Name: Contribution de la pompe Na+/K+ à l’éclatement rythmique, explorée avec la modélisation et les analyses de pince dynamique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Découvrez comment la pompe Na+/K+ et le courant sodique persistant influencent l'éclatement rythmique des interneurones cardiaques de sangsue. Cette méthode de pince dynamique permet de contrôler les courants ioniques en temps réel.

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Nous remercions Christian Erxleben pour les premières expériences de serrage dynamique sur les neurones HN(7) qui ont démontré leurs capacités d’éclatement. Angela Wenning a aidé les expériences avec des conseils d’experts. Nous reconnaissons les NIH pour le financement de ce travail par le biais de la subvention 1 R21 NS111355 à GSC et RLC.

NOTE: Les sujets expérimentaux d’animaux invertébrés ne sont pas réglementés par les NIH ou les universités d’État d’Emory et de Géorgie. Toutes les mesures ont néanmoins été prises pour minimiser la souffrance des sangsues utilisées dans ce travail.
1. Préparer le ganglion isolé 7 à partir du cordon nerveux de la sangsue
<ol><li>Maintenir les sangsues Hirudo verbana dans l’eau artificielle de l’étang (contenant 0,05 % p/v de sel de mer) diluée dans de l’eau désionisée à 16 °C sur un cycle lumière-obscurité de 12:12.</li>
	<li>Préparez les sangsues pour la dissection en les anesthésiant à froid dans un lit de glace pilée pendant &gt;10 min jusqu’à ce qu’elles soient immobiles.</li>
	<li>Remplir un plat à dissection noir recouvert de résine à une profondeur d’environ 1 cm avec une solution saline réfrigérée contenant 115 mM de NaCl, 4 mM de KCl, 1,7 mM de CaCl2,10 mM de D-glucose et 10 mM d’HEPES dans de l’eau désionisée; pH ajusté à 7,4 avec 1 M NaOH. Épinglez la paroi dorsale de la sangsue dans la chambre revêtue de résine noire (au moins 20 cm x 10 cm avec une profondeur d’au moins 2 cm au-dessus de la résine d’au moins 2 cm d’épaisseur).</li>
	<li>Sous un steromicroscope à grossissement de 20x avec éclairage oblique du guide de lumière, faites une coupe longitudinale d’au moins 3 cm de long avec des ciseaux à ressort de 5 mm à travers la paroi du corps dans lapartie rostrale 1/3 du corps. Utilisez des épingles pour écarter la paroi du corps et exposer les organes internes. REMARQUE: Toute farine de sang stockée peut être éliminée par aspiration avec une pipette Pasteur polie au feu.</li>
	<li>Isoler un ganglion individuel du milieu du corps 7 (septième ganglion segmentaire libre caudal au cerveau).<ol>
<li>Ouvrez le sinus dans lequel réside le cordon nerveux à l’aide des ciseaux à ressort de 5 mm. Assurez-vous de fendre le sinus dorsalement et ventralement en laissant deux bandes de sinus. Utilisez des pinces pointues #5 pour aider à guider la coupe et à maintenir le sinus.</li>
		<li>Gardez le sinus attaché à chacune des deux racines nerveuses bilatérales qui émergent du ganglion (il adhère étroitement à chaque racine) pour utiliser ces bandes de sinus pour épingler le ganglion.</li>
		<li>Retirez le ganglion du corps en coupant les faisceaux de nerfs conjonctifs rostraux et caudals qui relient les ganglions (aussi loin que possible du 7e ganglion) et les bandes sinusales, puis coupez les racines latérales à l’endroit où elles émergent du sinus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Épinglez le ganglion (à l’aide de vieilles pinces émoussées #5) avec des épingles à insectes minuten raccourcies, côté ventral vers le haut, dans des boîtes de Petri transparentes et doublées de résine. Insérez des broches dans les bandes de sinus et de tissu lâche adhérant aux racines et aux conjonctifs rostral et caudal, aussi loin que possible du ganglion. REMARQUE: La résine ne doit pas être plus épaisse que 3 mm si l’on veut obtenir un bon éclairage par le bas pendant l’enregistrement. Assurez-vous que le ganglion est tendu, à la fois longitudinalement et latéralement</li>
	<li>Augmentez le grossissement du stéréomicroscope à 40x ou plus, et ajustez l’éclairage oblique afin que les corps cellulaires neuronaux puissent être facilement vus sur la surface ventrale du ganglion juste en dessous du périneurium.</li>
	<li>Retirer le périneurium du ganglion (desheath) avec des microcisseurs.<ol>
<li>Commencez le deschauffage en coupant la gaine lâche entre les racines d’un côté et continuez la coupe latéralement de l’autre côté, en veillant à garder les lames de ciseaux superficielles et à ne pas endommager les corps cellulaires neuronaux directement sous la gaine.</li>
		<li>Faites une coupe superficielle similaire caudalement à partir de la coupe latérale le long de la ligne médiane.</li>
		<li>Maintenant, attrapez le lambeau caudolatéral de la gaine d’un côté avec la fine pince n ° 5, éloignez-le du ganglion et coupez-le avec les microcisseurs.</li>
		<li>Répétez de l’autre côté; cette procédure expose les deux neurones HN(7) pour l’enregistrement avec des microélectrodes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez la boîte de préparation dans la configuration d’enregistrement et superamorcez-la avec une solution saline à un débit de 5 mL / min à température ambiante.</li>
</ol>2. Identifier et enregistrer les interneurones cardiaques de sangsue avec des microélectrodes pointues
<ol><li>Pendant la durée de l’enregistrement du neurone HN(7) (les enregistrements durent entre 30 et 60 min), acquérir et numériser les traces de courant et de tension intracellulaires d’un électromètre neurophysiologique échantillonnant à une vitesse de 5 kHz avec un système d’acquisition de données numériques (analogique à numérique, A à D) et de stimulation (numérique à analogique, D à A), et s’afficher sur un écran d’ordinateur. REMARQUE: Tout logiciel commercial ou personnalisé et la carte A à D / D à A peuvent être utilisés pour l’acquisition de données (A à D). D à A et un logiciel sur mesure sont nécessaires pour la pince dynamique.</li>
	<li>Sous un steromicroscope à 50-100x avec un éclairage en champ sombre par le bas, identifiez provisoirement un neurone HN(7) de la paire bilatérale par son emplacement canonique à la position postriolatérale dans le ganglion du milieu du corps sept.</li>
	<li>Maintenant, visez à pénétrer le neurone putatif HN(7) avec une microélectrure pointue remplie d’acétate de potassium 2 M et de KCl 20 mM à l’aide d’un micromanipulateur.<ol>
<li>Placez la microélectrographe très près du corps cellulaire cible.</li>
		<li>Observez en permanence le potentiel enregistré avec l’électromètre et réglez ce potentiel à zéro mV avant de pénétrer dans le neurone.</li>
		<li>Pénètrez dans le neurone avec la microélectrographe, en entraînant lentement l’électrode le long de son long axe avec le manipulateur. À l’aide de la fonction de bourdonnement de l’électromètre, réglée sur une durée de bourdonnement de 100 ms, jusqu’à ce qu’un changement négatif du potentiel membranaire et une activité de pic vigoureuse soient observés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Réglez l’électromètre en mode de serrage de courant discontinu (DCC) ≥ 3 kHz pour enregistrer simultanément le potentiel de la membrane et transmettre le courant avec la microélectrographe unique (compensation de capacité réglée juste en dessous de la sonnerie, puis recomposée à 10%).<ol>
<li>Surveillez la décantation de l’électrode pendant le DCC sur un oscilloscope.</li>
		<li>Injectez un courant constant de -0,1 nA avec l’injecteur de courant constant de l’électromètre pendant une minute ou deux pour stabiliser l’enregistrement.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifier définitivement le neurone HN(7) par sa forme de pointe caractéristique et sa faible activité d’éclatement(Figure 1Ci).</li>
	<li>Effectuez toute analyse de données hors connexion une fois l’expérience terminée et enregistrez toutes les données sur un disque.</li>
</ol>3. Construire un HN en temps réel ou un autre neurone modèle
<ol><li>Créez un logiciel personnalisé à l’aide d’une carte de traitement du signal numérique (DSB; D à A et A à D) dans un ordinateur de bureau pour implémenter en temps réel les courants de modèle décrits en2,4 ou des courants de modèle différents pour d’autres neurones ou expériences.<ol>
<li>Utilisez des équations de style Hodgkin-Huxley car elles constituent la méthode généralement préférée pour représenter les courants du modèle.</li>
		<li>Voir7 pour une description détaillée de la mise en œuvre du modèle HN en temps réel et de la pince dynamique avant l’ajout du courant de la pompe. Reportez-vous à la section d’introduction pour la description des courants, de la concentration intracellulaire de Na+ et des conductances du neurone HN(7) vivant dans le modèle HN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Mettre en œuvre et faire varier les conductances/courants de serrage dynamiques
<ol><li>Utilisez le logiciel de pince dynamique sur mesure pour le DSB pour implémenter et modifier en temps réel la pince dynamique de l’interface utilisateur graphique(Figure 3)(GUI) des conductances et des courants programmés accessibles du modèle HN en temps réel du neurone HN (7). REMARQUE: Pour rappel, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> et <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> sont la conductance maximale du courant persistant Na+ (IP) et du courant maximal de la pompe (Ipompe), respectivement.</li>
	<li>Utilisez les zones de saisie gui dans le logiciel pour apporter des modifications, au fur et à mesure que le modèle est en cours d’exécution, dans la <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> boîte (PumpMaxL) et <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> (boîte GpinHNLive) (Figure 3). REMARQUE : Les zones de saisie de l’interface graphique acceptent les valeurs typées, et les étapes de 0,1 nA sont recommandées pour <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> et les étapes de 1 nS sont recommandées pour <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> .<ol>
<li>Ajouter de petites quantités de <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> et avec une pince dynamique pour stabiliser <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> l’éclatement du neurone HN(7), qui est affaibli par une fuite induite par une microélectronique, comme le montre la figure 1Cii. REMARQUE: Une forte pénétration de la microélectronique provoque des dommages à la membrane qui se font par une augmentation de la conductance de fuite ou une diminution de la résistance d’entrée.</li>
		<li>Commencez par ajouter une valeur <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> de 0,1-0,2 nA, ce qui compense la fuite induite par la microélectrode, mais déprime l’excitabilité, puis augmente progressivement <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> , ce qui augmente l’excitabilité, jusqu’à ce qu’un éclatement régulier s’ensuive, généralement à <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> ~1-4 nS(Figure 4A).</li>
	</ol></li>
	<li>Faire systématiquement varier ces courants (incréments de 0,1 nA pour <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> et 1 nS pour <img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> ) au neurone HN(7) enregistré avec une pince dynamique (Figure 3), et évaluer leurs effets sur les caractéristiques du sursaut : fréquence du pic (f : la réciproque de la moyenne de l’intervalle interspike lors d’un burst), intervalle d’interburst (IBI : le temps entre le dernier pic d’un burst et le premier pic du sursaut suivant), durée de rafale (BD : le temps entre le premier pic d’une rafale et le dernier pic d’une rafale), et période de rafale (T : le temps entre le premier pic d’une rafale et le premier pic de la rafale suivante).<ol>
<li>Changez les valeurs de <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> et , comme dans la démonstration <img alt="Equation 19" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> vidéo, pour vous familiariser avec la technique, puis aventurez-vous.<ol>
<li>Maintenez <img alt="Equation 20" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> à une valeur fixe spécifique et balayez par incréments de 1 nS sur une plage d’activité d’éclatement <img alt="Equation 21" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> régulière.</li>
			<li>Maintenant, augmentez la valeur fixe de <img alt="Equation 22" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> 0,1 nA et balayez à nouveau une plage <img alt="Equation 23" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> d’activité d’éclatement régulière de soutien.</li>
			<li>Pour chaque paire de paramètres implémentée, collectez des données contenant au moins 8 rafales afin de pouvoir effectuer des mesures moyennes fiables de f, IBI, BD et T.</li>
			<li>Continuez avec les balayages aussi longtemps que le neurone reste viable, tel qu’évalué par un fort pic et un potentiel d’oscillation de base stable.</li>
			<li>Collecter des données à partir de plusieurs neurones (de différents animaux) pour générer un graphique composite (Figure 5).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cymbalyuk, G. S., Gaudry, Q., Masino, M. A., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursting+in+leech+heart+interneurons%3A+cell-autonomous+and+network-based+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bursting in leech heart interneurons: cell-autonomous and network-based mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 22, 10580-10592 (2002).</li>
<li>Hill, A. A., Lu, J., Masino, M. A., Olsen, O. H., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+a+segmental+oscillator+in+the+leech+heartbeat+neuronal+network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A model of a segmental oscillator in the leech heartbeat neuronal network.</a> Journal of Computational Neuroscience. 10, 281-302 (2001).</li>
<li>Tobin, A. E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myomodulin+increases+Ih+and+inhibits+the+NA%2FK+pump+to+modulate+bursting+in+leech+heart+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Myomodulin increases Ih and inhibits the NA/K pump to modulate bursting in leech heart interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 94, 3938-3950 (2005).</li>
<li>Kueh, D., Barnett, W. H., Cymbalyuk, G. S., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%28%2B%29%2FK%28%2B%29+pump+interacts+with+the+h-current+to+control+bursting+activity+in+central+pattern+generator+neurons+of+leeches%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Na(+)/K(+) pump interacts with the h-current to control bursting activity in central pattern generator neurons of leeches.</a> eLife. 5, 19322(2016).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).</li>
<li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).</li>
<li>Barnett, W., Cymbalyuk, G. Hybrid systems analysis: real-time systems for design and prototyping of neural interfaces and prostheses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarnett%2C+W+%22Biohybrid+systems%3A+nerves%2C+interfaces%2C+and+machines%22">Biohybrid systems: nerves, interfaces, and machines</a>. Jung, R. , Wiley VCH Verlag. Weinheim. 115-138 (2011).</li>
<li>Sorensen, M., DeWeerth, S., Cymbalyuk, G., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+hybrid+neural+system+to+reveal+regulation+of+neuronal+network+activity+by+an+intrinsic+current%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Using a hybrid neural system to reveal regulation of neuronal network activity by an intrinsic current.</a> Journal of Neuroscience. 24, 5427-5438 (2004).</li>
<li>Olypher, A., Cymbalyuk, G., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+systems+analysis+of+the+control+of+burst+duration+by+low-voltage-activated+calcium+current+in+leech+heart+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Hybrid systems analysis of the control of burst duration by low-voltage-activated calcium current in leech heart interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 2857-2867 (2006).</li>
<li>Calabrese, R. L., Prinz, A. A. Realistic modeling of small neuronal networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCalabrese%2C+RL+%22Computational+Modeling+Methods+for+Neuroscientists%22">Computational Modeling Methods for Neuroscientists</a>. DeSchutter, E. , MIT Press. MA, USA. 285-316 (2010).</li>
<li>Rybak, I. A., Molkov, Y. I., Jasinski, P. E., Shevtsova, N. A., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+bursting+in+the+pre-B%C3%B6tzinger+complex%3A+mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rhythmic bursting in the pre-Bötzinger complex: mechanisms and models.</a> Progress in Brain Research. 209, 1-23 (2014).</li>
<li>Picton, L. D., Nascimento, F., Broadhead, M. J., Sillar, K. T., Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+pumps+mediate+activity-dependent+changes+in+mammalian+motor+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sodium pumps mediate activity-dependent changes in mammalian motor networks.</a> Journal of Neuroscience. 37, 906-921 (2017).</li>
</ol>

La modélisation, la pince dynamique et les analyses qui en résultent sont des techniques utiles pour explorer comment les conducteurs/courants ioniques individuels et les groupes contribuent à l’activité électrique des neurones(Figure 1, Figure 2,Figure 4et Figure 5). L’utilisation de ces techniques montre comment le courant de pompe Na+/ K+ (pompeI)interagit avec les courants voltage-fermés, en particulier le courant Persistant Na+ (IP),pour favoriser un éclatement robuste dans les HNs de base du générateur de pulsation de sangsue. En combinant des expériences de serrage dynamique et de modélisation, il est possible de tester des modèles plus directement qu’avec des techniques ordinaires d’enregistrement de tension et de pince de courant. Les résultats obtenus à partir des expériences de serrage dynamique(figure 5) serontutilisés pour affiner davantage le modèle HN. La méthode de base de serrage dynamique démontrée ici peut être personnalisée pour refléter les propriétés de n’importe quel neurone étudié si un modèle mathématique des courants neuronaux peut être déterminé avec des expériences de pince de tension.
La réussite des expériences du type montré ici nécessite un empalement minutieux d’un HN ou d’un autre neurone lors de l’utilisation d’une microélectrode pointue, car un fort éclatement est réduit par la pénétration de l’électrode1. (Les techniques d’enregistrement de patch de cellules entières, qui minimisent les fuites introduites, sont également applicables à d’autres neurones, mais ne fonctionnent pas bien sur les neurones de sangsue.) Il est essentiel que l’empalement du neurone HN cause un minimum de dommages au neurone (fuite supplémentaire), et la résistance d’entrée doit être surveillée et doit être comprise entre 60 et 100 MOhms pour des expériences réussies4.
La pince dynamique est une technique puissante, mais elle a des limites imposées par la géométrie neuronale car les conductances artificielles sont mises en œuvre sur le site de l’électrode d’enregistrement - généralement le corps cellulaire - et non sur le site où les courants générateurs de rythme sont généralement localisés5,6,10. Dans les neurones HN de sangsue, le corps cellulaire est électriquement proche de la zone d’intégration (neurite principale) du neurone où la plupart des courants actifs sont localisés et où des pics sont initiés.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61473">Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses</a>. An author name was updated.
The&#160;name of the first author was updated from:
Ricardo Javier Erazo Toscano
to:
Ricardo Javier Erazo-Toscano

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61473">Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses</a>. An author name was updated.

Erratum: Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses

Le rythme cardiaque dans les sangsues est entraîné par un CPG composé de 9 paires bilatérales d’interneurones cardiaques (HN) répartis sur autant de ganglions segmentaires du milieu du corps. Au cœur du CPG se trouvent des paires mutuellement inhibitrices d’interneurones situés dans les ganglions3e et4 e segmentaires qui forment des oscillateurs demi-centraux (HCO)(Figure 1A). Ces neurones continuent d’éclater lorsqu’ils sont isolés pharmacologiquement synaptiquement à l’aide de la bicuculline1. D’autres, comme la paire dans les ganglions du 7e segment (le centre de ce protocole), sont également des éclateurs, capables de produire une activité d’éclatement lorsqu’ils sont isolés synaptiquement. Ils ne sont pas mutuellement connectés et ne reçoivent que des entrées descendantes, et sont donc facilement isolés en coupant le ganglion du reste du cordon nerveux. Cette activité d’éclatement indépendante est sensible au courant de fuite introduit causé par la pénétration avec des microélectrodes pointues pour l’enregistrement, mais éclate vigoureusement lorsqu’il est enregistré avec des méthodes de patch lâche1.
Les neurones HN individuels et les HPO HN ont été modélisés (modèles de compartiment isopotentiel unique basés sur Hodgkin-Huxley de neurones HN contenant tous les courants voltage-gated et synaptiques identifiés expérimentalement), et toutes les caractéristiques de sursaut du système vivant ont été capturées avec succès2. La myomoduline, un neuropeptide endogène dans les sangsues, diminue considérablement la période (T) du rythme d’éclatement des neurones HN isolés et des HPO HN. Ce modulateur agit pour augmenter le courant h (courant intérieur activé par hyperpolarisation, Ih)et pour diminuer lapompeI3. Cette observation a conduit à l’exploration de la façon dont Ipump interagit avec Ih,et comment leur co-modulation contribue à l’activité rythmique des neurones HN. L’activation de la pompe en augmentant [Na+]i (à l’aide de l’ionophore monensine) accélère le rythme de l’éclatement HN dans les HCO HN et les neurones HN isolés4. Cette accélération dépendait de Ih. Lorsque Ih était bloqué (2 mM Cs+),la période d’éclatement n’était pas altérée par cette méthode d’activation de la pompe; cependant, la durée de l’éclatement (BD) a été réduite et l’intervalle d’interrafale (IBI) a augmenté à la fois dans les HPO HPO et les neurones HN isolés4.
Pour ce protocole, tous les courants d’un neurone HN(7) vivant, y compris le courant de pompe, pompeI,sont incorporés dans le modèle HN comme suit :
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq01v2.jpg"> (1)
où C est la capacité membranaire (en nF), V est le potentiel membranaire (en V), t est le temps (en s). Des descriptions et des équations détaillées du courant ionique ont été décritesailleurs 2,4. Le neurone du modèle HN complet fonctionne en temps réel (Figure 2). Le logiciel sera disponible sur GitHub dès sa publication et pourra fonctionner sur la carte de traitement du signal numérique décrite dans la Table des matériaux. Ici, l’objet de la recherche est le courant de pompe Na+/ K+ (pompeI)et les courants voltage-fermés contribuant à un flux Na+ significatif: un courant Na+ rapide (INa) et un courant Na+ persistant (IP). Les conductances maximales de ces courants sont <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq1a.jpg"> <img alt="Equation 1b" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq1b.jpg"> respectivement. La pompe Na+/K+ échange trois ions Na+ intracellulaires contre deux ions K+ extracellulaires, produisant ainsi un courant net vers l’extérieur. Il est important de souligner qu’il pompe 3 fois plus de Na+ hors du neurone que ce courant l’indique, ce qui est important pour calculer laconcentration intracellulaire de Na +.
Le courant de pompe Na+/K+ dépend des concentrations intracellulaires de Na+ et est exprimé par la fonction sigmoïdale suivante:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq02.jpg"> (2)
où [Na]i est la concentration intracellulaire de Na+, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> est le courant maximal de la pompe Na+/K +, [Na]ih est la concentration intracellulaire de Na+ pour la demi-activation de la pompe Na+/K+, et [Na]est la sensibilité de la pompe Na+/K+ à [Na]i. [Na]i se construit à la suite des apports Na+ transportés par IP et INa et est diminué par l’efflux Na+ de la pompe Na+/K+. La contribution de Ih et ILeak au flux total de Na+ est faible et n’est pas prise en compte dans le modèle en temps réel.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq03.jpg"> (3)
où, v est le volume (~6,7 pL) du réservoir intracellulaire Na+, F est la constante de Faraday et la concentration extracellulaire Na+ est maintenue constante.
Les conductances voltage-fermées et les conductances de fuite ont été différenciées - elles répondent au potentiel membranaire - à partir du courant de la pompe, qui est régulé par la concentration intracellulaire Na+ calculée ([Na+]i). [Na+] i est construit par l’entrée Na+ via le courant rapide Na+ (INa)qui produit des potentiels d’action (pics) et le courant Persistant Na+ (IP) qui fournit la dépolarisation pour soutenir le pic. [Na+] i est, à son tour, réduit par l’action de la pompe par l’extrusion de Na+. Des valeurs de HN vivantes de base de <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> (5nS) et <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgna.jpg"> (150 nS) ont été supposées, et nous tenons compte de toute pince dynamique <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> ajoutée.
Le but du protocole décrit ici est de manipuler lapompe I de manière précise et réversible en temps réel pour découvrir comment elle interagit avec les courants voltage-fermés (courant Na+ persistant dans le protocole actuel) pour contrôler l’éclatement rythmique dans les HNs simples. Pour atteindre cet objectif, une pince dynamique a été utilisée, qui introduit artificiellement, sur commande, une quantité précise de tout courant pouvant être calculé au fur et à mesure que le modèle est en cours d’exécution. Cette méthode présente des avantages par rapport à la manipulation pharmacologique de la pompe, qui affecte l’ensemble du tissu, peut avoir des effets hors cible qui sont souvent difficiles à inverser et ne peut pas être manipulée avec précision. La pince dynamique5,6 lit la tension d’un neurone enregistré en temps réel(Figure 1B)et calcule et injecte, en temps réel, la quantité de tout courant en fonction des équations du modèle et des valeurs définies de tout ou <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg"> <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> . Des méthodes similaires peuvent facilement être appliquées à n’importe quel neurone qui peut être enregistré intracellulairement. Cependant, les paramètres devront être redimensionnés en fonction du neurone choisi et le neurone devra être isolé des entrées synaptiques, par exemple pharmacologiquement.

<table><tbody><tr><td><FORT>ANIMAUX</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hirudo verbana</td><td>Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches</td><td></td><td>sangsues vivantes 2-3 grammes</td></tr><tr><td><fort>CHIMIQUES</FORT></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EAU D’ÉTANG</td><td></td><td></td><td></td>ARTIFICIEL</tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670-100G</td><td>1,8 mM ajouter en dernier après ajustement</td></tr><tr><td>du pH glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Instant Ocean (sel de mer)</td> <td>Spectrum Brands Inc., Madison, WI</td><td></td><td>0,05 % (p/v) dilué dans de l’eau déminéralisée</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td>4 mM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-250G</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>NaOH 0.1 N Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2105-50ML</td><td>Ajuster au pH 7.4 avec NaOH</td></tr><<tr><td>strong>MICROELECTRODES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K Acétate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1190-100G</td><td>2 M</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td>20 mM</td></tr><tr><td>SALINE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#5 Pinces</td><td>Fine Science Tools Dumont</td><td>11251-30 OR 11251-20</td><td>Pour la dissection générale des sangsues</td></tr><tr><td>AxoClamp 2A/2B Électromètre DCC</td><td>Axon Instruments Molecular Devices</td><td>2A/2B</td><td>Pour l’enregistrement du potentiel de membrane neuronale et du courant discontinu clamp</td></tr><tr><td>Résine noire</td><td>Dow Sylguard</td><td>170</td><td>Lignes générales Plat de dissection</td></tr><tr><td>Verre capilaire 1 mm de diamètre extérieur, 0,75 mm de diamètre intérieur</td><td>A-M Systems</td><td>615000</td><td>Pour la fabrication de microélectrodes pointues</td></tr><tr><td>Résine claire</td><td>Dow Sylguard</td><td>184</td><td>Lignes Boîte de Pétri utilisée pour monter le ganglion pour l’électrophysilogie</td></tr><tr><td>Condenseur à fond noir</td><td>Nikon</td><td>Dry 0.95-0.80 MBL 1210</td><td>Pour éclairer la préparation du ganglion lors de l’empalement cellulaire</td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Axon CNS Molecular Devices</td><td>1440A</td><td>Effectue A à D et D à A pour l’acquisition de données et la stimulation pendant l’électrophysiologie</td></tr><tr><td>Carte de traitement du signal numérique</td><td>dSpace</td><td>CLP1104</td><td>Notre logiciel implémente toutes les conductances/courants de notre modèle de neurone HN sur une carte contrôleur DS1103 dSPACE PPC en temps réel à une fréquence de 20 kHz avec une interface graphique ControlDesk (dSPACE, Paderborn, Allemagne)9.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Extracteur de microélectrodes Falming/Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>Pour la fabrication de microélectrodes pointues</td></tr><tr><td>Illuminateur haute intensité Fiber-Lite</td><td>Dolan Jenner Industries</td><td>170D</td><td>Pour éclairer la dissection générale et pour éclairer la préparation ganglionnaire lors de l’empalement</td></tr> cellulaire <tr><td>Amplificateur Headstage pour AxoClamp 2A</td><td>Axon Instruments</td><td>HS-2A Gain :0.1LU</td><td>Fait maintenant partie des dispositifs moléculaires pour l’enregistrement du potentiel de membrane neuronale et de la pince de courant discontinu</td></tr><tr><td>Guide de lumière</td><td>Dolan Jenner Industries</td><td>Rev R 38 08 3729107</td><td>Pour éclairer la dissection générale et pour éclairer la préparation des ganglions pendant l’empalement</td></tr> cellulaire <tr><td>Micromanipulateur</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-385</td><td>Micromanipulateur pour l’empalement cellulaire avec microélectrodes</td></tr><tr><td>Micromanipulateur contrôleur</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td>Contrôle les micromanipulateurs pour l’empalement des cellules avec des microélectrodes</td></tr><tr><td>Broches minuscules</td><td>BioQuip</td><td>0,15 mm de diamètre 1208SA</td><td>Doit être raccourci en récurvant à ~5 mm</td></tr><tr><td>Plaque d’essai optique 3' x 5' x 8"</td><td>Newport</td><td>Obsolète</td><td>Avec les 4 isolateurs pneumatiques ci-dessous utilisés pour construire un espace de travail sans vibration pour l’électrophysiologie</td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>HAMEG Instruments</td><td>HM303-6</td><td>Pour surveiller le réglage des électrodes pendant le DCC</td></tr><tr><td>Pascheff-Wolff Ciseaux à ressort</td><td>Moria</td><td></td><td>Fourni par Fine Science Tools (Foster City, CA) catalogue # 15371-92</td></tr><tr><td>pClamp 9 Logiciel</td><td>Axon Instruments</td><td>9</td><td>Fait maintenant partie de Moleculear Devices utilise le Digidata 1440 pour l’acquisition de données et la stimulation pendant l’électrophysiologie</td></tr><tr><td>Isolateurs pneumatiques 28"</td><td>Newport</td><td>Obsolete</td><td>Avec une plaque d’essai optique utilisée pour construire un espace de travail sans vibration pour l’électrophysiologie</td></tr><tr><td>Logiciel Simulink / MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2006 (Obsolète)</td><td>Implémente une pince dynamique sur la carte de traitement du signal numérique</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Wild</td><td>M5A</td><td>10x Oculaires utilisés pour disséquer la sangsue et enlever et dégainer les ganglions</td></tr><tr><td>Stéromicroscope</td><td>Wild</td><td>M5</td><td>20x Oculaires utilisés dans la station électrophysiologique pour visualiser le neurone pour la pénétration des microélectrodes</td></tr><tr><td>Student Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td>Pour la dissection générale des sangsues</td></tr></tbody></table>

contribution de la pompe na+/k+ à l’éclatement rythmique, explorée avec la modélisation et les analyses de pince dynamique

Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses

La pompe Na+/K+, souvent considérée comme une fonction de fond dans l’activité neuronale, contribue à un courant extérieur(pompeI)qui répond à la concentration interne de Na+ ([Na+]i). Dans les neurones en éclatement, tels que ceux trouvés dans les réseaux neuronaux du générateur de motifs centraux (CPG) qui produisent des mouvements rythmiques, on peuts’attendre à ce que la pompe [Na+] i et donc la pompeI varient tout au long du cycle de rafale. Cette réactivité à l’activité électrique, combinée à l’indépendance par rapport au potentiel membranaire, confère à lapompe I des propriétés dynamiques qui ne sont pas communes aux courants basés sur des canaux (par exemple, des canaux à tension ou à émetteur ou de fuite). De plus, dans de nombreux neurones, l’activité de la pompe est modulée par une variété de modulateurs, ce qui élargit encore le rôle potentiel de la pompe I dans l’activité d’éclatement rythmique. Cet article montre comment utiliser une combinaison de méthodes de modélisation et de pince dynamique pour déterminer comment jepompe et son interaction avec le courant Na+ persistant influencent l’activité rythmique dans un CPG. Plus précisément, cet article se concentrera sur un protocole de serrage dynamique et des méthodes de modélisation informatique dans les interneurones cardiaques des sangsues médicinales.

La modélisation avec l’ajout de la pompeI4 a mis en évidence les résultats expérimentaux présentés dans la section d’introduction et a commencé à expliquer le mécanisme d’éclatement assisté par pompe. Le modèle en temps réel démontré ici a été réglé <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg"> (et <img alt="Equation 31" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> les paramètres choisis) de sorte qu’il produise une activité rythmique régulière entrant dans les limites de l’activité normale observée dans les expériences - f, IBI, BD, T - et continue à produire une telle activité lorsque les paramètres modulés par la myomoduline <img alt="Equation 32" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> (le courant maximal de la pompe) et <img alt="Equation 33" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgh.jpg"> (la conductance maximale du courant h) sont variés ou co-variés dans le modèle. Les valeurs de paramètres déterminées peuvent être utilisées comme référence ou ensemble canonique pour les expériences de modélisation. Dans ces instances de modèle, jepompe oscille tout au long du cycle de rafale comme [Na+] i autourd’un niveau de base. Lapompe I contribue à la terminaison de l’éclatement pendant la phase d’éclatement, et l’hyperpolarisation qu’elle produit active I h pendant l’IBI; remarquez le niveau maximal de Ih près de l’amorçage de l’éclatement (Figure 2).
Bien que le modèle HN en temps réel ait tous implémenté les courants2,4 disponibles pour le serrage dynamique, l’accent a été mis ici sur <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> et , qui sont disponibles pour les <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> modifications pendant que le modèle est en cours d’exécution dans l’interface graphique de serrage dynamique ( Figure3). La pince dynamique permet à l’expérimentateur d’ajouter (ou de soustraire avec un négatif <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg"> ou <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> ) toute conductance ou tout courant dans un neurone artificiellement qui imite la tension et la dépendance ionique d’une conductance ou d’un courant réel. Ainsi, il est possible d’explorer pleinement comment une conductance/un courant particulier interagit avec les conductances/courants endogènes à l’intérieur des cellules (Figure 1). Le modèle HN en temps réel indique que le courant Persistant Na+ (IP)dans les neurones HN contribue une grande partie de l’entrée Na+ affectant fortement [Na+]i (Figure 2) et donc, jepompe. Parce que IP est actif à des potentiels membranaires relativement négatifs, il s’oppose à ce que jepompe même pendant l’IBI.
Ces observations indiquent qu’il est instructif d’explorer les interactions entre <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> et dans les <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> neurones HN isolés avec une pince dynamique comme discuté précédemment8,9,10. Ces expériences (en cours) sont réalisées avec des enregistrements de microélectrodes pointus dans des neurones HN(7) isolés synaptiquement (septième ganglion sectionné du cordon nerveux). À ce jour, ces expériences montrent que l’éclatement robuste est restauré dans les neurones HN tonalement actifs (en raison de la fuite de pénétration de microélectrode introduite) par co-addition de la pompe IP et I avec pince dynamique(Figure 4). C’est une observation importante indiquant qu’un mécanisme d’éclatement est disponible dans ces neurones (même lorsque la fuite est compromise) qui résulte de l’interaction de lapompe I et de lapompeI. Les résultats préliminaires indiquent leur forte interaction compliquée, qui peut être explorée dans le modèle et les expériences (Figure 5).
En conclusion, jepompe en réponse à des augmentations périodiques de [Na+] i pendantl’activité d’éclatement contribue au rythme de rafale par la terminaison de rafale (BD décroissante). L’interaction de la pompe IP et I constitue un mécanisme suffisant pour soutenir l’activité d’éclatement endogène; ce mécanisme peut rétablir un éclatement robuste dans les interneurones HN enregistrés intracellulairement dans le ganglion 7. L’interaction entre IP et Ipompe à travers [Na+]i affecte la période de sursaut HN de manière non monotone et assure la robustesse de l’éclatement autonome. Ces conclusions sont conformes aux expériences et à la modélisation dans les systèmes de vertébrés11,12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig01.jpg"> Figure 1: Activité électrique de l’interneuron cardiaque de la sangsue et mise en œuvre de la pompe I et de la pompe I P avec pince dynamique. (A) Activité normale d’éclatement enregistrée simultanément, extracellulairement (en haut) et intracellulaire (en bas), dans un battement de cœur HCO de sangsue à partir d’un troisième ganglion, schéma des neurones enregistrés et de leurs connexions synaptiques mutuellement inhibitrices à droite. (B) Schéma de pince dynamique lors de l’enregistrement d’un interneuroone HN(7) dans un ganglion isolé 7; notez qu’il n’y a pas d’interaction synaptique entre les deux interneurones HN(7). (Ci) Éclatement dans un interneuroon HN(7) compromis par fuite. (Cii) Un éclatement plus robuste peut être produit en ajoutant une pompe dynamique à pince I ( <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> = 0,1 nA), qui compense la fuite induite par la microélectrode, mais déprime l’excitabilité, et <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> (1 nS), ce qui augmente l’excitabilité. Les lignes pointillées noires indiquent les valeurs de référence. Abréviations : HN = interneuron cardiaque ; HCO = oscillateur demi-centre; Ipompe = courant sortant; IP = Na persistant+ courant; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">= Na maximum+/K+ courant de pompe; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> = conductance maximale du courant Persistant Na+ ; Vm = potentiel membranaire; [Na+] i = concentration interne de Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig02.jpg"> Figure 2: Modèle d’interneuronon HN unique montrant des traces de potentiel membranaire (Vm), I h, Ipompe,[Na+]i, et IP. Les courants hyperpolarisants vers l’extérieur sont négatifs et les courants dépolarisants vers l’intérieur sont positifs. Les lignes pointillées noires indiquent les valeurs de référence. Abréviations : HN = interneuron cardiaque ; Ipompe = courant sortant; IP = Na persistant+ courant; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">= Na maximum+/K+ courant de pompe; Ih = courant intérieur activé par l’hyperpolarisation; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg">= conductance maximale du courant Persistant Na+ ; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgh.jpg"> = conductance maximale du courant intérieur activé par l’hyperpolarisation; Vm = potentiel membranaire; [Na+] i = concentration interne de Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig03.jpg"> Figure 3: Interface utilisateur graphique du modèle d’interneuron cardiaque en temps réel (HN) et de la pince dynamique implémentée sur une carte de traitement du signal numérique. En haut à gauche : Les boîtes mathématiques rouges sont des boîtes de paramètres déterminées par l’utilisateur pour le modèle en temps réel, tandis que les boîtes blue Live sont des boîtes de paramètres déterminées par l’utilisateur utilisées dans la pince dynamique. El = le potentiel d’inversion du courant de fuite; Gl = conductance de fuite; Gh = conductance maximale du courant h; Gp = Conductance maximale du courant P; GCaS = conductance maximale lente du courant calcique; PumpMax = courant maximal de la pompe; [Conductance synaptique maximale GSyn2 vers le neurone respectif; Seuil de franchissement de pic ThreshSyn2 pour la médiation d’un potentiel synaptique - ceux-ci utilisés pour fabriquer un oscillateur semi-central hybride (vivant / modèle) non illustré ici.]. En bas à gauche pour dynamic clamp. Tout à gauche se trouvent 5 valeurs calculées de variables de serrage dynamiques: Ipompe = courant de pompe injecté; Ih = h-courant injecté (non utilisé ici); IP = P courant injecté; NaI = Na interne calculé+ concentration; ENa = potentiel d’inversion du sodium calculé. En bas à gauche pour dynamic clamp. À droite des variables calculées se trouvent 6 boîtes de paramètres déterminées par l’utilisateur : GNa = utilisation supposée de la conductance maximale de sodium rapide endogène pour calculer le flux Na+ associé aux potentiels d’action ; PumpMaxL = courant maximal de la pompe à injecter par pince dynamique; Naih voir équation (2); Gh = conductance maximale pour déterminer le courant h à injecter par pince dynamique; Gp = utilisation supposée de la conductance maximale du courant P endogène pour calculer le flux Na+ associé au courant P endogène; GpinHNLive = conductance maximale pour déterminer le courant P à injecter par pince dynamique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig04.jpg"> Figure 4: Analyse dynamique de la pince de l’éclatement indépendant HN(7). La régulation à la <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> hausse de (A) 4,0 nS à (B) 9,0 nS ralentit le rythme indépendant des rafales HN. Des traces expérimentales montrent un éclatement rythmique dans le neurone HN(7) isolé avec pince dynamique. Les plages d’oscillation de [Na+]i et Vm augmentent avec la régularitée à la <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> hausse. Traces de haut en bas : Vm enregistrée, pompeIinjectée, calculée [Na+]i, et injectée IP. Les lignes pointillées noires indiquent les valeurs de référence. Abréviations : HN = interneuron cardiaque ; Ipompe = courant sortant; IP = Na persistant+ courant; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">= Na maximum+/K+ courant de pompe; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> = conductance maximale du courant Persistant Na+ ; Vm = potentiel membranaire; [Na+] i = concentration interne de Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig05.jpg"> Figure 5: Analyse dynamique de la pince de l’éclatement indépendant HN(7). La régulation à la hausse de <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> tend à diminuer, suivie d’une période d’éclatement de HN accrue. Dans des expériences individuelles (points reliés par des lignes) à l’aide d’une pince dynamique, les <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> valeurs ont été balayées tout en <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> faisant l’expérience constantes. Les couleurs représentent différents niveaux constants d’ajout <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> utilisés dans différentes expériences. Abréviations : HN = interneuron cardiaque ; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> = Na maximum+/K+ courant de pompe; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> = conductance maximale du courant Persistant Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Présenté ici est une méthode d’étude des rôles de la pompe Na+/ K+ et du courant Na+ persistant dans les interneurones cardiaques de sangsue à l’aide d’une pince dynamique.

Contribution de la pompe Na+/K+ à l’éclatement rythmique, explorée avec la modélisation et les analyses de pince dynamique

The Na+/K+ pump, often thought of as a background function in neuronal activity, contributes an outward current (Ipump) that responds to the internal ...

Le serrage dynamique peut modifier ou introduire n’importe quel courant membranaire dans un neurone. Nous introduisons et modifions la pompe sodium-potassium et le courant de sodium persistant dans un interneuron cardiaque vivant d’une sangsue. L’utilisation d’une lampe dynamique permet un contrôle complet avec une frappe de la dynamique et de l’amplitude de tout courant introduit dans un neurone en temps réel.Le développement de systèmes interactifs en temps réel tels que la pince dynamique sous-tend toutes les recherches sur l’IMC. Tous les aspects des études cellulaires sur l’activité électrique des neurones et des réseaux peuvent potentiellement bénéficier de l’utilisation de la pince dynamique. Les principaux défis de cette technique sont le développement de modèles en temps réel dans les neurones et l’étalonnage des ajustements dynamiques des crampes au neurone sélectionné pour l’étude.Pour isoler le ganglion 7 d’un cordon nerveux de sangsue, remplissez une ligne de résine noire disséquant le plat avec environ un centimètre de solution saline réfrigérée complétée par du chlorure de sodium, du chlorure de potassium, du chlorure de calcium, du D-glucose et du HEPES dans de l’eau désionisée et épinglez une sangsue anesthésiée froide côté dorsal dans la chambre. Utilisez un stéréomicroscope à un grossissement de 20X avec un éclairage de guide de lumière oblique et des ciseaux à ressort de cinq millimètres pour faire une coupe longitudinale d’au moins trois centimètres de long à travers la paroi du corps dans la troisième partie rostrale du corps. Utilisez des épingles pour séparer le tissu de la paroi du corps afin d’exposer les organes internes et aspirez le sang pour obtenir une meilleure vue.Isoler un ganglion individuel du milieu du corps 7. En utilisant des pinces pointues numéro cinq pour aider à guider la coupe et pour maintenir le sinus, utilisez les ciseaux pour ouvrir le sinus dans lequel réside le cordon nerveux, en prenant soin de diviser le sinus dorsalement et ventralement. En gardant le sinus attaché à chacune des deux racines nerveuses bilatérales qui émergent du ganglion, coupez les faisceaux de nerfs conjonctifs rostral et caudal pour enlever le ganglion du corps et coupez les racines latérales à l’endroit où elles émergent du sinus.Utilisez de vieilles pinces numéro cinq émoussées pour fixer les bandes sinusales et les tissus lâches avec des épingles à insectes Minutien raccourcies côté ventral vers le haut dans des boîtes de Petri doublées de résine transparente. Épinglez les conjonctifs rostral et caudal aussi loin que possible du ganglion et épinglez solidement les racines. Augmentez le grossissement du stéréomicroscope à 40X ou plus et ajustez l’éclairage oblique de sorte que les corps cellulaires neuronaux puissent être facilement observés sur le côté ventral du ganglion juste en dessous du périneurium.À l’aide de micro-ciseaux, commencez à couper la gaine péronère lâche entre les racines d’un côté du ganglion, en continuant la coupe latéralement de l’autre côté et en vous assurant de garder la lame de ciseaux superficielle sans endommager les corps cellulaires neuronaux directement sous la gaine. Faites une coupe superficielle similaire caudalement à partir de la coupe latérale le long de la ligne médiane et utilisez une pince fine numéro cinq pour tirer un lambeau latéral caudal de gaine loin du ganglion à la fois pour permettre à chacun d’être excisé. Lorsque les deux lambeaux ont été retirés, les deux interneurones cardiaques doivent être exposés.Placez la parabole dans la configuration d’enregistrement et superamorcez l’échantillon avec une solution saline à un débit de cinq millilitres par minute à température ambiante. Pour identifier les interneurones sur la configuration d’enregistrement, sélectionnez un grossissement de 50 à 100X avec un éclairage de champ sombre ci-dessous et localisez un neurone HN 7 de la paire bilatérale par son emplacement canonique à la position postriolatérale dans le ganglion 7 du milieu du corps. Ensuite, utilisez un micro manipulateur pour positionner une micro-électrode pointue remplie de deux acétate de potassium molaire et d’une micro électrode de chlorure de potassium de 20 millimolaires très près du corps de la cellule cible et utilisez un électromètre neurophysiologique pour observer en permanence le potentiel enregistré.Réglez ce potentiel à zéro millivolts et pénétrez dans le neurone avec la microélectronique à l’aide du manipulateur pour entraîner lentement l’électrode le long de son long axe. Utilisez une fonction de bourdonnement de l’électromètre de 100 millisecondes jusqu’à ce qu’un changement négatif du potentiel membranaire et une activité de pic vigoureuse sont observés. Réglez l’électromètre sur au moins trois kilohertz en mode de serrage de courant discontinu pour enregistrer simultanément le potentiel de la membrane tout en transmettant le courant au neurone.Utilisez un oscilloscope pour surveiller le réglage de l’électrode et utilisez un injecteur de courant constant pour injecter un courant constant de moins 0,1 nanoampère pendant une à deux minutes pour stabiliser l’enregistrement. Le neurone HN 7 peut être identifié par sa forme de pointe caractéristique et sa faible activité d’éclatement. Pour la conductance de serrage dynamique et la mise en œuvre actuelle, ouvrez un logiciel de serrage dynamique conçu sur mesure pour la carte de traitement du signal numérique.Et pendant que le modèle fonctionne, réglez le courant maximal de la pompe à 0,1 à 0,2 nanoampères et augmentez progressivement la conductance maximale du courant de sodium persistant jusqu’à ce qu’un éclatement régulier s’ensuive. Faire systématiquement varier ces courants par incréments de 0,1 nanoampère pour la sortie maximale du courant de la pompe et d’un nanosiemens incréments pour la conductance maximale du courant de sodium persistant et évaluer les effets de ces augmentations sur la fréquence de pointe, l’intervalle inter-rafale, la durée de rafale et la période de rafale. Maintenez la conductance maximale du courant de sodium à une valeur fixe spécifique et balayez par incréments d’un nanoampère sur une plage de courants de pompe maximaux pour soutenir une activité d’éclatement régulière avant d’augmenter la valeur fixe de la conductance de sodium d’un nanosiemens et de balayer une deuxième plage de courants de pompe maximaux.Pour chaque paire de paramètres implémentée, collectez des données contenant au moins huit rafales afin de pouvoir effectuer des mesures moyennes fiables de la fréquence de pointe, de l’intervalle entre rafales, de la durée des rafales et de la période de rafale. Ensuite, collectez des données à partir de plusieurs neurones supplémentaires comme cela vient d’être démontré pour générer un graphique composite. En utilisant ce modèle, le courant de la pompe vers l’extérieur oscille tout au long du cycle d’éclatement en tant que concentration interne de sodium autour d’un niveau de base.Ce courant de pompe contribue à la terminaison de l’éclatement pendant la phase d’éclatement. L’hyperpolarisation produite par le courant de la pompe active l’hyperpolarisation activée vers l’intérieur pendant l’intervalle inter-rafale. Le modèle d’interneuroone cardiaque en temps réel indique que le courant de sodium persistant dans les interneurones cardiaques contribue à ce qu’une grande partie de l’entrée de sodium affecte fortement la concentration interne du sodium et donc le courant de la pompe.Parce que le courant de sodium persistant est actif à des potentiels membranaires relativement négatifs, il s’oppose au courant de la pompe pendant les intervalles d’éclatement et d’inter-éclatement. Comme illustré, l’éclatement robuste est restauré dans les interneurones cardiaques tonalement actifs par la co-addition de courants persistants de pompe sodium et sodium potassium avec une pince dynamique. Les résultats préliminaires indiquent une forte interaction compliquée entre les deux courants, qui peut être explorée plus avant à l’aide du modèle.Une expérience réussie dépend du bon desthéchauffage du ganglion et de la conduite, de la pénétration et du bourdonnement soigneusement dirigés de la microélectronique. Nous augmentons la pince dynamique en mettant en œuvre un courant de pompe dépendant du sodium qui est calculé en estimant la concentration intracellulaire d’un ion. De telles estimations peuvent être utilisées pour injecter n’importe quel courant dépendant des ions dans un neurone.

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Cet article de la vidéo illustre la mise en place, les procédures de patcher les corps cellulaires et la façon de mettre en œuvre les enregistrements de serrage dynamiques à partir de cellules ganglionnaires dans l'ensemble du montage souris rétines. Cette technique permet l'étude de la contribution précise des entrées synaptiques excitateurs et inhibiteurs, et leur importance relative et le calendrier de dopage neuronale.

La mise en œuvre Clamp dynamique avec conductances synaptiques et artificielle chez la souris cellules ganglionnaires rétiniennes

Précis, quantification basée sur la causalité de la fonction diastolique global a été réalisé par l'analyse cinématique basée sur la modélisation des flux transmitral via le paramétrée diastolique de remplissage (PDF) de formalisme. PDF génère rigidité, la relaxation et les paramètres de charge unique et met en lumière «nouvelle» physiologie tout en fournissant des indices sensibles et spécifiques de la dysfonction.

Quantification de Global diastolique fonction de l&#39;analyse basée sur la modélisation cinématique de transmitral débit via le formalisme de remplissage diastolique paramétrée

Voici une nouvelle région d'intérêt protocole d'analyse basée sur le tri des ellipses meilleur ajustement attribués aux régions de signal positif dans le temps à deux dimensions image laps séquences est démontrée. Cet algorithme peut permettre aux enquêteurs d'analyser de manière approfondie les signaux physiologiques + Ca 2 avec entrée minimale de l'utilisateur et de partialité.

Analyse automatisée de dynamique Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaux de séquences d&#39;images

La voltamétrie cyclique à balayage rapide peut surveiller la neurotransmission de dopamine in vivo dans le contexte de médicaments, de maladies et d'autres manipulations expérimentales. Ce travail décrit la mise en œuvre de QNsim1.0, un logiciel pour modéliser les réponses de dopamine stimulées électriquement selon le modèle neurobiologique quantitatif pour quantifier les estimations de la libération de dopamine et de la dynamique de recapture.

Modélisation des données de voltamétrie cyclique à balayage rapide à partir de données de neurotransmission de dopamine à stimulation électrique utilisant QNsim1.0

Recyclage de calcium intracellulaire joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction systolique et diastolique dans les cardiomyocytes. Nous décrivons ici un protocole pour évaluer le réticulum sarcoplasmique Ca2 + réserve et fonction de suppression de calcium diastolique dans les cardiomyocytes en un système d’imagerie de calcium.

Évaluation de réticulum sarcoplasmique Calcium réserve et intracellulaires de Calcium diastolique enlèvement dans les Cardiomyocytes ventriculaires isolées

Une technique rapide et fiable est proposée pour contrôler les oscillations de forme d’une seule bulle acoustique piégée basée sur la technique de coalescence entre deux bulles. Les oscillations de forme de bulle à l’état stationnaire, contrôlées par symétrie, permettent d’analyser l’écoulement du fluide généré au voisinage de l’interface de bulle.

Induction de microflux par des oscillations de bulles non sphériques dans un système de lévitation acoustique

Une relaxation myocardique et cardiaque rapide est essentielle à une physiologie normale. On sait maintenant que les mécanismes de relaxation mécanique dépendent de la vitesse de déformation. Ce protocole donne un aperçu de l’acquisition et de l’analyse d’expériences pour approfondir le contrôle mécanique de la relaxation.

Contrôle mécanique de la relaxation à l’aide de trabécules cardiaques intactes

Le dispositif de succion non nutritive (NNS) peut facilement collecter et quantifier les caractéristiques des NNS à l’aide d’une sucette connectée à un transducteur de pression et enregistrée par un système d’acquisition de données et un ordinateur portable. La quantification des paramètres NNS peut fournir des informations précieuses sur le développement neurologique actuel et futur d’un enfant.

Mesures des paramètres de succion non nutritive à l’aide d’un système de transducteur de pression personnalisé

Ce protocole présente une boîte comportementale basée sur un microcontrôleur pour évaluer l’inhibition pré-impulsion (IPP) en collectant des données d’accélération à partir d’un capteur situé sous la boîte. Ces données évaluent les déficits sensoriels chez les rats socialement isolés, avec une méthode supplémentaire pour synchroniser les données avec l’activité neuronale afin de faire progresser les études neurophysiologiques sur les troubles du comportement.

Développement d’une boîte comportementale pour évaluer l’inhibition prépulsive et l’activité neuronale dans des modèles animaux psychiatriques

L’électrophysiologie à pince dynamique peut établir des liens de causalité entre les déficits de décharge neuronale et le dysfonctionnement des canaux ioniques. Nous décrivons des méthodes et des protocoles de clamp dynamique dans les neurones cérébelleux de Purkinje de souris, en notant les ressources utiles et les considérations techniques. Dans une étude représentative, nous ajoutons une conductance sodique modélisée aux neurones de Purkinje Tsc1-/- pour sauver les décharges répétitives.

Méthodes de clamp dynamique pour étudier l’excitabilité neuronale altérée associée à l’autisme

Un protocole expérimental est présenté pour assembler, stimuler électriquement et analyser les bicouches d’interface de gouttelettes dopées à la gramicidine A. Les relations structure-fonction lipide-protéine sont quantifiées en mesurant les variations de la surface membranaire, du flux ionique et de la conductance à canal unique, et en reliant ces réponses à des changements de conduction ionique similaires à la plasticité dans un modèle membranaire inspiré par des synapses électriques.

Caractérisation de la structure et de la fonction membranaire lipide-protéine à l’aide de bicouches d’interface de gouttelettes

Découvrez comment la pompe Na+/K+ et le courant sodique persistant influencent l'éclatement rythmique des interneurones cardiaques de sangsue. Cette méthode de pince dynamique permet de contrôler les courants ioniques en temps réel.

Contribution de la pompe Na⁺/K⁺ à l’éclatement rythmique, explorée avec la modélisation et les analyses de pince dynamique

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