Name: Collection à cellule unique de cellules trophoblastiques dans les embryons humains de stade de péri-implantation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Apprenez à isoler des cellules trophoblastiques uniques à partir d'embryons humains de stade péri-implantation. Cette méthode permet d'étudier la différenciation trophoblastique et les mécanismes de l'implantation in vitro.

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Nous tenons à remercier les nombreux patients du Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM) qui ont gracieusement fait don de leurs embryons pour la recherche. Nous tenons également à remercier Karen Maruniak et le laboratoire clinique du CCRM pour leur aide dans le traitement des échantillons de hCG, ainsi que Sue McCormick et son équipe d’embryologie clinique de FIV au CCRM pour leur aide à la collecte, au stockage, au suivi et au don d’embryons. Le financement a été fourni à l’interne par le CCRM.

Tous les embryons humains ont été donnés avec le consentement pour une utilisation dans la recherche. Les protocoles relatifs à la culture élargie des embryons humains ont été approuvés par la Commission d’examen institutionnel de l’Ouest (étude no 1179872) et suivent les lignes directrices internationales. Toute utilisation d’embryons humains doit être examinée par les organes d’éthique et de gouvernance appropriés associés à l’établissement de recherche à l’aide de ce protocole.
1. Préparation
<ol><li>Préparer des plaques de milieux et de récupération un jour avant le réchauffement de l’embryon dans une hotte stérile de flux laminaire.<ol>
<li>Préparer 2 mL de support de culture blastocyste (BM) avec 10% de substitut de protéine sérique v/v (SPS). REMARQUE : Les milieuux de culture Blastocyst peuvent contenir ou non des protéines ajoutées. Ici, nous avons utilisé un support qui doit être complété par 10% de la protéine d’albumine indiquée. Vérifiez les conseils du fabricant pour la variation dans cette supplémentation. Tous les supports doivent être filtrés à l’aide d’un filtre stérile de 0,22 μM fixé à une seringue stérile avant l’équilibre.</li>
		<li>Remplissez deux plats de lavage de culture d’organe de puits centraux avec 500 μL de BM avec 10% de SPS v/v recouverts de 500 μL d’huile de qualité de culture embryonnaire.</li>
		<li>Dans un plat de culture tissulaire de 60 mm, la couche 8 mL d’huile de culture embryonnaire, puis ancrer 20 gouttes de BM avec 10% v/v SPS au fond de la plaque de culture. Faire 1 goutte pour chaque embryon réchauffé. REMARQUE : Plus de médias, de gouttes et de vaisselle peuvent être faites au besoin. Des gouttes peuvent également être ajoutées au plat avant que l’huile ne soit superposée. L’ancrage des gouttes sous l’huile aidera à réduire l’évaporation et les changements ultérieurs dans l’osmolalité.</li>
		<li>Équilibrez BM avec 10% v/v SPS laver la vaisselle et plaque de récupération dans un incubateur à 37 °C, 6% CO2, 5% O2 pour au moins 4 h.</li>
		<li>Décongeler un flacon de la première étape des supports de culture étendu (IVC1) en 4 °C ou sur le dessus du banc.</li>
		<li>Préparer un plat de lavage de 500 μL d’IVC1 sans superposition d’huile. Aliquot environ 4 ml d’IVC1 dans un tube de 5 mL.</li>
		<li>Équilibre IVC1 et petit tube à bouchon d’IVC1 en 37 °C, 6 % de CO2 et O2 atmosphérique pour au moins 4 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer des plaques de culture étendues un jour avant le réchauffement de l’embryon dans une hotte stérile de flux laminaire.<ol>
<li>Diluer la fibronectine du sérum humain dans la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) à 30 μg/mL. 250 μL de fibronectine de 30 μg/mL par embryon seront nécessaires pour enrober les chambres.</li>
		<li>Ouvrez le paquet coverslip 8 bien chambré sous le capot tout en prenant soin de ne pas toucher les puits. Pipette doucement 250 μL de 30 μg/mL fibronectine dans chaque puits.</li>
		<li>Remettre le couvercle sur le couvercle chambrelé et placer à 4 °C pendant 20-24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer une plaque de culture étendue le matin du réchauffement de l’embryon.<ol>
<li>Récupérer le couvercle chambrelé avec de la fibronectine et placer dans le capot d’écoulement laminaire. Retirer le mélange de fibronectine à l’aide d’une pipette de 1 mL et jeter dans le contenant de déchets.</li>
		<li>Récupérer les supports IVC1 réchauffés et équilibrés à partir d’un petit tube à bouchons de claquettes de 5 m L.</li>
		<li>Pipette 300 μL d’IVC1 équilibré dans chaque puits. Veillez à ne pas laisser de liquide toucher le couvercle, car cela augmentera le risque de contamination.</li>
		<li>Retournez le couvercle chambrelé avec IVC1 pour incuber à 37 °C, 6% DE CO2 et l’atmosphère O2 jusqu’à ce que l’enlèvement de la zona pellucida à l’étape 4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Réchauffement vitrifié D5 embryons humains
REMARQUE : D’autres fabricants peuvent avoir des protocoles légèrement différents selon leur propre technologie de vitrification. Consultez les instructions d’utilisation du fabricant, le cas échéant.
<ol><li>Chauffer 3,0 mL de solution de décongeler (TS) dans un plat de 35 mm à 37 °C. Apporter 300 μL de solution de dilution (DS) et deux puits de 300 μL de solution de lavage (WS) dans une plaque de 6 puits à température ambiante.</li>
	<li>À l’aide de forceps, retirez soigneusement le manchon du cryo périphérique tout en veillant à ce que l’embryon vitrifié reste toujours sous azote liquide.</li>
	<li>Déplacez rapidement le cryo périphérique de l’azote liquide et plongez la pointe du cryo périphérique en TS à 37 °C. Réglez une minuterie pendant 1 min et gardez le cryodémoteur submergé jusqu’à ce que l’embryon se détache dans le TS. REMARQUE : Les embryons chauds un à la fois pour garder une trace de l’identité des embryons, car ils peuvent se rapporter à l’information démographique des patients dans l’analyse en aval.</li>
	<li>Pendant l’incubation d’une minute en TS, retirez soigneusement le cryoposit et prenez doucement l’embryon et déplacez-vous du côté opposé du plat TS. REMARQUE : Si vous cuisinez plusieurs embryons, faites preuve de diligence pour séparer les embryons afin de vous assurer que les identités appropriées sont maintenues.</li>
	<li>Après 1 min, ramasser doucement l’embryon avec une petite quantité de TS, environ 2 μL. Déplacez l’embryon vers le fond du puits DS de 300 μL tout en couvrant l’embryon d’une fine couche de TS de la pipette. Réglez une minuterie pendant 3 min et placez la plaque de 6 puits sur le dessus du banc à température ambiante.</li>
	<li>Après 3 min, ramasser l’embryon avec une petite quantité de DS, environ 2 μL, et déplacer l’embryon vers le fond du puits suivant contenant 300 μL de WS. Encore une fois, superposer délicatement une petite quantité de DS de la pipette sur l’embryon. Réglez une minuterie pendant 5 min et retournez au dessus du banc.</li>
	<li>Après 5 min, ramasser l’embryon avec un volume minimal de WS et se déplacer vers le haut du puits final de 300 μL WS. L’embryon tombera lentement et se lavera à travers le WS jusqu’au fond. Expulser tout WS conservé de la pipette dans un puits vide.</li>
	<li>Prenez l’embryon avec un volume minimal et retournez au sommet du même puits de 300 μL de WS. L’embryon tombera une fois de plus au fond du puits. Réglez une minuterie pendant 1 min et retournez la plaque de 6 puits sur le dessus du banc.</li>
</ol>3. Récupération d’embryons réchauffés
<ol><li>Un à la fois, déplacez les embryons réchauffés dans un plat de tissu d’organe de puits central contenant 500 μL de BM équilibré avec 10% v/v SPS sous 500 μL d’huile de qualité de culture embryonnaire équilibrée.</li>
	<li>Laver les embryons en ramassant chaque embryon et en les déplaçant vers plusieurs zones du plat tout en soufflant de vieux milieus entre les mouvements. Prenez l’embryon et déplacez-le vers une baisse individuelle de culture de 20 μL de BM équilibrée avec 10% v/v SPS sous l’huile.</li>
	<li>Laissez les embryons réchauffés récupérer pendant 2 h dans un incubateur à 37 °C, 6 % de CO2, 5 % O2.
</li>
</ol>4. Suppression de Zona
<ol><li>Après une récupération de 2 h, évaluez les embryons pour la ré expansion et prenez des photos de chaque embryon.</li>
	<li>Déplacer les embryons individuellement dans 500 μL d’un milieu de manipulation tamponné d’acide propane (MOPS) à 500 μL avant le traitement avec la solution du Tyrode acide.</li>
	<li>Déplacez rapidement un embryon à travers 300 μL de la solution de Tyrode acide réchauffé tout en regardant activement à travers le microscope. La zona pellucida commencera visuellement à se dissoudre. Cela prendra environ 5 s.</li>
	<li>Déplacez immédiatement l’embryon avec la zona dissolvante dans 300 μL de meps réchauffé tamponné moyen pour éteindre la solution de l’acide Tyrode.</li>
	<li>Déplacez l’embryon avec un volume minimal de MOPS tamponné moyen dans un plat de tissu d’organe de puits central contenant 500 μL de BM équilibré avec 10% v/v SPS sous 500 μL d’huile de qualité de culture embryonnaire équilibrée pour laver.</li>
	<li>Renvoyez l’embryon à la baisse de récupération de 20 μL à partir de l’étape 3.2. REMARQUE : Lors de l’examen visuel suivant l’ablation de la zona, tous les embryons atteints de zona pellucidae retenus peuvent être traités davantage avec la solution acide du Tyrode si nécessaire, en répétant les étapes 4.2-4.6. La réduction de l’exposition à la solution du Tyrode est souhaitée.</li>
</ol>5. Blastocyst culture étendue
<ol><li>Déplacez les embryons individuellement dans le plat de lavage à l’une des supports IVC1 équilibrés de l’étape 1.1.6. Déplacez soigneusement un embryon à un puits du couvercle chambrelé avec IVC1 équilibré et maintenez l’identification d’embryon. REMARQUE : Cette étape doit être terminée le plus rapidement possible afin de minimiser l’évaporation moyenne.</li>
	<li>Retour de couvercles chambre à un incubateur réglé à 37 °C, 6% CO2, atmosphérique O2 pendant 2 jours. REMARQUE : Assurez-vous de décongeler et d’équilibrer les supports à 37 °C, 6 % de CO2, d’atmosphère O2 pour l’échange de médias 4 h à l’avance.</li>
	<li>Lors de la croissance D2 (D7 après la fécondation), examiner attentivement l’attachement des embryons sous le microscope et effectuer l’échange de médias.<ol>
<li>Notez quel embryon est attaché au plat avant d’échanger des supports. Appuyez doucement sur la plaque et examinez si un embryon s’est fixé solidement à la plaque sous le microscope.</li>
		<li>Retirez le couvercle et retirez soigneusement 150 μL d’IVC1 et jetez-les sans déranger l’embryon attaché. Si un embryon n’a pas encore attaché à la plaque, n’échangez pas les supports, car le sérum dans IVC1 aidera à l’attachement à l’embryon.</li>
		<li>Pipette 150 μL de milieux de culture étendus équilibrés, IVC2, lentement dans chaque puits et retourner le couvercle à la couverture chambre. REMARQUE : Assurez-vous que l’enlèvement du couvercle de la couverture chambrenée est réduit au minimum afin d’éviter l’évaporation moyenne.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retournez soigneusement le couvercle chambrelé à l’incubateur sans éclabousser aucun support sur le couvercle. Répétez l’échange de médias et la vérification de l’attachement tous les jours de culture prolongée jusqu’à ce que les embryons soient prêts pour la fixation ou la digestion d’une seule cellule.</li>
</ol>6. Collecte facultative des supports dépensés
<ol><li>En option, recueillir les médias passés lors de l’échange de médias culturels après D7 ou n’importe quel jour par la suite. Au cours de l’étape 5.3.2, plutôt que de jeter le gel de rupture moyen les 150 μL d’IVC1 enlevés dans un tube stérile de 0,5 mL à faible liaison pour analyse future.</li>
</ol>7. Fixation facultative pour l’immunofluorescence
<ol><li>Utilisez une pipette de 200 μL pour laver les embryons avec 1/2 échanges de SUPPORTs pendant 3x avant fixation pour enlever les débris extracellulaires. Le lavage des débris et des protéines excédentaires aidera à optimiser la clarté et à réduire le contexte dans les images obtenues avec l’immunofluorescence.</li>
	<li>Retirez tous les supports et ajoutez lentement 200 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans le puits. L’embryon voudra coller à la surface du liquide. Plusieurs lavages de 150 μL avec 4 % de PFA avant d’enlever tout le liquide aideront à minimiser les dommages causés à l’embryon.</li>
	<li>Incuber les embryons dans 4% PFA pendant 20 min pour la fixation.</li>
	<li>Laver les embryons 3x pendant 10 min par lavage avec 200 μL de 0,1% v/v polysorbate 20 dans pbs frais.</li>
	<li>Stockez les embryons fixes en polysorbate 20 de 0,1 % v/v en PBS à 4 °C avant de passer au protocole d’immunofluorescence.</li>
</ol>8. Digestion à cellule unique avec trypsine
REMARQUE : Les embryons frais (non fixes) sont utilisés pour la digestion des cellules uniques.
<ol><li>Laver l’embryon une fois avec 200 μL de PBS et ajouter 200 μL de solution de trypsin à chaque puits. Remettre le couvercle chambrelé à l’incubateur pendant 5 min.</li>
	<li>Retirez le couvercle chambrelé de l’incubateur et examinez les embryons sous un stéréoscope. Les cellules à la périphérie de l’embryon commenceront à se rétracter et le VTT doit encore être fixé à la plaque où ils sont situés à distance à partir de l’embryon.</li>
	<li>Utilisez une petite pipette ou une pipette buccale finement tirée pour ramasser la VTT individuelle avant de briser l’embryon entier. Passez à l’étape 9.1 pour sauver le VTT et revenez à l’étape 8.4 après l’étape 9.3.</li>
	<li>Utilisez une pipette de micromanipulation de poche ou une pipette buccale pour dissocier doucement l’embryon en aspirant de haut en bas.</li>
	<li>Les cellules commenceront à se dissocier de l’embryon entier. Continuer à aspirate l’embryon doucement et à plusieurs reprises à l’aide d’une pointe de pipette de plus petit diamètre ou d’une pipette buccale jusqu’à ce que l’embryon ait été incubé pendant un total de 10 min dans la trypsine.</li>
</ol>9. Sélection de cellules simples et prélèvement d’échantillons
<ol><li>Avec la trypsine minimale, déplacez les cellules dissociées à travers trois gouttes de lavage de 20 μL PBS + 0,1% de polyvinylpyrolidone (PVP) sous l’huile de culture embryonnaire avec soin de ne pas perdre de cellules.</li>
	<li>Après avoir lavé les cellules, utilisez une pipette en verre finement tirée pour sélectionner une cellule. Pipette soigneusement la cellule simple dans un tube stérile de 0,2 mL à faible liaison avec un volume minimal de PBS+0,1% PVP.</li>
	<li>Casser congeler les cellules individuelles dans l’azote liquide (LN2)et les stocker à -80 °C pour une utilisation future.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Le développement du protocole de culture des embryons humains par l’implantation a permis aux scientifiques d’explorer une période inédite dans le développement8,9. Ici, nous utilisons un système de culture étendu pour la culture des embryons humains et étudier la différenciation des trophoblastes précoces avant la formation du placenta villous. Les méthodes décrites ici nous permettent de collecter différents sous-lignes de tuberculose pour une utilisation dans ...

L’implantation humaine et l’émergence du placenta précoce sont historiquement difficiles à étudier et restent largement inconnues parce que les tissus humains sont inaccessibles à ce stade où la grossesse est cliniquement indétectable. Les modèles animaux sont inadéquats, car la placentation humaine a ses propres caractéristiques uniques par rapport à d’autres mammifères euthériens. Par exemple, le placenta humain envahit profondément dans la decidua avec quelques cellules trophoblastiques atteignant au moins le tiers intérieur du myomètre utérin tandis que d’autres cellules remodelent les artères spirales utérines. Même nos ancêtres évolutionnaires les plus proches, les primates non humains, montrent des différences dans la morphologie placentaire et les interactions trophoblastiques avec les tissus décennals maternels1,2,3. L’obtention d’embryons humains préimplantation in vitro n’a été possible que dans les années 1980, lorsque la fécondation in vitro humaine clinique (FIV) a commencé comme une pratique courante pour le traitement de l’infertilité4. Maintenant, les blastocystes humains peuvent être cultivés in vitro pour permettre la sélection d’embryons plus viables pour le transfert, ainsi que permettre des tests génétiques sûrs. L’amélioration des techniques de culture d’embryon, ainsi que l’utilisation croissante de la FIV a donné lieu à de nombreux blastocystes excédentaires qui restent après les cycles de traitement du patient ont été achevés. Avec le consentement du patient, l’approbation de la CISR et certaines restrictions, ces blastocystes peuvent être utilisés pour des études de recherche. Ils sont devenus une ressource inestimable qui ont été utilisés pour la dérivation des cellules souches embryonnaires humaines5, comprendre la transition de la masse cellulaire interne aux cellules souches embryonnaires6,7, et plus récemment, ont été cultivés avec succès jusqu’au jour (D) 13 pour remodeler l’implantation humaine8,9. En utilisant des approches omiques unicellulaires récemment développées, l’accès à ces tissus embryonnaires humains au stade d’implantation a offert des occasions uniques de décrire les mécanismes moléculaires qui régulent ce processus de différenciation cellulaire très dynamique, qui étaient auparavant impossibles à explorer10,11,12,13.
Ici, nous décrivons les méthodes utilisées dans notre publication récente caractérisant la dynamique de la différenciation trophoblastique lors de l’implantation humaine12. Ce protocole comprend le réchauffement des blastocystes vitrifiés, la culture embryonnaire étendue jusqu’à la D12 après la FIV, la digestion enzymatique de l’embryon en cellules individuelles et la collecte de cellules pour les tests en aval (figure 1). Ce système de culture étendue soutient le développement de l’embryon humain au stade péri-implantation sans apport maternel et récapitule la différenciation des trophoblastes qui semble compatible avec les observations faites à partir de spécimens histologiques il y a de nombreuses années14,15,16,17. Pendant l’implantation, la population de trophoblastes est composée d’au moins deux types de cellules : le cytotrophoblast mononucléé progéniteur(CTB) et le syncytiotrophoblaste multinucléé (STB) différencié en phase terminale. Lors de la digestion de la trypsine, le CTB sont de petites cellules rondes qui sont morphologiquement indiscernables des autres lignées cellulaires (figure 2A, panneau gauche). La séparation de CTB d’autres lignées cellulaires, telles que l’épiblaste et l’endoderme primitif, peut être réalisée par leurs profils transcriptomiques distincts révélés par séquençage de l’ARN unicellulaire. Les cellules syncytiotrophoblastiques peuvent être facilement identifiées comme des structures de forme irrégulière qui sont significativement plus grandes que les autres types de cellules et principalement situées à la périphérie de l’embryon (figure 2A, panneau intermédiaire; Figure 2B, panneau gauche). Les cellules trophoblastiques migratrices (TMB) sont un autre sous-lignée trophoblastique trouvée au cours de la culture élargie de l’embryon et peuvent être reconnues comme s’éloignant apparemment du corps principal de l’embryon (Figure 2A, panneau droit, figure 2B, panneau droit). Le trophoblaste migrateur, bien qu’exprimant beaucoup des mêmes marqueurs que le trophoblaste villous supplémentaire (EVT), ne devrait pas être appelé EVT, puisque les structures de villous dans le placenta n’ont pas émergé à ce stade très tôt de développement.
Expérimentalement, nous avons pu recueillir de petits CTB et de grands STB qui se distinguent facilement après que les embryons sont digérés en cellules simples à D8, D10 et D12 (Figure 2A,B). Les trophoblastes migrateurs apparaissent aux stades ultérieurs de la culture embryonnaire étendue et peuvent être recueillis à D12 avant la digestion enzymatique de l’embryon entier (Figure 2A,B). En séparant phénotypiquement ces trois sous-lignes trophoblastiques avant l’analyse des cellules uniques, nous pouvons identifier des marqueurs transcriptomiques spécifiques et définir le rôle biologique de chaque type de cellule. Cytotrophoblast sont très prolifératifs et agissent comme des cellules progénitrices dans l’approvisionnement des lignées différenciées STB et VTT10,11,12,13. Syncytiotrophoblast sont impliqués dans la production d’hormones placentaires pour maintenir la grossesse et peuvent également être responsables des embryons enfouis dans l’endomètre10,11,12,13. Le trophoblaste migrateur présente des caractéristiques encore plus fortes d’un phénotype migrateur envahissant et est probablement responsable d’une colonisation plus profonde et plus étendue de l’endomètre utérin10,11,12,13. Après avoir défini la signature transcriptomique de chaque type de cellule, les analyses de regroupement ont également révélé deux sous-ensembles supplémentaires de cellules qui étaient morphologiquement indiscernables de CTB et avaient des transcriptomes avec des caractéristiques de STB et MTB, respectivement12. Ces cellules intermédiaires sont probablement en train de différencier de CTB aux sous-lignes MTB ou STB et auraient été négligées si les embryons avaient été digérés aveuglément et si les cellules avaient été séparées par le transcriptome seulement.
Le protocole décrit ici utilise un système de culture bidimensionnel (2D) et peut ne pas être optimal pour soutenir le développement structurel tridimensionnel (3D), comme suggéré par une publication récente décrivant un système de culture 3D nouvellement développé13. Néanmoins, dans ce système 2D, la différenciation du trophoblaste précoce semble être compatible avec les observations faites à partir de spécimens in vivo14,15,16,17. Ce protocole peut également être facilement adapté pour l’utilisation dans le système de culture 3D récemment décrit13 avec des changements minimes. Toutes les étapes sont effectuées avec une pipette de micromanipulation de poche avec des pointes jetables disponibles dans le commerce ou une pipette buccale d’une pipette en verre finement tirée attachée à des tubes en caoutchouc, un filtre et un embout buccal.

<table><tbody><tr><td>Seringue stérile NORM JECT Luer Lock</td><td>VWR</td><td>53548-019</td><td>Boîte de 100</td></tr>, <tr><td>3130 ou 3110 Incubateur à CO2 à chemise d’eau Forma série II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire Corning Primaria 35 mm</td><td>VWR</td><td>62406-038</td><td>Caisse de 500 tube à</td></tr><tr><td>capuchon élastique de 5 ml</td><td>VWR</td><td>60819-295</td><td>Paquet de 25</td></tr><tr><td>tissus Corning Primaria de 60 mm parabole de culture</td><td>VWR</td><td>25382-687</td><td>Caisse de 200</td></tr><tr><td>parabole à 6 puits</td><td>Agtech Inc.</td><td>D18</td><td>Paquet de 1, 10 ou 50</td></tr><tr><td>solution acide de Tyrode</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1788</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Biotix 1250 &micro ; Pointes de pipette L</td><td>VWR</td><td>76322-156</td><td>Paquet de 960</td></tr><tr><td>Blast, milieu de culture de blastocystes</td><td>Origio</td><td>83060010</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Solution de dilution</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 x 4 mL</td></tr><tr><td>Verre borosilicaté jetable Pipets Pasteur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367820D</td><td>5,75 po. (146 mm) ; 720/Cs</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate Saline Buffered</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Culture d’embryons huile de paraffine OvOil</td><td>Vitrolife</td><td>10029</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Eppendorf PCR tubes 0,2 mL</td><td>VWR</td><td>47730-598</td><td>Paquet de 1 000</td></tr><tr><td>tubes PCR Eppendorf 0,5 mL</td><td>VWR</td><td>89130-980</td><td>Caisse de 500</td></tr><tr><td>Fibronectine provenant de plasma humain. Solution liquide à .1 %</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0895</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Gilson 1 mL Pipetteman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 200-1000 &micro ; L</td></tr><tr><td>Gilson 20 & micro ; L Pipette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 2-20 & micro ; L</td></tr><tr><td>Gilson 200 & micro ; L Pipette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 50-200 & micro ; L</td></tr><tr><td>G-MOPS support de manipulation</td><td>Vitrolife</td><td>10129</td><td>125 mL</td></tr><tr><td>Supports de manipulation</td><td>Origio</td><td>83100060</td><td>60 mL</td></tr><tr><td>Ibidi 8 lamelles bien chambrées</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>15 lames par boîte</td></tr><tr><td>IVC1/IVC2</td><td>Systèmes de guidage de cellules</td><td>M11-25/ M12-25</td><td>5-5mL aliquotes</td></tr><tr><td>K System T47 Plaque chauffante</td><td>Cooper Surgical</td><td>23054</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma Millex Filtres à seringue stériles avec membrane PVFD Durapore Fisher</td><td>Scientific</td><td>SLGVR33RS</td><td>Paquet de 50</td></tr><tr><td>embouts buccaux</td><td>IVF Store</td><td>MP-001-Y</td><td>100 pièces</td></tr><tr><td>Oosafe center well dish</td><td>Oosafe</td><td>OOPW-CW05-1</td><td>Caisse de 500</td></tr><tr><td>Quinn’s Advantage SPS</td><td>Origio</td><td>ART-3010</td><td>12x 12 mL</td></tr><tr><td>Tube en latex de caoutchouc pour embouts buccaux</td><td>Magasin de FIV</td><td>IVFS-NRL-B-5</td><td>5 pi.</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1270</td><td></td></tr><tr><td>Embouts décapants</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-275</td><td>20/pk 275 &micro ; m</td></tr><tr><td>Solution de décongélation</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>2 x 4 mL</td></tr><tr><td>The Stripper Micropipetter</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), sans rouge de phénol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td>1 x 100 mL</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379-25ML</td><td>Flacon de 25 mL</td></tr><tr><td>VWR 1-20 &micro ; Pointes de pipette L</td><td>VWR</td><td>76322-134</td><td>Paquet de 960</td></tr><tr><td>VWR 1-200 & micro ; Pointes de pipette L</td><td>VWR</td><td>89174-526</td><td>Paquet de 960</td></tr><tr><td>Solution de lavage</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 x 4 mL</td></tr></tbody></table>

collection à cellule unique de cellules trophoblastiques dans les embryons humains de stade de péri-implantation

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

L’implantation humaine, l’apposition et l’adhérence à l’épithélie de surface utérine et l’invasion subséquente du blastocyste dans le decidua maternel, est un événement biologique critique mais énigmatique qui a été historiquement difficile à étudier en raison de limitations techniques et éthiques. L’implantation est initiée par le développement du trophectoderme au trophoblaste précoce et la différenciation ultérieure en sous-lignées trophoblastiques distinctes. La différenciation précoce aberrante de trophoblast peut mener à l’échec d’implantation, aux pathologies placentaires, aux anomalies foetales, et à la fausse couche. Récemment, des méthodes ont été développées pour permettre aux embryons humains de se développer jusqu’au jour 13 après la fécondation in vitro en l’absence de tissus maternels, une période qui englobe la période d’implantation chez l’homme. Cela a donné aux chercheurs l’occasion d’étudier l’implantation humaine et de récapituler la dynamique de la différenciation des trophoblastes au cours de cette période critique sans confondre les influences maternelles et éviter les obstacles inhérents à l’étude des événements précoces de différenciation des embryons in vivo. Pour caractériser différents sous-lignes trophoblastiques lors de l’implantation, nous avons adopté des méthodes de culture étendue bidimensionnelles (2D) existantes et développé une procédure pour digérer et isoler enzymatiquement différents types de cellules trophoblastiques pour les tests en aval. Les embryons cultivés dans des conditions 2D ont une morphologie relativement aplatie et peuvent être sous-optimaux dans la modélisation in vivo en trois dimensions (3D) architectures embryonnaires. Cependant, la différenciation des trophoblastes semble être moins affectée, comme en témoignent les changements prévus de morphologie et d’expression génique au cours de la culture étendue. Différents sous-lignes trophoblastiques, y compris le cytotrophoblaste, le syncytiotrophoblaste et le trophoblaste migrateur, peuvent être séparés par la taille, l’emplacement et l’émergence temporelle, et utilisés pour d’autres caractérisations ou expérimentations. L’étude de ces cellules trophoblastiques tôt peut être instrumentale dans la compréhension de l’implantation humaine, le traitement des pathologies placentaires communes, et l’atténuation de l’incidence de la perte de grossesse.

Les embryons sains ont fait l’présentant une prolifération continue au cours de la culture étendue (Figure 2B). Les embryons anormaux ont commencé à se rétracter de leurs bords extérieurs et à se désintégrer (figure 2C). D’après notre expérience, environ 75% des embryons ont été attachés au fond du plat enduit de fibronectine à 48 h et l’attachement a augmenté à environ 90% par 72 h en culture. Le succès de l’attachement à l’embryon peut être largement affecté p...

Ici, nous décrivons une méthode pour réchauffer les blastocystes humains vitrifiés, les cultiver à travers la période d’implantation in vitro, les digérer en cellules individuelles et recueillir les cellules trophoblastiques précoces pour une étude plus approfondie.

Collection à cellule unique de cellules trophoblastiques dans les embryons humains de stade de péri-implantation

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Beaucoup de grossesses échouent tôt dans le développement humain d’embryon autour des sept ou huit post-fertilisation. Ce protocole offre aux chercheurs la possibilité de cultiver des concepteurs humains in vitro au cours de cette mystérieuse fenêtre d’implantation. Cela nous permet de comprendre les mécanismes qui sous-tendent le succès de l’implantation humaine et de la formation placentaire précoce.L’utilisation d’un système de culture étendu pour cultiver des embryons humains à stade périimplantatoire in vitro est probablement le seul moyen d’obtenir des matériaux authentiques pour étudier l’implantation et la différenciation précoce du trophoblaste. Cette technique simple est un outil puissant qui nous permet de répondre à de nombreuses questions fondamentales sur le développement précoce de l’homme. Les recherches menées avec l’utilisation de ce protocole contribueront largement à la compréhension de la perte précoce de grossesse, de l’échec récurrent d’implantation et des pathologies de placenta.Deirdre Logsdon, doctorante d’un laboratoire, démontrera la procédure. Un jour avant le réchauffement de l’embryon, préparez des supports et des plaques de récupération dans une hotte stérile à écoulement laminaire. Remplissez deux plats de lavage de culture d’organe de puits de centre avec 500 microlitres de BM avec 10%SPS, puis couvrez le BM avec 500 microlitres d’huile de qualité de culture d’embryon.Dans un plat de culture tissulaire de 16 millimètres, superposer huit millilitres d’huile de culture embryonnaire et ancrer 20 gouttes de BM de microlitre avec 10% de SPS au fond. Equilibrer la vaisselle et l’assiette de récupération dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 6 % de dioxyde de carbone et 5 % d’oxygène pendant au moins quatre heures. Aliquot environ quatre millilitres d’IVC 1 dans un tube de bouchon instantané de cinq millilitres et préparer un plat de lavage avec 500 microlitres d’IVC 1 sans superposition d’huile.Equilibrer le plat et le tube dans l’incubateur pendant au moins quatre heures. Diluer la fibronectine du sérum humain dans PBS à 30 microgrammes par millilitre. Ouvrez les huit paquets de coverslip bien chambés en prenant soin de ne pas toucher les puits, puis pipette doucement 250 microlitres de la fibronectine dans chaque puits.Remplacez le couvercle sur le coverslip et incubez-le à quatre degrés Celsius pendant 20 à 24 heures. Préparer la plaque de culture prolongée le matin du réchauffement de l’embryon. Récupérer le bordereau de couverture chambé avec de la fibronectine et le placer dans le capot d’écoulement laminaire.Retirez ensuite le mélange de fibronectine avec une pipette d’un millilitre et jetez-le. Pipette 300 microlitres de l’IVC 1 équilibré dans chaque puits et placer le coverslip dans l’incubateur jusqu’à l’enlèvement de la zona pellucida. Après le réchauffement et la récupération des embryons humains D5, évaluez-les pour leur ré-expansion et prenez des photos de chaque embryon.Déplacez chaque embryon à 500 microlitres d’un milieu de manipulation tamponné MOPS avec 5% de FCS. Ensuite, traitez-le avec la solution acide de Tyrode tel que décrit dans le manuscrit du texte. Déplacez immédiatement l’embryon avec la zona dissolvante en 300 microlitres de milieu tamponné MOPS réchauffé pour étancher la solution du Tyrode.Déplacez ensuite l’embryon dans un plat central de tissu d’organe de puits contenant le BM équilibré avec 10%SPS sous l’huile de qualité de culture d’embryon. Ensuite, retournez l’embryon à la goutte de récupération de 20 microlitres. Déplacez individuellement les embryons vers le plat de lavage avec le média IVC 1 équilibré, puis déplacez soigneusement chaque embryon vers un puits de la couverture chambrée, en vous assurant de garder une trace de l’identification de l’embryon.Retournez le coverslip chambé dans un incubateur fixé à 37 degrés Celsius, 6% de dioxyde de carbone et d’oxygène atmosphérique pendant deux jours. Au deuxième jour de croissance, examinez attentivement l’attachement des embryons au microscope et échangez les médias. Sachez quel embryon est attaché au plat en tapant doucement sur l’assiette.Pour changer le média, retirez le couvercle et aspirez soigneusement 150 microlitres d’IVC 1, en prenant soin de ne pas déranger l’embryon attaché. Si un embryon n’est pas encore attaché à la plaque, n’échangez pas les supports parce que le sérum dans IVC 1 aidera à l’attachement. Lentement pipette 150 microlitres de médias de culture étendue équilibrés, IVC 2 dans chaque puits et remplacer le couvercle sur le coverslip.Soigneusement retourné le coverslip chambé à l’incubateur. Répétez l’échange de médias et la vérification de pièce jointe tous les jours jusqu’à ce que les embryons soient prêts pour la fixation ou la digestion unicellulaire. Si la collecte des supports usés est nécessaire pour une analyse plus approfondie, casser le gel des 150 microlitres d’IVC 1 enlevé dans un tube stérile à faible liaison de 0,5 millilitre.Lavez chaque embryon une fois avec 200 microlitres de PBS, puis ajoutez 200 microlitres de solution de trypsine à chaque puits. Remettre le coverslip chambé à l’incubateur pendant cinq minutes. Utilisez une petite pipette ou une pipette buccale finement tirée pour ramasser un VTT individuel, puis utilisez une pipette plus grande pour dissocier doucement l’embryon en aspirant de haut en bas.Continuer à aspirer l’embryon doucement et à plusieurs reprises à l’aide d’une pointe de pipette de plus petit diamètre jusqu’à ce que l’embryon ait été incubé pendant un total de 10 minutes dans la trypsine. Pour effectuer la sélection d’une seule cellule, déplacez les cellules dissociées à travers 320 gouttes de lavage de microlitres de PBS et 0,1% PVP sous huile de culture embryonnaire, en prenant soin de ne pas perdre de cellules. Après le lavage, les cellules utilisent une pipette en verre finement tirée pour sélectionner une cellule.Pipette soigneusement la cellule unique dans un tube stérile de liaison basse de 0,2 millilitre avec un volume minimal de PBS et PVP. Prenez des cellules individuelles libres dans de l’azote liquide et conservez-les à 80 degrés Celsius négatifs pour une utilisation plus rapide. Les embryons en bonne santé ont montré la prolifération continue au cours de la culture étendue, alors que les embryons anormaux ont commencé à se rétracter de leurs bords externes et à se désintégrer.Au huitième jour de fécondation post, la plupart des cellules dans les embryons étaient cytotrophoblaste ou CTBs, qui étaient positifs pour le marqueur trophoblaste GATA-3. À la périphérie de l’embryon, les CTBs se différeciaient déjà en syncytiotrophoblastes multinucléés, qui avaient une feuille comme l’apparence et taché positif pour les humains CGB. Au jour 10, la formation des cellules migratrices positives de trophoblaste de CGB était à un maximum, qui a été confirmé par la hausse de la production de HCG à ce moment.Les trophoblastes migrateurs qui ont taché positif pour HLA-G, ont également commencé à émerger et migrer loin du corps embryonnaire. Au jour 12, la différenciation stb était en déclin et la production de VTT est devenue plus importante, suggérant un changement d’accent de la production d’hormones le jour 10 à la migration cellulaire le jour 12. Ces changements peuvent être observés dans une vidéo time lapse de la période périimplantatoire.La vidéo montre l’effondrement du blastocèle, la formation du STB, et la différenciation et la migration éventuelles du VTT. La chose la plus importante à garder à l’esprit lorsque vous terminez cette procédure est que vous travaillez avec des embryons vivants qui sont sensibles aux changements de température, d’osmolalité et de pH. Il est essentiel de réduire au minimum le temps que les plats sont sortis de l’incubateur pour maintenir la santé de l’embryon.Après avoir terminé cette procédure, les investigateurs peuvent employer les cellules simples isolées pour des analyses d’omics simples en aval de cellules, telles que le séquençage d’ARN simple de cellule et le séquençage de bisulfite de génome entier pour mieux comprendre des changements épigénétiques et transcriptomiques pendant l’implantation humaine et la formation tôt de placenta.

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JoVE Journal

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Biologie

Dans cette vidéo, nous démontrons l'isolement des blastocystes de souris et de la dérivation de cellules souches trophoblastiques à partir de blastocystes. Nous décrivons également les conditions d'entretien de la propriété de cellules souches ainsi que l'induction de la différenciation en culture.

Dérivation de cellules souches de la souris Trophoblast à partir de blastocystes

Dans ce protocole, nous décrivons la dissection du placenta de la souris sur la grossesse D10.5, suivie de l'isolement des cellules trophoblastiques en utilisant un gradient de Percoll. Nous avons ensuite démontrer l'utilisation des cellules isolées dans un essai invasion matrigel.

Isolement des cellules trophoblastiques primaires de souris et le test invasion trophoblastique

Ce protocole décrit un procédé pour transfecter efficacement ARNsi dans les cytotrophoblastes villeux humaines fraîchement isolées en utilisant la microporation et l'identification des complexes ADN-protéine dans ces cellules. Les cellules transfectées peuvent être contrôlées par Western Blot et des analyses EMSA pendant la période de culture de 4 jours.

siRNA Transfection et EMSA Analyses sur fraîchement isolés villosités cytotrophoblastes humaines

Ici, nous présentons un protocole pour la conversion directe de fibroblastes embryonnaires murins en cellules souches trophoblastiques pleinement fonctionnelles et stables par surexpression de dix jours de Tfap2c, Gata3, Eomes et Ets2.

Protocole pour la conversion directe des fibroblastes embryonnaires murins en trophoblaste cellules souches

Les cellules géantes trophoblastiques (TGC) jouent un rôle clé dans le placenta pour assurer une grossesse en bonne santé. Nous présentons un protocole d’évaluation de l’état transcriptionnel des gènes dans les TGC par hybridation in situ fluorescente naissante sur des coupes cryostat d’embryons post-implantatoires ou des cultures à court terme de cônes ectoplacentaires embryonnaires du jour 7.

Transcriptionnelle Analyse par Naissant ARN FISH<em&gt; In Vivo</em&gt; Cellules Trophoblast géants ou<em&gt; In vitro</em&gt; Cultures à court terme de ectoplacentaire Cône explants

Ici, nous présentons un protocole pour générer efficacement des cellules trophoblastiques humaines à partir de cellules souches pluripotentes humaines en utilisant la protéine morphogénique osseuse 4 et des inhibiteurs des voies Activin/Nodal. Cette méthode est adaptée à la différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines et peut générer de grandes quantités de cellules pour la manipulation génétique.

In Vitro Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques

Présenté ici est un protocole d’échantillonnage de tissus humains de villosités placentaires suivie d’isolement de cytotrophoblastes pour culture de cellules primaires. Traitement des trophoblastes avec TNFα récapitule l’inflammation dans l’environnement intra-utérin obèse et facilite la découverte de cibles moléculaires réglée par l’inflammation dans les placentas avec l’obésité maternelle.

Un modèle trophoblastiques humaines primaires pour étudier l’effet de l’Inflammation associées à l’obésité maternelle sur la réglementation de l’autophagie dans le Placenta

Ce protocole présente une méthode pour l’isolement de cellules primaires de decidual humains prélevés dans les membranes foetales du placenta à terme qui peut être utilisé pour une variété d’applications (c'est-à-dire l’immunocytochimie, cytométrie en flux, etc.) visant pour étudier le rôle des différentes populations cellulaires dans les complications de la grossesse.

Isolement de cellules primaires de Decidual humaines des Membranes fœtales des placentas à terme

Nous présentons ici un protocole très accessible pour évaluer le mouvement cellulaire dans les cellules Trophoblastiques humaines à l’aide de trois essais in vitro : le test de gratter, le dosage d’invasion de transwell et le test de prolifération cellulaire.

Tests in Vitro pour évaluer la Migration, Invasion et la prolifération de lignées cellulaires immortalisées humaine au premier trimestre trophoblaste

Le protocole actuel permet de récupérer des structures tubulaires formées dans l’essai classique d’angiogenèse-formation de tubes in vitro où les cellules, telles que les cellules trophoblastiques, s’organisent en structures capillaires sur une couche de matrice de membrane basale extracellulaire. Les structures récupérées sont utilisées pour l’isolement de l’ARN et des protéines pour diverses analyses biochimiques.

Récupération de cellules trophoblastiques à partir d’un test de formation de tube d’angiogenèse pour l’analyse de l’expression des marqueurs de différenciation

Ce protocole permet la purification, la caractérisation et la culture des trophoblastes extravilleux primaires HLA-G+ (EVT) à partir de la base de la déduite basale et de la membrane chorionique des placentas humains à terme. Les cultures primaires d’EVT maintiennent leur viabilité pendant 96 heures, permettant la coculture avec des cellules immunitaires maternelles correspondantes à l’échantillon et l’analyse cytométrique et moléculaire de leurs interactions en flux subséquente.

Purification des trophoblastes extravilleux HLA-G+ à partir de tissus placentaires humains pour le phénotypage et l’analyse fonctionnelle

Apprenez à isoler des cellules trophoblastiques uniques à partir d'embryons humains de stade péri-implantation. Cette méthode permet d'étudier la différenciation trophoblastique et les mécanismes de l'implantation in vitro.

Collection à cellule unique de cellules trophoblastiques dans les embryons humains de stade de péri-implantation

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