Une approche de dissociation à cellule unique pour l’analyse moléculaire de la vessie urinaire chez la souris à la suite d’une lésion de la moelle épinière

Ce protocole est important car il utilise des informations biologiques pour faciliter la génération d’une suspension unicellulaire à haute viabilité cellulaire. Le principal avantage de cette technique est la possibilité de générer des suspensions unicellulaires qui conservent une viabilité cellulaire élevée et une représentation appropriée des types de cellules isolées. La démonstration de la procédure chirurgicale sera faite par Hussein Atta, un membre de mon laboratoire.

La démonstration de la procédure de dissociation tissulaire sera assurée par Ali Hashemi et l’analyse FACS, Yaser Heshmati. Après avoir confirmé une absence de réponse au réflexe de pédale chez une souris adulte anesthésiée, palpez l’apophyse épineuse la plus proéminente de la colonne thoracique. Une analgésie et des antibiotiques sont administrés avant la chirurgie.

Rasez un rectangle longitudinal sur le dos de la souris, du bas du cou jusqu’à juste en dessous de l’apophyse épineuse la plus proéminente et d’un centimètre de chaque côté de la ligne médiane. Désinfectez la peau exposée trois fois avec des lingettes séquentielles à 10 % de povidone iodée et à 70 % d’éthanol de manière circulaire en commençant par le site de l’incision et en allant vers l’extérieur. Après le dernier essuyage, couvrez la souris avec un morceau stérile d’éponge de gaze de quatre pouces sur quatre avec une fenêtre sur le champ opératoire.

Pour induire la lésion de la moelle épinière, faites d’abord une incision de 1,5 centimètre au milieu du dos et utilisez une dissection contondante pour séparer les muscles des apophyses épineuses et des lames des vertèbres T9, T10 et T11. À l’aide de ciseaux fins, divisez nettement les ligaments interépineux entre T9 et T10 et T10 et T11 avant d’effectuer une laminectomie bilatérale de l’apophyse épineuse T10. Lorsque les lames ont été complètement excisées, utilisez les ciseaux pour transecter la moelle épinière.

Pour couper complètement les colonnes latérales, balayez délicatement la pointe des ciseaux fins des deux côtés. Utilisez une application d’embout en coton stérile pour comprimer tout saignement. Après avoir atteint l’homéostasie, fermez la peau avec des sutures continues 7-0 polyglactin910 et administrez par voie sous-cutanée un millilitre de solution saline pour prévenir la déshydratation postopératoire, puis retournez l’animal dans une cage fraîche avec surveillance jusqu’à ce qu’il décubise complètement.

Toutes les 12 heures, en tenant l’animal d’une main et en massant le bas-ventre de l’autre, utilisez l’index et le pouce pour localiser et comprimer doucement la vessie distendue afin de stimuler l’expression manuelle de la vessie jusqu’à ce que l’animal soit capable d’uriner tout seul. Pour l’analyse en aval des types de cellules vésicales d’intérêt, au moment expérimental approprié et une fois que l’animal est adéquatement anesthésié, effectuer une laparotomie médiane du bassin au diaphragme et couper le diaphragme loin des côtes. En suivant la bordure du cartilage osseux parallèle au sternum, ouvrez le thorax le long des côtes des deux côtés de l’animal en commençant par le diaphragme et en continuant jusqu’à la première côte.

Après avoir fixé la paroi thoracique antérieure sur la tête de l’animal, utilisez des ciseaux fins pour couper le péricarde et connectez une aiguille de calibre 23 à l’appareil de perfusion. Insérez l’aiguille dans le ventricule gauche et avancez lentement l’aiguille dans l’aorte sans perforer le tissu. Lorsque l’aiguille est en place, commencez à injecter du PBS dans le tissu à un débit de 15 millilitres par minute et utilisez les pointes d’une paire de ciseaux fins pour faire rapidement une petite incision dans l’oreillette droite.

Lorsque le drainage est clair et qu’une couleur hépatique éclaircie peut être observée, arrêtez la perfusion et libérez la vessie des pédicules vasculaires et de l’urètre, puis placez la vessie dans un tube de microcentrifugation contenant la solution glacée de Tyrode. Pour préparer une suspension à cellule unique, lorsque toutes les vessies ont été recueillies, déchirez un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant 100 microlitres de solution de Tyrode. Après la pesée, hachez les vessies dans une boîte de Pétri de 10 centimètres contenant 100 microlitres de solution de Tyrode et utilisez une pointe de pipette à large diamètre pour transférer les fragments de tissu dans 2,5 millilitres de tampon de digestion par vessie.

Incuber le tissu pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius sur un mélangeur Nutator et utiliser une pipette de cinq millilitres pour triturer l’échantillon pendant une minute avant de prélever les cellules et les tissus dissociés par centrifugation. Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de solution de détachement de cellules et placez les cellules sur le mélangeur Nutator pendant 10 minutes supplémentaires. À la fin de l’incubation, récupérez les cellules avec une autre centrifugation et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de lyse des globules rouges.

Au bout d’une minute, arrêtez la lyse avec l’ajout de neuf millilitres de PBS et filtrez les cellules à travers une crépine de 70 micromètres dans un tube de 50 millilitres, puis centrifugez à nouveau les cellules et remettez en suspension la pastille dans 200 microlitres de tampon de coloration complété par un bloc FC. Après une incubation de 10 minutes sur de la glace, prélever les cellules par centrifugation et remettre la pastille en suspension dans le volume approprié de mélange maître d’anticorps conjugués aux fluorophores pendant 20 minutes sur de la glace à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les cellules avec un millilitre de tampon de coloration cellulaire et remettre la pastille en suspension dans 100 microlitres de tampon de coloration cellulaire fraîche complété par cinq microlitres de FITC Annexine V et un microlitre d’iodure de propidium.

Après 15 minutes à température ambiante, ajoutez 400 microlitres de tampon de liaison à l’annexine dans les cellules et mélangez par inversion. Pour analyser les cellules par cytométrie en flux, utilisez d’abord un échantillon de cellules non colorées pour définir les paramètres de diffusion latérale et directe des cellules, puis mesurez l’émission de fluorescence à 530 nanomètres et supérieure à 575 nanomètres pour exclure les cellules mortes. Utilisez les grilles de chaque tache de point pour définir la population négative dans la première désintégration et utilisez les commandes de fluorescence moins un pour corriger le chevauchement spectral jusqu’à ce que les milieux de population négatifs et positifs soient alignés.

Mesurez ensuite 100 000 événements des cellules avec les marqueurs d’intérêt spécifiques, en créant des portes pour les populations cellulaires d’intérêt si nécessaire. Lorsque tous les échantillons ont été analysés, analysez les données à l’aide du logiciel d’analyse de cytométrie en flux approprié. Le collagène 1A1, le collagène 3A1, le collagène 1A2 et le collagène 6A1 sont les types de collagène les plus abondants trouvés dans la vessie de souris.

L’analyse visant à déterminer les niveaux d’expression de l’ARNm des collagènes un, trois, six et hyaluronane révèle que l’expression de ces composants de la matrice extracellulaire est plus prévalente dans les populations de cellules mésenchymateuses que dans l’urothélium. L’analyse cytométrique en flux indique que plusieurs protocoles de digestion enzymatique différents produisent des populations cellulaires hautement viables, le troisième protocole de digestion utilisé dans cette analyse étant déterminé comme étant le plus efficace pour la préservation des cellules. En utilisant cette méthode, une augmentation significative du nombre total de cellules isolées des vessies de souris atteintes de lésions de la moelle épinière peut être obtenue pour la comparer aux vessies témoins.

Par rapport aux témoins, les vessies des animaux atteints de lésions de la moelle épinière présentent également une augmentation significative des cellules CD45 positives. L’étape 7.1 est importante pour l’identification dans la population cardiaque. La stratégie de déclenchement doit être éclairée par les cellules d’intérêt.

Les vessies des animaux LME ont une population cellulaire distincte. Ce protocole peut être utilisé pour le tri cellulaire, la culture de cellules primaires, le séquençage de cellules uniques et d’autres procédures moléculaires et cellulaires en aval qui nécessitent des cellules uniques viables. Ce protocole offre une viabilité élevée et donc une faible perte de population cellulaire, ce qui est un point clé pour les techniques d’analyse de cellules uniques telles que le séquençage de l’ARN sur cellule unique.