Collection à cellule unique de cellules trophoblastiques dans les embryons humains de stade de péri-implantation

Beaucoup de grossesses échouent tôt dans le développement humain d’embryon autour des sept ou huit post-fertilisation. Ce protocole offre aux chercheurs la possibilité de cultiver des concepteurs humains in vitro au cours de cette mystérieuse fenêtre d’implantation. Cela nous permet de comprendre les mécanismes qui sous-tendent le succès de l’implantation humaine et de la formation placentaire précoce.

L’utilisation d’un système de culture étendu pour cultiver des embryons humains à stade périimplantatoire in vitro est probablement le seul moyen d’obtenir des matériaux authentiques pour étudier l’implantation et la différenciation précoce du trophoblaste. Cette technique simple est un outil puissant qui nous permet de répondre à de nombreuses questions fondamentales sur le développement précoce de l’homme. Les recherches menées avec l’utilisation de ce protocole contribueront largement à la compréhension de la perte précoce de grossesse, de l’échec récurrent d’implantation et des pathologies de placenta.

Deirdre Logsdon, doctorante d’un laboratoire, démontrera la procédure. Un jour avant le réchauffement de l’embryon, préparez des supports et des plaques de récupération dans une hotte stérile à écoulement laminaire. Remplissez deux plats de lavage de culture d’organe de puits de centre avec 500 microlitres de BM avec 10%SPS, puis couvrez le BM avec 500 microlitres d’huile de qualité de culture d’embryon.

Dans un plat de culture tissulaire de 16 millimètres, superposer huit millilitres d’huile de culture embryonnaire et ancrer 20 gouttes de BM de microlitre avec 10% de SPS au fond. Equilibrer la vaisselle et l’assiette de récupération dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 6 % de dioxyde de carbone et 5 % d’oxygène pendant au moins quatre heures. Aliquot environ quatre millilitres d’IVC 1 dans un tube de bouchon instantané de cinq millilitres et préparer un plat de lavage avec 500 microlitres d’IVC 1 sans superposition d’huile.

Equilibrer le plat et le tube dans l’incubateur pendant au moins quatre heures. Diluer la fibronectine du sérum humain dans PBS à 30 microgrammes par millilitre. Ouvrez les huit paquets de coverslip bien chambés en prenant soin de ne pas toucher les puits, puis pipette doucement 250 microlitres de la fibronectine dans chaque puits.

Remplacez le couvercle sur le coverslip et incubez-le à quatre degrés Celsius pendant 20 à 24 heures. Préparer la plaque de culture prolongée le matin du réchauffement de l’embryon. Récupérer le bordereau de couverture chambé avec de la fibronectine et le placer dans le capot d’écoulement laminaire.

Retirez ensuite le mélange de fibronectine avec une pipette d’un millilitre et jetez-le. Pipette 300 microlitres de l’IVC 1 équilibré dans chaque puits et placer le coverslip dans l’incubateur jusqu’à l’enlèvement de la zona pellucida. Après le réchauffement et la récupération des embryons humains D5, évaluez-les pour leur ré-expansion et prenez des photos de chaque embryon.

Déplacez chaque embryon à 500 microlitres d’un milieu de manipulation tamponné MOPS avec 5% de FCS. Ensuite, traitez-le avec la solution acide de Tyrode tel que décrit dans le manuscrit du texte. Déplacez immédiatement l’embryon avec la zona dissolvante en 300 microlitres de milieu tamponné MOPS réchauffé pour étancher la solution du Tyrode.

Déplacez ensuite l’embryon dans un plat central de tissu d’organe de puits contenant le BM équilibré avec 10%SPS sous l’huile de qualité de culture d’embryon. Ensuite, retournez l’embryon à la goutte de récupération de 20 microlitres. Déplacez individuellement les embryons vers le plat de lavage avec le média IVC 1 équilibré, puis déplacez soigneusement chaque embryon vers un puits de la couverture chambrée, en vous assurant de garder une trace de l’identification de l’embryon.

Retournez le coverslip chambé dans un incubateur fixé à 37 degrés Celsius, 6% de dioxyde de carbone et d’oxygène atmosphérique pendant deux jours. Au deuxième jour de croissance, examinez attentivement l’attachement des embryons au microscope et échangez les médias. Sachez quel embryon est attaché au plat en tapant doucement sur l’assiette.

Pour changer le média, retirez le couvercle et aspirez soigneusement 150 microlitres d’IVC 1, en prenant soin de ne pas déranger l’embryon attaché. Si un embryon n’est pas encore attaché à la plaque, n’échangez pas les supports parce que le sérum dans IVC 1 aidera à l’attachement. Lentement pipette 150 microlitres de médias de culture étendue équilibrés, IVC 2 dans chaque puits et remplacer le couvercle sur le coverslip.

Soigneusement retourné le coverslip chambé à l’incubateur. Répétez l’échange de médias et la vérification de pièce jointe tous les jours jusqu’à ce que les embryons soient prêts pour la fixation ou la digestion unicellulaire. Si la collecte des supports usés est nécessaire pour une analyse plus approfondie, casser le gel des 150 microlitres d’IVC 1 enlevé dans un tube stérile à faible liaison de 0,5 millilitre.

Lavez chaque embryon une fois avec 200 microlitres de PBS, puis ajoutez 200 microlitres de solution de trypsine à chaque puits. Remettre le coverslip chambé à l’incubateur pendant cinq minutes. Utilisez une petite pipette ou une pipette buccale finement tirée pour ramasser un VTT individuel, puis utilisez une pipette plus grande pour dissocier doucement l’embryon en aspirant de haut en bas.

Continuer à aspirer l’embryon doucement et à plusieurs reprises à l’aide d’une pointe de pipette de plus petit diamètre jusqu’à ce que l’embryon ait été incubé pendant un total de 10 minutes dans la trypsine. Pour effectuer la sélection d’une seule cellule, déplacez les cellules dissociées à travers 320 gouttes de lavage de microlitres de PBS et 0,1% PVP sous huile de culture embryonnaire, en prenant soin de ne pas perdre de cellules. Après le lavage, les cellules utilisent une pipette en verre finement tirée pour sélectionner une cellule.

Pipette soigneusement la cellule unique dans un tube stérile de liaison basse de 0,2 millilitre avec un volume minimal de PBS et PVP. Prenez des cellules individuelles libres dans de l’azote liquide et conservez-les à 80 degrés Celsius négatifs pour une utilisation plus rapide. Les embryons en bonne santé ont montré la prolifération continue au cours de la culture étendue, alors que les embryons anormaux ont commencé à se rétracter de leurs bords externes et à se désintégrer.

Au huitième jour de fécondation post, la plupart des cellules dans les embryons étaient cytotrophoblaste ou CTBs, qui étaient positifs pour le marqueur trophoblaste GATA-3. À la périphérie de l’embryon, les CTBs se différeciaient déjà en syncytiotrophoblastes multinucléés, qui avaient une feuille comme l’apparence et taché positif pour les humains CGB. Au jour 10, la formation des cellules migratrices positives de trophoblaste de CGB était à un maximum, qui a été confirmé par la hausse de la production de HCG à ce moment.

Les trophoblastes migrateurs qui ont taché positif pour HLA-G, ont également commencé à émerger et migrer loin du corps embryonnaire. Au jour 12, la différenciation stb était en déclin et la production de VTT est devenue plus importante, suggérant un changement d’accent de la production d’hormones le jour 10 à la migration cellulaire le jour 12. Ces changements peuvent être observés dans une vidéo time lapse de la période périimplantatoire.

La vidéo montre l’effondrement du blastocèle, la formation du STB, et la différenciation et la migration éventuelles du VTT. La chose la plus importante à garder à l’esprit lorsque vous terminez cette procédure est que vous travaillez avec des embryons vivants qui sont sensibles aux changements de température, d’osmolalité et de pH. Il est essentiel de réduire au minimum le temps que les plats sont sortis de l’incubateur pour maintenir la santé de l’embryon.

Après avoir terminé cette procédure, les investigateurs peuvent employer les cellules simples isolées pour des analyses d’omics simples en aval de cellules, telles que le séquençage d’ARN simple de cellule et le séquençage de bisulfite de génome entier pour mieux comprendre des changements épigénétiques et transcriptomiques pendant l’implantation humaine et la formation tôt de placenta.