Name: Quantification des distributions de zone d’adhérence cellule-substrat et de forme cellulaire dans les monocouches cellulaires MCF7 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Découvrez la quantification des adhérences focales et de la forme cellulaire dans les monocouches MCF7 par microscopie confocale et ImageJ. Cette méthode fiable permet d'analyser les propriétés morphologiques des cellules cancéreuses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ces travaux ont été soutenus par le Centre national polonais des sciences sous la subvention no 2014/14/M/NZ1/00437.

1. Étapes préparatoires
<ol><li>Ensemencement cellulaire pour obtenir des monocouches confluentes<ol>
<li>Avant l’ensemencement, enduisez les puits d’une lame de chambre de 4 puits de collagène I (ou d’un autre composant ECM de choix). Pour le revêtement de collagène I, suivez un protocole commercial : https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html à une concentration de 8 μg/cm2.</li>
		<li>Ensemencez 400 000 cellules dans un puits d’une lame de chambre de 4 puits.</li>
		<li>Culture les cellules pendant 24 h (ou plus, selon les critères d’évaluation expérimentaux) avant la coloration, dans un incubateur à 37 °C, 5% CO2. Cette étape permet une maturation des contacts cellule-cellule et la formation de monocouches.</li>
		<li>Utilisez un microscope optique inversé pour vérifier la confluence (environ 90% est nécessaire) et une condition générale des monocouches. Ne procédez pas si les cellules flottent ou ont l’air stressées.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloration immunofluorescente REMARQUE : Les cellules peuvent être tachées d’un protocole de choix. Ici, l’immunofluorescence a été effectuée comme précédemment décrit4.<ol>
<li>Pour l’analyse focale de l’adhérence, tachez les cellules avec une protéine d’adhérence focale de choix (dans ce protocole paxilline). Pour la tache d’analyse de forme cellulaire avec la protéine de jonction cellule-cellule de choix (dans ce protocole de la plakoglobine de protéine desmosomale).</li>
		<li>Pour la procédure, utilisez 0,5 mL de solutions spécifiées, sauf indication contraire.</li>
		<li>Fixer les cellules dans 4% de formaldéhyde dans PBS pendant 30 min sur la glace.</li>
		<li>Incuber avec 0,1 M de chlorure d’ammonium (en PBS) pendant 10 min pour étancher l’autofluorescence.</li>
		<li>Ajouter 0,5% Triton X-100 (en PBS) pendant 30 min (permeabilisation).</li>
		<li>Bloc avec 5% de lait (ou 1% BSA) dans TBS-T pendant 1 h.</li>
		<li>Incuber avec anticorps primaire à 4 °C pendant la nuit (anti-paxilline: lapin, 1:250, anti-plakoglobine: lapin, 1:400)</li>
		<li>Incuber avec un anticorps secondaire pendant 30 min (Alexa Fluor 594 chèvre anti-lapin, 1:500, 1:500)</li>
		<li>Tache avec 300 nM DAPI pendant 1-5 min, protégé de la lumière. REMARQUE : Éventuellement, des colorations supplémentaires d’actine avec des conjugués fluorescents de phalloïdin (conc. 1:400) peuvent être effectuées; la phalloïdine doit être ajoutée à la même étape que l’anticorps secondaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagerie confocale<ol>
<li>Prenez des images de tranches Z simples à l’aide d’un microscope confocal (p. ex., Zeiss LSM800). REMARQUE : La coloration optionnelle de l’actine peut aider à évaluer le plan focal approprié. La coloration corticale de l’actine est présente dans la région apicale tandis que les fibres de stress actine sont présentes dans la région basale, près du substrat, comme illustré sur la figure 1.</li>
		<li>Imagerie d’adhérence focale<ol>
<li>Choisissez des tranches de Z pour l’analyse de l’adhérence focale de la région basale, près du substrat.</li>
			<li>Utilisez un objectif avec l’ouverture numérique la plus élevée disponible (préférable 63x N.A.: 1.4). NOTE: La forme de FA est très spécifique et facilement reconnaissable. Ainsi, il est recommandé de commencer l’analyse à partir d’un plan focal sous les cellules, puis de scanner lentement vers eux, jusqu’à ce que les FA soient clairement visibles. L’analyse d’image sera plus précise à partir de petits champs de vision, qui ont tendance à être plus uniformes, mais cela implique que moins de cellules seront calculées dans un seul champ de vision.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Imagerie des contacts cellule<ol>
<li>Utilisez un objectif 40x ou 63x.</li>
			<li>Sélectionnez les canaux de coloration nucléaire et la coloration des protéines de jonction préférée.</li>
			<li>Choisissez les tranches Z pour l’analyse de la forme cellulaire de la région apicale des monocouches.</li>
			<li>Prenez des photos pour au moins 3 champs de vision différents (200-400 cellules).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Analyse d’image
REMARQUE : Les macros fournies fonctionnent de manière optimale sur ImageJ version 1.50f ou plus récente. Utilisez pour la quantification uniquement des images avec un rapport signal/bruit élevé et sans pixels sous-ou sursaturés. Les méthodes décrites incluent des étapes nécessitant un ajustement manuel des paramètres. Ainsi, une analyse aveugle / configuration d’expérience aveuglée est recommandée. Pour chiffrer les noms de fichiers image, les plugins ImageJ tels que « Blind Analysis Tool » (disponible à l’adresse suivante : https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools) peuvent être utilisés.
<ol><li>Analyse focale de l’adhérence REMARQUE : Les fichiers d’entrée recommandés pour les méthodes suivantes sont les suivants : images de FA représentées en échelle de gris 8 bits enregistrées au format .tiff.<ol><li>Ouvrez l’image à l’aide d’ImageJ.</li>
		<li>Définir l’échelle d’une image sur pixels (Analyse | Échelle de jeu; Supprimez l’échelle et cochez l’option Global).</li>
		<li>Inclure le nom du fichier et la zone de retour sur investissement dans les options de mesure (Analyser | Définir les mesures...); vérifiez les options d’étiquette zone et affichage.</li>
		<li>Soustraire l’arrière-plan (Processus | Soustraire l’arrière-plan ; définir le paramètre de rayon de boule de roulement à 50 pixels ; vérifier l’option parabolique coulissante). Dans le cas d’images RGB pseudocolorées : fractionner les canaux RGB, quitter le canal avec des FA ouverts, fermer les canaux restants (Image | Couleur | Split Channels).</li>
		<li>Déterminer la zone de la plus petite région d’intérêt (ROI). À l’aide de sélections à main levée ou polygone, on décrit la plus petite adhérence focale et mesurent sa zone (Analyse | Mesure). Répétez cette étape pour différents ROI (FA) à partir de quelques images choisies au hasard (pour un total de 20 ROI). Calculer et enregistrer la moyenne des résultats obtenus. REMARQUE : Cette étape n’est requise que lorsqu’un ensemble d’images donné est analysé pour la première fois (ligne cellulaire spécifique, glissements de revêtement avec des composants spécifiques de matrice extracellulaire, conditions de culture différentes).</li>
		<li>Convertir l’image en binaire à l’aide de l’une des méthodes suivantes :<ol>
<li>Définir le seuil global (Image | Ajuster | Seuil; vérifiez les options Par défaut, B&amp;W et Dark Background, ajustez le seuil manuellement ou définissez-le automatiquement).</li>
			<li>Définir le seuil local (Image | Ajuster | Seuil local automatique...; définir méthode sur Phansalkar et vérifier objets blancs sur l’option fond noir. Ensuite, inverser l’image (Modifier | Invert).</li>
		</ol></li>
		<li>Mesurer le nombre et la superficie des VOI. Sélectionnez Analyser | Analyser les particules; vérifiez Unités pixel, Afficher les résultats, Effacer les résultats et résumer les options, définir le paramètre Taille, comme une limite inférieure utiliser la moyenne des plus petits ROIs de l’étape 2.1.5. La limite supérieure peut être définie à 25% d’une zone cellulaire typique.</li>
		<li>Transférer des données (qui incluent le nom de l’image, le nombre d’AF, la zone totale et moyenne des FA; respectivement tranche, compte, superficie totale, taille moyenne)de la fenêtre Résumé au programme de gestion des données de choix.</li>
		<li>Déterminez le nombre de cellules par image en comptant les noyaux tachés par DAPI. Le comptage peut se faire manuellement (Plugins | Analyser | Cell Counter) ou comme dans les protocoles disponibles tels que: https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation.</li>
		<li>Alternativement, pour faciliter le comptage des FA, utilisez la macro ImageJ (FAs.ijm) jointe.<ol>
<li>Déplacez le fichier .ijm avec la macro vers le dossier plugins ou macros situé dans les dossiers de fichiers source ImageJ.</li>
			<li>Déterminer une zone du plus petit retour sur investissement tel que décrit à l’étape 2.1.4.</li>
			<li>Ouvrir le fichier macro (Plugins | Macros | Modifier...).</li>
			<li>Avant d’exécuter la macro, définissez la valeur de trois variables : remplir la valeur de area_of_the_smallest_region_of_interest avec un nombre acquis à l’étape 2.1.4. Définissez threshold_type valeur sur manuel ou automatique.</li>
			<li>Enregistrer les modifications (la macro doit être prête à l’emploi).</li>
			<li>Appelez la macro à partir du panneau ImageJ ou effectuez un raccourci vers celui-ci. La macro commence par la fenêtre de dialogue ouverte standard. Sélectionnez l’image à traiter. REMARQUE : En cas d’ajustement manuel du seuil, la confirmation manuelle de la valeur du seuil sera nécessaire (évitez d’accepter les modifications à l’aide du bouton Appliquer sur la fenêtre de dialogue Seuil, utilisez plutôt la fenêtre de dialogue personnalisée Action Required). Les résultats obtenus en travaillant avec la macro sont les mêmes que ceux décrits à l’étape 2.1.8 (inclus dans la fenêtre de dialogue Résumé). En outre, dans le cas de l’ajustement manuel du seuil, le niveau de seuil inférieur s’affiche dans une fenêtre de dialogue Journal, car cette valeur permet de reproduire les résultats obtenus à l’avenir si nécessaire. Les chiffres supplémentaires S1 et S2 ont été inclus comme un jeu de données de formation pour la macro FAs.ijm.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Analyse de la forme cellulaire<ol>
<li>Manuelle<ol>
<li>Ouvrez une image dans ImageJ ou un autre logiciel de traitement d’image avec un ensemble similaire de fonctions (d’autres instructions se rapportent à ImageJ). Choisissez les paramètres à mesurer en sélectionnant dans le menu Analyse | Définissez les mesures et cochez les descripteurs de forme dans la zone apparaissant.</li>
			<li>Délimiter manuellement les bordures cellulaires, marquées par des protéines de jonction de choix, à l’aide de l’icône sélections freehand. Les paramètres choisis sont automatiquement calculés pour chaque cellule. Stockez les résultats après avoir décrit chaque cellule en cliquant sur Modifier | Sélection | Ajouter au gestionnaire. Seules des cellules complètes et entièrement visibles, avec des bordures ininterrompues, doivent être comptées.</li>
			<li>Lorsque toutes les cellules du champ de vision sont décrites, effectuez la mesure en marquant tous les nombres apparaissant dans la zone gauche du Gestionnaire de retour sur investissement (correspondant aux cellules) et en cliquant sur Mesurer Les résultats apparaissent dans la zone Résultats et peuvent être transférés à la feuille de calcul de choix.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Automatisé REMARQUE : Pour faciliter la quantification des descripteurs de forme cellulaire (CSI, rapport d’aspect, rondeur, solidité), une macro ImageJ a été préparée et jointe à cet article (CSI.ijm). La macro est principalement basée sur le plugin ImageJ appelé MorphoLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ)5. La macro exécute les étapes suivantes : 1) Extension de chaque bordure d’image par 10 pixels noirs [MorpholibJ]; 2) Séries de dilatations et d’érosions - filtre morphologique [MorpholibJ]; 3) Génération d’image binaire des limites des cellules par segmentation morphologique [MorpholibJ]; 4) Dilatation des limites cellulaires; 5) Inversion de la valeur des pixels; 6) Génération de sélections et mesure de la zone et du périmètre des cellules sur l’image; et 7) Enregistrement d’image avec les cellules décrites et les sélections de retour sur investissement ImageJ dans un nouveau fichier.<ol>
<li>Déplacez le fichier .ijm avec la macro vers le dossier plugins ou macros situé dans les dossiers de fichiers source ImageJ. Appelez la macro à partir du panneau ImageJ ou effectuez un raccourci vers celui-ci.</li>
			<li>Avant la quantification d’un nouvel ensemble de données, déterminez les valeurs des régions les plus petites et les plus grandes d’intérêt. Décrivez (sélection à main levée ou polygone) quelques exemples (3-10) des cellules les plus petites et les plus grandes de l’image, puis mesurez leur zone (Analyse | Mesure).</li>
			<li>Inversement, exécutez la macro avec des paramètres par défaut (la limite de taille inférieure est définie sur 0 et la limite supérieure est définie à l’infini), attendez que la macro se termine et sélectionnez Définir l’option Limites de taille de cellule. Mesurez la zone des cellules les plus petites et les plus grandes en cliquant sur leur étiquette, puis appuyez sur Mesure dans le gestionnaire de retour sur investissement ImageJ. Définissez la valeur des variables the_smallest_cell et the_biggest_cell. Enregistrez les modifications, fermez toutes les fenêtres de dialogue macro et exécutez à nouveau la macro. REMARQUE : La macro peut être utilisée sans fixer de limites de taille de retour sur investissement, mais elle n’est pas recommandée car elle augmente considérablement les chances de mesurer des fragments de cellules inappropriés ou des grappes de cellules.</li>
			<li>Démarrez la macro avec la fenêtre de dialogue Ouvrir standard. Sélectionnez l’image à traiter (échelle de gris).</li>
			<li>Analyser les résultats. La sortie fournie par la macro se compose de : tableau des résultats (étiquette cellulaire, étiquette d’image, zone cellulaire [pixels2],périmètre cellulaire [pixels2],circularité [CSI], rapport d’aspect, rondeur, solidité), image avec cellules décrites et liste de sélections de ROI (qui sera également enregistrée dans le nouveau fichier dans le sous-dossier résultats). La table des résultats sera automatiquement copiée dans le presse-papiers de l’utilisateur. REMARQUE : Les chiffres supplémentaires S3 et S4 ont été inclus comme jeu de données de formation pour la macro CSI.ijm.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Quantification
<ol><li>Quantification des FA<ol>
<li>Calculez le nombre moyen d’AF et la taille moyenne de fa par cellule/noyaux. REMARQUE : Pour certaines lignées cellulaires, il est possible de compter les FA séparément dans des cellules distinctes. Pour les lignées cellulaires qui ont de forts contacts cellule-cellule et se développent en tant que monocouches telles que MCF7, le nombre et la taille des FA par cellule peuvent être calculés en divisant les valeurs obtenues à partir de FA compter par le nombre de noyaux dans l’image entière.</li>
		<li>Évaluer l’importance statistique des différences potentielles entre les populations (groupes expérimentaux). Selon la distribution et la variance des données, pour la comparaison des deux groupes différents, l’utilisation du test t étudiant (distribution normale) ou du test U non paramétrique (Mann-Whitney). Pour comparer plusieurs groupes, utilisez ANOVA ou Kruskal–Wallis à sens unique en conjonction avec les tests post-hoc appropriés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse de la forme cellulaire<ol>
<li>Calcul des descripteurs de forme<ol>
<li>Analyse manuelle : Calculer l’index de forme cellulaire (CSI, également appelé circularité ou forme de cellule) dans la feuille de calcul de choix pour chaque cellule mesurée à partir de la zone et du périmètre appropriés à l’aide de la formule : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61461/61461equ01.jpg"> REMARQUE : CSI assume des valeurs comprises entre 1 (circulaire) et 0 (allongée). Les exemples de différentes formes cellulaires (avec la même zone) et leurs ISC respectives sont présentés à la figure 2. Dans l’analyse automatisée, les valeurs des descripteurs de forme (enrôlés et définis ci-dessous) sont calculées automatiquement et apparaissent dans la zone de résultats : (1) CSI = 4π*area/(perimeter)2 (2) AR = axe majeur/axe mineur (3) Rondeur = 4*zone/π*(axe majeur)2 (4) Solidité = zone/zone convexe</li>
		</ol>
</li>
		<li>Histogrammes de la distribution de la forme cellulaire<ol>
<li>Tracer la distribution de la forme cellulaire comme un histogramme de circularité (CSI). Classez les cellules en fonction de leur valeur CSI (calculée pour le minimum de 200–400 cellules), à l’un des dix intervalles uniformes (plage: 0-1, largeur du bac: 0,1). L’histogramme affiche le nombre de cellules dans chaque catégorie. REMARQUE : L’histogramme montrant la distribution de forme de la couche cellulaire MCF7 typique montre un pic d’environ 0,7-0,8 CSI. Si la forme des cellules est déformée par un certain facteur (par exemple le traitement du paclitaxel, qui provoque l’arrêt de phase G2/M et dans la conséquence plus de cellules sont rondes), il devrait être reflété sur l’histogramme.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Parcelles de distribution cumulatives<ol>
<li>Comparez les distributions cumulatives de CSI pour chaque ligne de cellule, car c’est la meilleure façon d’évaluer les différences statistiquement importantes dans les changements de forme cellulaire (ou tout autre changement dans la distribution. Par exemple, il peut être appliqué pour suivre l’évolution de la distribution des FA.</li>
			<li>Calculez la fonction de distribution cumulative (CDF) pour comparer les distributions. CDF attribue pour une valeur CSI donnée (tracée sur l’axe X) le pourcentage (ou nombre relatif) pour lequel toutes les valeurs sont inférieures ou égales à cette valeur CSI (tracée sur l’axe Y). Ainsi, à mesure que la valeur CSI augmente, le pourcentage de l’ensemble de valeurs qui sont moins ou égales à cette valeur augmente également. CDF peut être calculé par le logiciel statistique de choix, ou manuellement.</li>
			<li>Pour l’analyse statistique, utilisez le test non paramétrique kolgomorov-Smirnov.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+closure+of+circular+wounds+through+coordinated+collective+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Search+Results%22%5BJournal%5D)">Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion.</a> Search Results. 13 (1), 016006(2016).</li>
<li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122, Pt 18 3203-3208 (2009).</li>
<li>Ladoux, B., Mege, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+collective+cell+behaviours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of collective cell behaviours.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).</li>
<li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microscopy+identifies+bisphenol+AP%2C+a+bisphenol+A+analog%2C+as+a+novel+AR+down-regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator.</a> Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).</li>
<li>Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MorphoLibJ%3A+integrated+library+and+plugins+for+mathematical+morphology+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).</li>
<li>Balcerak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAX1+impact+on+collective+cell+migration%2C+cell+adhesion%2C+and+cell+shape+is+linked+to+the+regulation+of+actomyosin+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).</li>
<li>Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+quantitative+analysis+of+cell%2C+nucleus+and+focal+adhesion+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology.</a> PLoS One. 13 (3), 0195201(2018).</li>
<li>Fokkelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+adhesome+screen+identifies+critical+modulators+of+focal+adhesion+dynamics%2C+cellular+traction+forces+and+cell+migration+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour.</a> Scientific Reports. 6, 31707(2016).</li>
<li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li>
<li>Kim, D. H., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+size+uniquely+predicts+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion size uniquely predicts cell migration.</a> FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).</li>
<li>Pincus, Z., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+quantitative+methods+for+cell-shape+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis.</a> Journal of Microscopy. 227, Pt 2 140-156 (2007).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Texture-based+segmentation+and+a+new+cell+shape+index+for+quantitative+analysis+of+cell+spreading+in+AFM+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images.</a> Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).</li>
<li>Tong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+micropatterning+reveals+the+modulatory+effect+of+cell+shape+on+proliferation+through+intracellular+calcium+transients%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).</li>
<li>Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+cytoskeletal+alignment+independent+of+fluid+shear+stress+on+micropatterned+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’adhérence cellule-cellule et cell-substrat constitue des attributs inhérents des cellules épithéliales et jouent le rôle critique dans la morphogenèse des tissus et l’embriogenèse. Dans les tissus adultes, la régulation appropriée des propriétés mécaniques de la couche cellulaire est cruciale pour maintenir l’homéostasie et prévenir les réponses pathologiques comme la progression et la métastase de tumeur. La taille et le nombre d’adhérences focales dépendent de la force de l’adhérence cellule-substrat, tandis que la f...

Les monocouches épithéliales de cellules agissent comme un collectif dans lequel l’adhérence cellule-cellule et cellule-substrat ainsi que les forces contractiles et les tensions représentent des paramètres importants et leur juste équilibre contribue à l’intégrité globale de l’unité1,2,3. Ainsi, l’évaluation de ces paramètres représente un moyen d’établir l’état actuel de la couche cellulaire.
Les deux méthodes décrites ici représentent une analyse bidimensionnelle des monocouches confluentes des cellules épithéliales adhérentes (dans ce cas mcf7 ligne cellulaire de cancer du sein). L’analyse est effectuée à l’aide d’images confocales (seules tranches de Z) provenant de différentes régions de l’axe Z; région basale près d’un substrat pour les mesures d’adhérence focale (FA) et la région apicale pour les mesures de la forme cellulaire. Les méthodes présentées sont relativement simples et nécessitent des techniques de laboratoire standard et des logiciels open-source. La microscopie confocale est suffisante pour ce protocole, de sorte qu’elle peut être effectuée sans employer plus spécialisée tirf (total internal reflection Fluorescence) microscopie. Ainsi, le protocole pourrait être mis en œuvre dans un cadre de laboratoire relativement standard. Bien que l’exactitude des méthodes soit limitée, elles peuvent distinguer les différences de base dans l’adhérence focale et la forme cellulaire.
Les deux méthodes décrites ici consistent en les procédures expérimentales standard telles que la culture cellulaire, l’immunostaining, l’imagerie confocale et l’analyse d’image effectuées à l’aide de ImageJ. Toutefois, tout logiciel de traitement d’image avec les fonctions appropriées peut être utilisé. Les méthodes présentées peuvent suivre et comparer les changements subis par le traitement pharmacologique ou la modification génétique minimale. L’obtention de valeurs précises n’est pas recommandée, en raison de la précision limitée de ces méthodes. Deux macros automatisées ont été incluses, afin de faciliter la mesure de nombreuses images.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32740</td><td>chèvre anti-lapin, 1:500</td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>BioShop</td><td>ALB001.500</td><td></td></tr><tr><td>Collagène de peau de veau</td><td>Sigma</td><td>C9791-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1:10000 (stock 1 mg/mL en H2O), acide nucléique coloration</td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270-136</td><td></td></tr><tr><td>Jonction plakoglobine</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>2309S</td><td>lapin, 1:400</td></tr><tr><td>Armoire à flux laminaire classe 2</td><td>Alpina</td><td></td><td>équipement standard</td></tr> <tr><td>MCF7-basedHAX1KD lignée cellulaire</td><td>Lignée cellulaire établie à l’Institut national d’oncologie de Varsovie, décrite dans Balcerak et al., 2019</td><td></td><td>MCF7 lignée cellulaire avecHAX1knockdown</td></tr><tr><td>MCF7 (CONTRÔLE)</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-22</td><td>épithéliale, lignée cellulaire de cancer du sein adhérente</td></tr><tr><td>Olympus CK2 microscope optique Olympus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paxillin</td><td>Abcam</td><td>ab32084</td><td>lapin, 1:250, Y113</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>conjugué phalloïdine-TRITC</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>1:400 (stock 5 mg/mL dans le DMSO), marquage de l’actine</td></tr><tr><td>PTX</td><td>Sigma</td><td>T7402-1MG</td><td></td></tr><tr><td>TBST &ndash ; NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>TBST &ndash ; Culot Trizma</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-11</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM800 Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantification des distributions de zone d’adhérence cellule-substrat et de forme cellulaire dans les monocouches cellulaires mcf7

Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers

Les méthodes présentées ici quantifient certains paramètres des monocouches de cellules adhérentes confluentes à partir de multiples images confocales correctement tachées : adhérence au substrat en fonction du nombre et de la taille des adhérences focales, et de la forme cellulaire, caractérisée par l’indice de forme cellulaire et d’autres descripteurs de forme. Les adhérences focales ont été visualisées par la coloration de paxilline et les bordures de cellules-cellules ont été marquées par la plakoglobine de jonction et l’actine. Les méthodes de culture cellulaire et de coloration étaient standard; les images représentent des plans focals uniques; l’analyse d’image a été effectuée à l’aide d’un logiciel de traitement d’images accessible au public. Les protocoles présentés sont utilisés pour quantifier le nombre et la taille des adhérences focales et les différences dans la distribution de la forme cellulaire dans les monocouches, mais ils peuvent être réutilisés pour la quantification de la taille et de la forme de toute autre structure cellulaire distincte qui peut être tachée (p. ex., mitochondries ou noyaux). L’évaluation de ces paramètres est importante dans la caractérisation des forces dynamiques dans la couche cellulaire adhérente, y compris l’adhérence cellulaire et la contractilité de l’actomyosine qui affecte la forme cellulaire.

Analyse focale de l’adhérence Le knockdown du gène HAX1 a été précédemment montré pour affecter les adhérences focales6. Les cellules ont été cultivées sur la surface enduite de collagène I pendant 48 h. Des images des cellules témoins MCF7 et des cellules MCF7 avec un knockdown HAX1 (HAX1 KD) de trois expériences indépendantes tachées de paxilline de protéine d’adhérence focale ont été obtenues à l’aide d’un microscope confocal (image à partir d’un s...

L’article décrit la quantification de 1) la taille et le nombre d’adhérences focales et 2) l’indice de forme cellulaire et sa distribution à partir d’images confocales des monocouches confluentes des cellules MCF7.

Quantification des distributions de zone d’adhérence cellule-substrat et de forme cellulaire dans les monocouches cellulaires MCF7

The methods presented here quantify some parameters of confluent adherent cell monolayers from multiple appropriately stained confocal images: adhesion to ...

Ce protocole permet la quantification de la zone, du périmètre et de la forme de la structure intracellulaire à partir de son image bidimensionnelle. Cette technique est rapide et facile, ne nécessite que des réglages de laboratoire standard et un microscope confocal et utilise un logiciel opensource. Anna Balcerak, doctorante de mon laboratoire, démontrera la procédure.Commencez par ensemencement quatre fois 10 à la cinquième cellule dans 0,5 millilitres de milieu de culture par puits dans un collagène de quatre puits une diapositive de chambre enduite pour une culture de 24 heures dans un incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius et cinq degrés. Le lendemain matin, utilisez un microscope optique inversé pour vérifier la présence d’au moins 90 % de monocouche confluente et utilisez un microscope confocal pour obtenir des images en tranches Z. Pour l’analyse de l’adhérence focale, ouvrez les images d’ImageJ et sélectionnez analyser, définir l’échelle, supprimer l’échelle et global pour définir l’échelle d’image en pixels.Pour inclure le nom de fichier et la zone de la région d’intérêt dans les options de mesure, cliquez sur analyser et définir les mesures et vérifiez la zone et affichez les options d’étiquette. Pour soustraire l’arrière-plan, sélectionnez le processus et soustrayez l’arrière-plan. Réglez le rayon de la boule roulante à 50 pixels et vérifiez le paraboloïde coulissant.Pour déterminer la zone de la plus petite région d’intérêt, décrivons la plus petite adhérence focale et cliquez sur analyser et mesurer pour mesurer la zone. Lorsqu’au moins 20 régions d’intérêt ont été sélectionnées et mesurées, calculer et enregistrer la moyenne des résultats obtenus. Réglez la limite supérieure à 25 % d’une zone cellulaire typique.Pour conférer l’image au binaire, cliquez sur l’image, ajustez et seuilz, et vérifiez par défaut, noir et blanc, et fond foncé. Pour mesurer le nombre et les zones des régions d’intérêt, sélectionnez analyser et analyser les unités de particules et de pixels, afficher les résultats, obtenir des résultats clairs et résumer. Transférez les données de taille moyenne de la tranche, du nombre et de la superficie totale de la fenêtre récapitulatif au programme de gestion des données de choix.Pour la quantification de l’adhérence focale, ouvrez l’adhérence focale ImageJ macro et entrez dans la zone de la plus petite région d’intérêt comme zone de la plus petite région de paramètre d’intérêt. Réglez la valeur de type seuil à manuelle ou automatique et enregistrez les modifications. Ensuite, appelez la macro d’ImageJ et sélectionnez l’image à traiter.Pour l’analyse manuelle de la forme des cellules, ouvrez une image dans un logiciel de traitement d’image approprié et sélectionnez les paramètres à mesurer. Utilisez l’outil de sélection à main levée pour délimité manuellement les bordures cellulaires marquées par les protéines de jonction de choix. Les paramètres choisis seront automatiquement calculés pour chaque cellule.Lorsque toutes les cellules ont été décrites, sélectionnez modifier, sélectionner et ajouter au gestionnaire. Seules les cellules entièrement visibles complètes avec des bordures ininterrompues doivent être sélectionnées. Pour effectuer la mesure, marquez tous les numéros apparaissant dans la boîte gauche du gestionnaire de la région d’intérêt et cliquez sur la mesure.Les résultats apparaîtront dans la boîte de résultats et peuvent être importés sur la feuille de calcul de choix. L’analyse cellulaire automatisée facilite la quantification du grand nombre de cellules. Pour chaque nouveau type de cellule, exécutez d’abord la macro pour établir des paramètres.Lorsque la macro est terminée, sélectionnez définir les limites de taille des cellules. Cliquez sur l’étiquette des cellules les plus petites et les plus grandes et cliquez sur mesurer. Définissez la valeur de la plus petite cellule et des plus grandes variables cellulaires et enregistrez les modifications.Fermez toutes les fenêtres macro et sélectionnez l’image à traiter en gris. Ensuite, exécutez la macro à nouveau. La macro fournira un tableau des résultats qui inclut l’indice de forme cellulaire, le rapport d’aspect et les données de liste des régions de sélection d’intérêt.Ici, des images représentatives des adhérences focales comptées avec ImageJ, y compris les contours numérotés finaux et les superpositions des contours d’adhérence focale avec l’image originale pour les lignes cellulaires de contrôle et de knockdown peuvent être observées. Comme illustré dans cette analyse, les cellules knockdown ont démontré un plus grand nombre d’adhérences par cellule aussi bien que des adhérences qui sont plus grandes dans la taille comparée aux cellules de ligne de cellules de contrôle. Dans ces images, des régions représentatives de monocouches cellulaires non traitées et traitées par chimiothérapie sont montrées.Les cellules de contour ont été caractérisées en fonction de leurs valeurs d’index de forme cellulaire, par exemple dans cette analyse montrant une augmentation dans le dernier bac et un aplatissement des pics principaux pour les cellules médicamenteuses par rapport aux contrôles non traités. Une distribution de fréquences et une distribution cumulative pourraient alors être générées pour chaque culture cellulaire. L’imagerie à échelle grise des monocouches, telle qu’elle a été démontrée, a permis l’analyse et la quantification de 512 cellules provenant de 12 champs de vision révélant une répartition relative de la fréquence de l’indice de forme cellulaire.Pour que ce protocole fonctionne, il est important d’utiliser des images de la meilleure qualité possible. Un ensemencement, une coloration et une imagerie cellulaires appropriés devraient assurer des images d’une qualité expérimentale suffisante.

quantification-cell-substrate-adhesion-area-cell-shape-distributions

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Un test de fréquence pour mesurer la cinétique de l'adhérence d'interaction récepteur-ligand, lorsque les deux molécules sont ancrées sur les surfaces des cellules en interaction est décrite. Ce test mécanique à base est illustrée à l'aide d'une micropipette pressurisés cellules rouges du sang humain en tant que capteur d'adhérence et de l'intégrine αLβ2 et de la molécule d'adhésion intercellulaire-1 que l'interaction des récepteurs et des ligands.

Essai Fréquence d&#39;adhérence pour In Situ Analyse cinétique de la Croix-jonctionnelle interactions moléculaires à l&#39;interface cellule-cellule

Nous décrivons la méthode prototype pour la fabrication des lamelles de microscope recouvertes de gélatine fluorescente pour visualiser dégradation de la matrice invadopodes médiation. Techniques de calcul à l'aide du logiciel disponible sont présentées pour quantifier les niveaux résultants de protéolyse de la matrice de cellules individuelles au sein d'une population mixte et des groupes pluricellulaires englobant ensemble des champs microscopiques.

Mesure quantitative de invadopodes la protéolyse matrice extracellulaire dans des contextes simples et multicellulaire

Ici, nous présentons un protocole de quantifier en permanence les processus d'adhésion cellulaire et de-adhésion avec haute résolution temporelle d'une manière non-invasive par l'impédance cellulaire substrat et imagerie des cellules vivantes analyses. Ces approches révèlent la dynamique des processus adhésion cellulaire / de-adhérence déclenchées par modification de la matrice et de leur relation temporelle à des événements de signalisation adhérence dépendant.

Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

Nous rapportons une méthode in vitro qui permet de quantifier le nombre réel de cellules adhésives au sein d’une monocouche de cellules endothéliales.

La quantification des cellules endothéliales adhésivité<em&gt; In Vitro</em

Ce test d'adhésion de flux fournit un modèle d'impact simple, élevé d'interactions cellulaires de cellules épithéliales T. Une pompe à seringue est utilisée pour générer une contrainte de cisaillement, et la microscopie confocale capture des images pour la quantification. Le but de ces études est de quantifier efficacement l'adhérence des cellules T en utilisant des conditions d'écoulement.

Dosage de Adhérence Sous contrainte de cisaillement pour l&#39;étude des lymphocytes T-Adhesion Molecule Interactions

La différenciation cellulaire est régulée par une foule de facteurs microenvironnement, y compris les propriétés de la composition de la matrice et de matériaux de substrat. Nous décrivons ici une technique utilisant des puces à ADN de cellules en conjonction avec une force de traction au microscope pour évaluer la différenciation des cellules et les interactions cellule-substrat biomécaniques en fonction du contexte microenvironnement.

Un haut-débit Plate-forme Cell biopuces pour corrélative Analyse de la différenciation des cellules et des forces de traction

Cette étude démontre l’utilité et la facilité de la mesure d’extension quantitative de membrane cellulaire et sa corrélation avec la capacité adhésive des cellules. Comme un exemple représentatif, nous montrons ici que Dickkopf-protéine 3 (DKK3) favorise la formation de lobopodia accrue et l’adhérence cellulaire dans le corticosurrénalome cellules in vitro.

Caractérisation des Extensions de la Membrane cellulaire et d’étudier leur rôle dans le Cancer Cell Adhesion dynamique

Une plaque d’imagerie basée sur HMCA est présentée pour la performance de série invasion. Cette plaque facilite la formation des sphéroïdes en trois dimensions (3D) tumeur et la mesure de l’invasion des cellules du cancer dans la matrice extracellulaire (ECM). La quantification de dosage d’invasion est obtenue par analyse semi-automatique.

Analyse d’Invasion des cellules du Cancer et des médicaments anti-métastatique dépistage utilisant Hydrogel micro-chambre Array (HMCA)-plaques de base

Ici, nous décrivons une méthode simple et peu coûteuse qui permet la quantification des cellules adhésives de tumeur aux cryosections de ganglion lymphatique (LN). Les cellules de tumeur LN-adhérentes sont facilement identifiées par microscopie légère et confirmées par une méthode fluorescence-basée, donnant un index d’adhérence qui indique l’affinité de cellule-contraignante de tumeur au parenchyme de LN.

Quantification de l’adhérence des cellules tumorales dans les cryosections des ganglions lymphatiques

Ce protocole présente les procédures expérimentales pour effectuer le test d’empreinte d’adhérence afin d’imager les événements d’adhérence pendant l’adhésion rapide des cellules.

Imagerie de l’adhésion moléculaire dans le laminage cellulaire par essai d’empreinte d’adhérence

Découvrez la quantification des adhérences focales et de la forme cellulaire dans les monocouches MCF7 par microscopie confocale et ImageJ. Cette méthode fiable permet d'analyser les propriétés morphologiques des cellules cancéreuses.

Quantification des distributions de zone d’adhérence cellule-substrat et de forme cellulaire dans les monocouches cellulaires MCF7 (Vidéo) | JoVE Journal

Quantification des distributions de zone d’adhérence cellule-substrat et de forme cellulaire dans les monocouches cellulaires MCF7

Explorer plus de vidéos