ajouté avant de prendre des logarithmes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig02large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig03.jpg"> Figure 3 : Stratégie de gating et contrôles fmo pour déterminer la propagation de fluorescence. (A) Sélection de la population cellulaire. (B) Stratégie de gating pour les singlets. (C) Gating pour les cellules apoptotiques précoces et tardives utilisant l’anticorps PI et Annexin V. (D\u2012F) Une parcelle schématique de cytométrie d’écoulement multicolore (p. ex., anticorps conjugués à A, B, C, D fluorochromes + (Annexe V et IP). Ceci montre la fluorescence écartée dans l’anticorps avec le canal fluorochrome A montré par le contrôle de FMO comparé à un contrôle non taché. La ligne pointillée orange représente la limite de gation fmo comparée à la limite non tachée en rouge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig03large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig04.jpg"> Figure 4 : Cytométrie d’écoulement de différents types de cellules dans la vessie. (A) Annexin V / PI double coloration des graphiques de flux. Les différentes combinaisons d’enzymes et de produits chimiques utilisés pour chaque protocole sont représentées devant la parcelle de viabilité correspondante. Ces données démontrent que la viabilité la plus élevée a été obtenue avec l’article 3 du protocole. (B) Histogrammes représentatifs illustrant l’intensité de Ly-6A/E (Sca-1) et CD326 (Ep-CAM) détectés dans les canaux simples. (C) Effet de sci sur la population cellulaire de la vessie de souris. Le panneau supérieur montre les résultats de la coloration sur trois vessies dissociées obtenues à partir de souris non chirurgicales témoins et le panneau inférieur montre les résultats de la coloration sur trois animaux atteints de SCI. La première colonne est la population cellulaire totale. La deuxième colonne montre la sélection de gating singlet. La troisième colonne montre la sous-population de cellules vivantes qui sont négatives pour les cellules B, les cellules T et les cellules NK. La quatrième colonne montre la coloration des cellules vivantes positives pour le CD45. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig04large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Composant</td>
			<td>Montant (pour 500 mL)</td>
			<td>Molarité</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>4.091 g</td>
			<td>140 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>0,186 g</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>0,0476 g</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
			<td>0,9 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>1,19 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Composants pour la préparation de la solution de Tyrode. Les composants indiqués sont pour la préparation de la solution tyrode de 500 mL.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Composant</td>
			<td>Montant</td>
			<td>Protocole section 1</td>
			<td>Section 2 du protocole</td>
			<td>Section 3 du protocole</td>
			<td>Section 4 du protocole</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bsa</td>
			<td>5 mg</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,03 mM</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagène Type I</td>
			<td>132,5 unités</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagène Type III</td>
			<td>96,4 unités</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagène Type VI</td>
			<td>50 unités</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Oui</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnase</td>
			<td>10 unités</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papaïne</td>
			<td>115 unités</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pan Collagène</td>
			<td>50 unités</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
			<td>10,5 unités</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase II</td>
			<td>1,25 unité</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution de dissociation cellulaire</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>Oui</td>
			<td>-</td>
			<td>Oui</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzyme recombinante</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>Oui</td>
			<td>-</td>
			<td>Oui</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Composants pour la préparation du tampon de digestion. Les composants indiqués sont pour la préparation du mélange de digestion de 2,5 mL (1 U catalyse l’hydrolyse de 1 μmol par substrat par minute à 37 °C. Consultez la fiche de données du produit pour la définition de l’unité de chaque enzyme).

Le but de ce protocole est d’appliquer un protocole optimisé de dissociation des tissus à un modèle muran de lésions médullaires et de valider l’approche pour l’analyse d’une seule cellule par cytométrie de flux.

Une approche de dissociation à cellule unique pour l’analyse moléculaire de la vessie urinaire chez la souris à la suite d’une lésion de la moelle épinière

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and ...

Ce protocole est important car il utilise des informations biologiques pour faciliter la génération d’une suspension unicellulaire à haute viabilité cellulaire. Le principal avantage de cette technique est la possibilité de générer des suspensions unicellulaires qui conservent une viabilité cellulaire élevée et une représentation appropriée des types de cellules isolées. La démonstration de la procédure chirurgicale sera faite par Hussein Atta, un membre de mon laboratoire.La démonstration de la procédure de dissociation tissulaire sera assurée par Ali Hashemi et l’analyse FACS, Yaser Heshmati. Après avoir confirmé une absence de réponse au réflexe de pédale chez une souris adulte anesthésiée, palpez l’apophyse épineuse la plus proéminente de la colonne thoracique. Une analgésie et des antibiotiques sont administrés avant la chirurgie.Rasez un rectangle longitudinal sur le dos de la souris, du bas du cou jusqu’à juste en dessous de l’apophyse épineuse la plus proéminente et d’un centimètre de chaque côté de la ligne médiane. Désinfectez la peau exposée trois fois avec des lingettes séquentielles à 10 % de povidone iodée et à 70 % d’éthanol de manière circulaire en commençant par le site de l’incision et en allant vers l’extérieur. Après le dernier essuyage, couvrez la souris avec un morceau stérile d’éponge de gaze de quatre pouces sur quatre avec une fenêtre sur le champ opératoire.Pour induire la lésion de la moelle épinière, faites d’abord une incision de 1,5 centimètre au milieu du dos et utilisez une dissection contondante pour séparer les muscles des apophyses épineuses et des lames des vertèbres T9, T10 et T11. À l’aide de ciseaux fins, divisez nettement les ligaments interépineux entre T9 et T10 et T10 et T11 avant d’effectuer une laminectomie bilatérale de l’apophyse épineuse T10. Lorsque les lames ont été complètement excisées, utilisez les ciseaux pour transecter la moelle épinière.Pour couper complètement les colonnes latérales, balayez délicatement la pointe des ciseaux fins des deux côtés. Utilisez une application d’embout en coton stérile pour comprimer tout saignement. Après avoir atteint l’homéostasie, fermez la peau avec des sutures continues 7-0 polyglactin910 et administrez par voie sous-cutanée un millilitre de solution saline pour prévenir la déshydratation postopératoire, puis retournez l’animal dans une cage fraîche avec surveillance jusqu’à ce qu’il décubise complètement.Toutes les 12 heures, en tenant l’animal d’une main et en massant le bas-ventre de l’autre, utilisez l’index et le pouce pour localiser et comprimer doucement la vessie distendue afin de stimuler l’expression manuelle de la vessie jusqu’à ce que l’animal soit capable d’uriner tout seul. Pour l’analyse en aval des types de cellules vésicales d’intérêt, au moment expérimental approprié et une fois que l’animal est adéquatement anesthésié, effectuer une laparotomie médiane du bassin au diaphragme et couper le diaphragme loin des côtes. En suivant la bordure du cartilage osseux parallèle au sternum, ouvrez le thorax le long des côtes des deux côtés de l’animal en commençant par le diaphragme et en continuant jusqu’à la première côte.Après avoir fixé la paroi thoracique antérieure sur la tête de l’animal, utilisez des ciseaux fins pour couper le péricarde et connectez une aiguille de calibre 23 à l’appareil de perfusion. Insérez l’aiguille dans le ventricule gauche et avancez lentement l’aiguille dans l’aorte sans perforer le tissu. Lorsque l’aiguille est en place, commencez à injecter du PBS dans le tissu à un débit de 15 millilitres par minute et utilisez les pointes d’une paire de ciseaux fins pour faire rapidement une petite incision dans l’oreillette droite.Lorsque le drainage est clair et qu’une couleur hépatique éclaircie peut être observée, arrêtez la perfusion et libérez la vessie des pédicules vasculaires et de l’urètre, puis placez la vessie dans un tube de microcentrifugation contenant la solution glacée de Tyrode. Pour préparer une suspension à cellule unique, lorsque toutes les vessies ont été recueillies, déchirez un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant 100 microlitres de solution de Tyrode. Après la pesée, hachez les vessies dans une boîte de Pétri de 10 centimètres contenant 100 microlitres de solution de Tyrode et utilisez une pointe de pipette à large diamètre pour transférer les fragments de tissu dans 2,5 millilitres de tampon de digestion par vessie.Incuber le tissu pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius sur un mélangeur Nutator et utiliser une pipette de cinq millilitres pour triturer l’échantillon pendant une minute avant de prélever les cellules et les tissus dissociés par centrifugation. Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de solution de détachement de cellules et placez les cellules sur le mélangeur Nutator pendant 10 minutes supplémentaires. À la fin de l’incubation, récupérez les cellules avec une autre centrifugation et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de lyse des globules rouges.Au bout d’une minute, arrêtez la lyse avec l’ajout de neuf millilitres de PBS et filtrez les cellules à travers une crépine de 70 micromètres dans un tube de 50 millilitres, puis centrifugez à nouveau les cellules et remettez en suspension la pastille dans 200 microlitres de tampon de coloration complété par un bloc FC. Après une incubation de 10 minutes sur de la glace, prélever les cellules par centrifugation et remettre la pastille en suspension dans le volume approprié de mélange maître d’anticorps conjugués aux fluorophores pendant 20 minutes sur de la glace à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les cellules avec un millilitre de tampon de coloration cellulaire et remettre la pastille en suspension dans 100 microlitres de tampon de coloration cellulaire fraîche complété par cinq microlitres de FITC Annexine V et un microlitre d’iodure de propidium.Après 15 minutes à température ambiante, ajoutez 400 microlitres de tampon de liaison à l’annexine dans les cellules et mélangez par inversion. Pour analyser les cellules par cytométrie en flux, utilisez d’abord un échantillon de cellules non colorées pour définir les paramètres de diffusion latérale et directe des cellules, puis mesurez l’émission de fluorescence à 530 nanomètres et supérieure à 575 nanomètres pour exclure les cellules mortes. Utilisez les grilles de chaque tache de point pour définir la population négative dans la première désintégration et utilisez les commandes de fluorescence moins un pour corriger le chevauchement spectral jusqu’à ce que les milieux de population négatifs et positifs soient alignés.Mesurez ensuite 100 000 événements des cellules avec les marqueurs d’intérêt spécifiques, en créant des portes pour les populations cellulaires d’intérêt si nécessaire. Lorsque tous les échantillons ont été analysés, analysez les données à l’aide du logiciel d’analyse de cytométrie en flux approprié. Le collagène 1A1, le collagène 3A1, le collagène 1A2 et le collagène 6A1 sont les types de collagène les plus abondants trouvés dans la vessie de souris.L’analyse visant à déterminer les niveaux d’expression de l’ARNm des collagènes un, trois, six et hyaluronane révèle que l’expression de ces composants de la matrice extracellulaire est plus prévalente dans les populations de cellules mésenchymateuses que dans l’urothélium. L’analyse cytométrique en flux indique que plusieurs protocoles de digestion enzymatique différents produisent des populations cellulaires hautement viables, le troisième protocole de digestion utilisé dans cette analyse étant déterminé comme étant le plus efficace pour la préservation des cellules. En utilisant cette méthode, une augmentation significative du nombre total de cellules isolées des vessies de souris atteintes de lésions de la moelle épinière peut être obtenue pour la comparer aux vessies témoins.Par rapport aux témoins, les vessies des animaux atteints de lésions de la moelle épinière présentent également une augmentation significative des cellules CD45 positives. L’étape 7.1 est importante pour l’identification dans la population cardiaque. La stratégie de déclenchement doit être éclairée par les cellules d’intérêt.Les vessies des animaux LME ont une population cellulaire distincte. Ce protocole peut être utilisé pour le tri cellulaire, la culture de cellules primaires, le séquençage de cellules uniques et d’autres procédures moléculaires et cellulaires en aval qui nécessitent des cellules uniques viables. Ce protocole offre une viabilité élevée et donc une faible perte de population cellulaire, ce qui est un point clé pour les techniques d’analyse de cellules uniques telles que le séquençage de l’ARN sur cellule unique.

a-single-cell-dissociation-approach-for-molecular-analysis-urinary

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Isoler des cellules souches adultes provenant de tissus mous musculosquelettiques basé sur la vitesse adhésion de la cellule dans le ballon.

Isoler des cellules souches à partir des tissus mous musculo-squelettiques

Une procédure optimisée pour purifier la crête neurale-dérivés progéniteurs neuronaux à partir de tissus fœtaux de souris est décrite. Cette méthode tire parti d'expression parmi les allèles rapporteurs fluorescents d'isoler des populations distinctes par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). La technique peut être appliquée pour isoler les sous-populations neuronales au cours du développement ou de tissus adultes.

Une procédure optimisée pour Fluorescence-activated tri cellulaire (FACS) Isolement du système nerveux autonome progéniteurs neuronaux de viscères de souris sur le fœtus

Source : Yang, E., et al. Isolement de communautés bactériennes intracellulaires uniques générées à partir d’un modèle murien d’infection urinaire pour une analyse monocellulaire en aval. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo démontre l’isolement manuel de cellules épithéliales individuelles contenant des communautés bactériennes intracellulaires à partir de vessie infectée de souris à l’aide de micropipetage buccal, permettant une analyse monocellulaire en aval des populations viables d’E. coli...

Isolement des cellules épithéliales de la vessie de souris contenant des communautés bactériennes intracellulaires

Le modèle établi de cathétérisme transuréthrale de la souris permet l’étude des pathologies de la vessie, y compris les infections urinaires, mais ne peut être effectué chez les femelles. Un nouveau modèle de mâle instillation transurétrale, présenté ici, permettra des recherches dans une région marquée par fortes différences cliniques et épidémiologiques entre les sexes.

Infection des voies urinaires chez un modèle Animal petit : cathétérisme transuréthrale de souris mâles et femelles

Ici, nous démontrons la performance d’un modèle de blessures médullaires minime dans une souris adulte qui épargne la niche de canal central logement cellules souches neuronales endogènes (CNS). Nous montrons comment le dosage Neurosphère peut être utilisé pour quantifier l’activation et la migration des CNS primitifs et définitifs après une blessure.

Un dosage Neurosphère pour évaluer l’Activation endogène cellules souches neurales dans un modèle murin de minime de la moelle épinière

Ce protocole décrit une méthode simple permettant d’isoler les cellules épithéliales unique, infectés par la vessie d’un modèle murin d’infection urinaire.

Isolement des simples communautés bactériennes intracellulaires généré à partir d’un modèle murin d’Infection des voies urinaires pour l’analyse de cellules individuelles en aval

Ce protocole tente d’établir un protocole reproductible pour les neurones primaires et l’isolement glia de la vessie de rat pour d’autres expériences cellulaires.

Isolement et culture des neurones primaires et glia de la vessie urinaire adulte de rat

Ce protocole de dissociation des cellules neurales est destiné aux échantillons avec une faible quantité de matière première et donne une suspension unicellulaire hautement viable pour l’analyse en aval, avec des étapes de fixation et de coloration facultatives.

Dissociation mécanique et enzymatique combinée du tissu hippocampique du cerveau de la souris

Ce protocole décrit le processus de génération et de caractérisation des organoïdes urothéliaux de souris hébergeant des délétions dans les gènes d’intérêt. Les méthodes comprennent la récolte de cellules urothéliales de souris, la transduction ex vivo avec adénovirus conduisant l’expression de Cre avec un promoteur CMV, et la caractérisation in vitro et in vivo .

Ex Vivo Modèle organoïde de délétions de gènes médiés par l’adénovirus-Cre dans des cellules urothéliales de souris

Ce protocole décrit l’isolement des astrocytes purifiés et de la microglie de la moelle épinière de souris adulte, facilitant ainsi les applications ultérieures telles que l’analyse de l’ARN et la culture cellulaire. Il comprend des méthodes et des procédures détaillées de dissociation cellulaire conçues pour améliorer à la fois la qualité et le rendement des cellules isolées.

Isolement d’astrocytes purs et de microglies de la moelle épinière de souris adulte pour des essais in vitro et des études transcriptomiques

Cette étude présente deux techniques expérimentales cruciales : la construction d’un modèle de plaie murine pour évaluer la fermeture de la plaie et la préparation de suspensions unicellulaires à partir de peau murine pour préserver la viabilité cellulaire.

Modèles de plaies chez la souris et préparation de suspensions de cellules uniques

Découvrez une méthode de dissociation tissulaire optimisée pour l'analyse de cellules uniques de la vessie chez la souris après lésion de la moelle épinière. Cette technique génère des suspensions cellulaires à haute viabilité pour la cytométrie en flux.

Une approche de dissociation à cellule unique pour l’analyse moléculaire de la vessie urinaire chez la souris à la suite d’une lésion de la moelle épinière (Vidéo) | JoVE Journal

Une approche de dissociation à cellule unique pour l’analyse moléculaire de la vessie urinaire chez la souris à la suite d’une lésion de la moelle épinière

Explorer plus de vidéos