Isolation des noyaux par tissu entier à l’aide d’une méthode sans détergent et sans enzymes

La préparation d’une seule cellule ou d’une seule suspension de noyaux est une étape cruciale pour le transcriptome à haut débit et le profilage épigénome. Notre protocole fournit une méthode simple, reproductible et universelle pour l’isolement des noyaux simples. Contrairement à d’autres méthodes exigeant le détergent pour l’isolement des noyaux, notre protocole est basé sur la colonne, qui est détergent et sans enzymes.

Il permet l’isolement des noyaux en moins de 30 minutes. Notre protocole simplifie l’isolement des noyaux. Il fournit une méthode robuste pour préparer la suspension des noyaux simples à partir de tissus difficiles à dissocier.

Pour commencer, pré-réfrigérer tampon A et B à partir d’un kit d’isolation des noyaux sans détergent en les plaçant sur la glace pendant au moins 30 minutes. Tubes de couche et pointes de pipette avec la solution de 5%BSA, qui améliorera la récupération des noyaux. Pour enrober les pointes de pipette, pipette 5%BSA solution deux à trois fois et l’air les sécher pendant deux heures.

Pour enrober les tubes, remplissez-les de BSA et inversionz-les trois fois. Retirer la solution et sécher à l’air les tubes à l’envers sur un papier de soie propre pendant deux heures. Enduire un tube de collecte et un tube de 1,5 millilitre par échantillon.

Utilisez des forceps pour ouvrir doucement le crâne et enlever les tissus mous, la peau et les os des côtés ventral et dorsale du crâne. Ensuite, transférez doucement le cerveau dans un plat de 30 millimètres contenant du PBS glacé et hacher le cerveau en petits morceaux à l’aide d’une lame de rasoir. Pour isoler les noyaux simples, transférez le tissu haché à la cartouche de filtre fournie dans le kit d’isolation des noyaux et éliminez l’excès de solution et ajoutez 200 microlitres de tampon froid A.Grind le tissu avec une tige en plastique pendant deux minutes.

Ajouter 300 microlitres de tampon froid A à la cartouche de filtre et l’incuber sur la glace avec le bouchon ouvert pendant 10 minutes. Puis capuchon de la cartouche et de résuspendre le tissu en inversant le tube cinq fois. Centrifugez le tube de l’échantillon à 16 000 fois g pendant 30 secondes pour rompre les cellules.

Le flow-through contient des noyaux intacts, qui forment une pastille incolore au fond du tube. Jetez le filtre, puis resuspendez la pastille en vortexant vigoureusement pendant 10 secondes. Pelleter à nouveau les noyaux en centrifugant la solution à 500 fois g pendant trois minutes.

Puis jetez soigneusement le surnatant. Resuspendez la pastille en 0,8 millilitres de tampon B froid en pipetant deux à trois fois et centrifugez les noyaux à 600 fois g pendant 10 minutes, ce qui les séparera des débris membranaires. Jetez soigneusement le surnatant.

Resuspendez les noyaux isolés dans 500 microlitres de PBS avec 5%BSA et maintenez la suspension sur la glace jusqu’à FACS. Pour confirmer la morphologie nucléaire avec la coloration HEX, transférez 100 microlitres de la suspension des noyaux simples à un nouveau tube à l’aide des extrémités enduites BSA. Tacher les noyaux en ajoutant 0,1 microlitre de HEX et en tourbillonnant doucement le tube.

Transférer la suspension des noyaux dans un plat de fond en verre et l’image des noyaux à l’aide d’un microscope à fluorescence avec un réglage d’excitation laser de 405 nanomètres. Avant d’effectuer facs, filtrer les noyaux avec une passoire à cellules de 40 micromètres dans un tube enduit BSA. Diluer la suspension filtrée en ajoutant pbs avec 5%BSA à un volume final de 1000 microlitres.

Étiquetez deux tubes FACS à fond rond comme commande et tachés et transférez 250 microlitres de la suspension des noyaux dans le tube de commande à l’aide d’une pointe de pipette enduite BSA. Transférez les 750 microlitres restants de la solution au tube FACS étiqueté taché et ajoutez un microlitre de colorant HEX pour tacher les noyaux. Ensuite, mélangez-le par vortex lent.

Chargez l’échantillon de contrôle non taché dans le trieur cellulaire et enregistrez 5000 événements. Chargez ensuite l’échantillon taché et enregistrez 5000 événements. Dessinez des portes FACS pour l’identification des noyaux simples.

Les noyaux peuvent être sélectionnés en comparant le signal fluorescent HEX entre le contrôle et les échantillons tachés. Triez ensuite les noyaux positifs HEX du tube taché dans un nouveau tube de 1,5 millilitre contenant 50 microlitres de PBS avec 5%BSA. Ce protocole a été utilisé pour générer une suspension du noyau unique directement à partir du tissu cérébral du poisson zèbre.

Les noyaux isolés ont été tachés avec HEX et visualisés avec la microscopie de fluorescence. Ils semblaient intacts, ronds et bien séparés. Fait important, l’agrégation nucléaire était absente.

L’enrichissement des noyaux isolés a été exécuté avec la cytométrie d’écoulement en étiole sur la présence d’un signal fluorescent de HEX. Les noyaux non tachés ont montré la fluorescence de fond tandis que les noyaux souillés ont exhibé le signal fort de fluorescence. Les noyaux non tachés et tachés étaient bien séparés dans le canal violet.

Tout en essayant ce protocole, il est important de se rappeler que les noyaux simples ont tendance à coller sur un matériau plastique. Pour prévenir la perte potentielle de noyaux et augmenter l’efficacité, le revêtement de base du matériau plastique est fortement recommandé. Suspension unique isolée des noyaux peut être utilisée pour l’ARN des noyaux simples Cette technique élucide l’hétérogénéité cellulaire dans les systèmes biologiques complexes et aide à définir les sous-types cellulaires et les réseaux génétiques.

L’utilisation d’une méthode détergente et sans enzymes enregistre le bruit technique et le biais introduits lors de la préparation de l’échantillon. Cette méthode a mis au point un isolement simplifié et logistique des noyaux simples.