Enclos de graphène de cellules de mammifères chimiquement fixes pour microscopie électronique en phase liquide

Cette méthode maintient les échantillons biologiques dans un environnement natif et réduit l’artefact induit par le faisceau d’électrons. Le principal avantage est que cette technique s’applique aux cellules entières. Ainsi, les cellules n’ont pas besoin d’être déshydratées, tachées ou sectionnées avant la microscopie électronique.

La capacité d’image des récepteurs sur les cellules cancéreuses dans le contexte de l’ensemble de la membrane plasmatique intacte est un aspect majeur qui peut conduire à de nouvelles approches thérapeutiques et le développement de nouveaux médicaments anticancéreux. Je vais démontrer le travail avec les cellules, graphène-revêtement, et la microscopie, et Sercan Keskin montrera comment préparer le graphène. Pour commencer, ajouter 100 microlitres de suspension cellulaire à deux puits d’une plaque de puits de 96 contenant des micropuces enduites PLL et FLP avec la membrane de nitride de silicium face vers le haut et 50 microlitres de milieu sans sérum.

Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant cinq minutes pour permettre aux cellules de se fixer à la puce. Vérifiez la densité des cellules sur la puce à l’aide d’un microscope inversé et assurez-vous que les cellules recouvrent la fenêtre d’un espace suffisant pour s’aplatir et adhérer. Pour étiqueter HER2 dans les cellules, placez les micropuces dans les puits de la première rangée de la plaque d’étiquetage.

Ensuite, lavez les micropuces avec PBS BSA. Pour éviter la liaison non spécifique de l’anticorps mimétique, incuber les micropuces avec PBS BSA GS pendant cinq minutes. Puis avec 200 nanomolaires mimétiques anticorps pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.

Pour enlever le graphène PMMA du polymère, pipette quelques gouttelettes d’eau sur le polymère autour du graphène PMMA. Puis, immerger dans l’eau avec un angle de 30 à 45 degrés pour libérer le graphène PMMA. Pour graver les contaminants à base de cuivre, prépair une solution de 50 millilitres de 0,42 persulfate de sodium molaire dans l’eau.

Utilisez une glissière en verre standard pour transférer le graphène PMMA dans la solution de persulfate de sodium avec le côté graphène vers le bas. Le graphène PMMA flottera jusqu’au sommet de la solution. Laissez-le là pendant la nuit.

Le lendemain, transférez le graphène PMMA de la solution de persulfate de sodium dans de l’eau propre. Laissez-le flotter dans l’eau pendant une demi-heure. Répétez le lavage trois fois au total pour éliminer tous les résidus de persulfate de sodium du graphène PMMA.

Ensuite, transférez le graphène PMMA sur un cristal de chlorure de sodium. Préparer une solution saturée de chlorure de sodium dans l’eau dans une boîte de Pétri et transférer le graphène PMMA sur le dessus de la solution avec le côté graphène vers le bas. Tenez le cristal de chlorure de sodium avec des pinces à épiler et prenez le graphène PMMA flottant.

Ensuite, maintenez-le verticalement pendant deux minutes pour laisser l’excès d’eau s’écouler. Laisser sécher à température ambiante pendant 30 minutes et cuire au four à 100 degrés Celsius pendant 20 minutes. Retirer complètement l’eau.

Préchauffer l’acétone dans une boîte de Pétri en verre à environ 50 degrés Celsius sur une plaque chaude dans le capot de fumée. Surveillez attentivement la température pour éviter le feu. Immerger le graphène PMMA sur le sel dans la boîte de Pétri remplie d’acétone et laisser dissoudre la PMMA pendant 30 minutes.

Laissez le graphène sur le sel sécher à l’air bien avant de l’utiliser pour la préparation de l’échantillon. Lavez une puce préparée et étiquetée dans de l’eau pure pour éliminer les résidus de sel du tampon et placez-le sur du papier filtre. Les cellules doivent être visibles sous forme de taches sombres.

Utilisez une lame de rasoir pour couper le graphène multicouche sur le cristal de chlorure de sodium en une pièce qui s’adapte à la fenêtre de nitride de silicium d’une puce électronique. Retirer le graphène du cristal de chlorure de sodium en le trempant dans un bécher d’eau, en inclinant le cristal à un angle de 45 degrés par rapport à la surface. Attrapez le graphène avec une boucle métallique de la surface de l’eau, puis touchez la surface supérieure de la puce avec la surface inférieure de la boucle, ce qui fait coller la puce à la boucle métallique.

Le graphène peut être vu sur le dessus de la puce. Sous un stéréomicroscope, utiliser du papier filtre pour enlever le reste de l’eau de la puce afin que le graphène couvre toutes les cellules sur la fenêtre de nitride de silicium. Déposer la puce sur un papier filtre à l’aide d’une pince à épiler.

Le graphène est visible comme un miroitement violet sur la puce. Transférer la puce du papier dans un compartiment de boîte de Pétri. Pipette une gouttelette d’eau dans l’un des compartiments libres et fermer le couvercle pour fournir une atmosphère saturée d’eau.

Ensuite, sceller le plat du compartiment avec du film de paraffine et le conserver au réfrigérateur à quatre degrés Celsius. Réglez le STEM à 200 kilovolts d’énergie à l’aide d’un échantillon d’alignement pour une taille de sonde d’au moins 0,2 nanomètre en ajustant les lentilles du condenseur. Réglez un courant de sonde de 180 Picoampere et un semi-angle de convergence de faisceau de 13,2 milliradians en insérant une ouverture.

Réglez la plage semi-angle d’ouverture du détecteur ADF STEM à 68 à 280 milliradians en ajustant les paramètres de la lentille du projecteur. Ensuite, réglez la taille de l’image STEM à 2048 par 2048 pixels et le pixel habitent le temps à six microsecondes. Chargez la puce avec des cellules recouvertes de graphène dans un porte-spécimen standard pour tem de telle sorte que les cellules sont orientées vers le haut et charger le support dans le microscope électronique.

Obtenez une vue d’ensemble à 800 X grossissement. Ensuite, identifiez une région d’intérêt et d’image des nanoparticules quantiques à 80 000 X avec une taille de pixel de 1,3 nanomètre. Des cellules ensemencées de façon optimale sont montrées ici.

La fenêtre est couverte, mais il y a suffisamment d’espace pour leur permettre de s’aplatir et d’adhérer. Lorsque trop de cellules étaient ensemencées sur une puce électronique, il n’y avait pas suffisamment d’espace pour que toutes les cellules adhèrent. Après 24 heures, plus de la moitié des cellules ne se sont pas aplaties.

Si trop peu de cellules sont ensemencées, la fenêtre de nitride de silicium se retrouvera avec un grand espace vide après 24 heures. Des images de DIC et de fluorescence de cellules ensemencées de façon optimale sont montrées ici, démontrant l’étiquetage réussi de HER2. Stem a été exécuté sur les cellules SKBR3 graphène-enduites et non enduites.

Les insets des images de grossissement 800 X ont été photographiés à 80 000 X.Les nanoparticules quantiques sont visibles comme des taches lumineuses à 50 000 X grossissement. Pour étudier l’effet de l’illumination du faisceau d’électrons sur l’échantillon, des images STEM ont été acquises dans une série d’images avec une dose d’électron s’accumulant. Les résultats représentatifs pour les échantillons non enduits et recouverts de graphène sont présentés ici.

L’exposition d’échantillons non enduits a entraîné l’apparition de structures brillantes sur les surfaces cellulaires, ce qui ne s’est produit avec aucun des échantillons recouverts de graphène. Le changement de distance relatif moyen des paires de particules est demeuré inférieur à 1,3 % pour les échantillons non enduits et inférieur à 0,8 % pour les échantillons enduits. Suite à cette procédure, différents types de protéines membranaires peuvent être photographiés sur des cellules entières en utilisant d’autres méthodes de microscopie.

Cette technique permet d’imager les protéines de la membrane plasmatique intacte pour obtenir plus d’informations sur l’organisation de la membrane plasmatique et l’interaction entre les protéines.