Interférence de l’ARN dans les coléoptères aquatiques comme un outil puissant pour manipuler l’expression des gènes à des points de temps de développement spécifiques

Alors même que l’édition génétique est devenue populaire pour l’étude de la génétique moléculaire des organismes non modèles, l’ARNi demeure un puissant outil synergique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être appliquée à différents stades de développement. En outre, knockdown partiel peut être utilisé pour étudier ces gènes entiers.

Le succès de la procédure repose sur l’injection de DSR et ayant un préjudice minimal. Cela demande de la pratique, alors ne vous découragez pas s’il faut quelques tentatives pour bien faire les choses. Pour préparer les embryons à un stade précoce à la micro-injection, versez d’abord l’agarose bouillante de 20 % dans une petite boîte de Pétri et placez trois tubes en plastique de un à deux millimètres de large sur la surface de l’agarose liquide avant qu’il ne se solidifie.

Une fois que l’agarose a solidifié utiliser une paire de forceps émoussés pour enlever les tubes et couvrir les indentations résultantes avec 500 microlitres d’eau distillée autoclave. Lorsque le récipient de collecte est prêt à utiliser un pinceau de cheveux naturels fins pour transférer cinq embryons de T.marmoratus vieux de huit heures des sites de nidification de coléoptères dans un plat de cavité en verre rempli d’eau distillée autoclave sous un microscope stéréo. À l’aide du microscope et de la dissection fine, les forceps saisissent la chorion de chaque embryon des deux côtés et déchirent le chorion ouvert, ce qui permet à l’embryon de glisser doucement hors du tissu.

Après avoir enlevé les deux couches de chorion de tous les embryons recueillis, utilisez le pinceau pour transférer soigneusement les embryons du plat de cavité de verre dans les rainures de la plaque d’agarose préparée. Pour injecter des embryons à un stade précoce avec de l’ARN double brin spécifique au gène, préparez d’abord des aiguilles de microinjection sur un carillon d’aiguille et utilisez le microscope stéréo et trouvez des forceps pour briser chaque pointe à un bord tranchant. Après avoir jeté l’ARN purifié à double brin d’intérêt sur la glace, ajouter un microlitre de tampon d’injection 10X à la solution résultante et utiliser de l’eau distillée double pour porter le volume de vinyle de la solution à 10 microlitres.

Utilisez une pipette P10 pour remblayer l’une des aiguilles de microinjection préparées avec la solution d’ARN double brin de travail et charger l’aiguille dans un support de micronèdre relié à un système de microinjection qui utilise la technologie d’éjection de pression. Allumez le système de microinjection et l’alimentation en air pressurisée et utilisez la micro valve sur le système de microinjection pour régler la pression d’injection à 15 livres de pression par pouce carré, puis utilisez le bouton de réglage du temps pour régler la durée d’injection en secondes. Pour calibrer l’aiguille d’injection évaluer le volume de la bulle de fluide qui se forme à l’extrémité de l’aiguille lors de l’injection dans l’air pour l’embryon T.marmoratus utiliser une taille optimale de bulle de 100 à 200 microns.

L’aiguille d’injection est de bonne qualité si des bulles optimales peuvent être réalisées à 15 livres de pression par pouce carré avec une durée d’injection d’environ trois secondes. Lorsque l’aiguille mise en place est prête aligner l’aiguille sur la plaque d’agarose des embryons de sorte que l’aiguille s’approche des embryons à un angle de 45 à 60 degrés. Utilisez le micro manipulateur pour déplacer lentement le microneedle jusqu’à ce que la pointe touche la surface du milieu d’un embryon, puis déplacez soigneusement l’aiguille vers l’avant jusqu’à ce qu’elle perce juste la surface de l’embryon.

Une fois que l’aiguille est à l’intérieur de l’embryon, appuyez soigneusement sur le bouton d’injection du micro injecteur pour livrer un à deux nanolitres d’ARN double brin dans l’embryon. Lorsque tout l’ARN a été livré, rétractez lentement l’aiguille de l’embryon sans provoquer la rupture de l’embryon. Les embryons injectés avec succès peuvent être identifiés par la présence d’une tache colorée au site d’injection.

Lorsque tous les embryons ont été injectés soigneusement placer le plat dans une chambre d’humidité dans un incubateur de 25 degrés Celsius mis à une lumière de 14 heures 10 heures cycle sombre pendant quatre à cinq jours. Surveillez les progrès du développement de l’embryon quotidiennement au microscope stéréo afin d’identifier les phénotypes knockdown morphologiquement visibles. Utilisation d’un appareil photo numérique haute résolution pour documenter le processus de développement.

Enlever les embryons morts et reconstituer l’eau sur la plaque d’agarose tous les jours pour éviter la dessiccation et la propagation de la contamination microbienne à d’autres embryons survivants pendant la période d’incubation. Avant de recueillir la larve d’abord ajouter 60 à 70 degrés Celsius 2%liquide agarose à une petite boîte de Pétri. Lorsque l’agarose a solidifié utiliser des forceps émoussés pour faire un groupe peu profond par larve à injecter dans l’agarose et drainer doucement l’eau des tasses de culture de larves.

Après anesthésie utiliser des forceps fin doux pour placer soigneusement la larve sur la plaque d’immobilisation avec les cous et les corps dans les rainures, mais la queue située au-dessus de la surface agarose. Lorsque toute la larve a été placée, couvrir chaque lave d’une épaisse couche d’agarose qui est encore liquide, mais pas dangereusement chaud et libérer tous les contes qui ont été accidentellement couverts si nécessaire. pour une double charge de microinjection d’ARN échouée un microneedle avec la solution de travail spécifique de double ARN échoué spécifique de gène d’intérêt comme démontré.

Redrag le piston d’une seringue à microinjection contrôlée manuellement et charger l’aiguille sur le système de microinjection. Placez la larve immobilisée sous le microscope stéréo de telle sorte que le site d’injection soit aligné avec la trajectoire de l’aiguille de microinjection à un angle relativement plat. Utilisez le micro manipulateur pour déplacer soigneusement la pointe de l’aiguille dans la larve et appliquer lentement et soigneusement la pression sur la seringue, en ajustant la pression d’injection en fonction du mouvement du fluide d’injection coloré dans l’aiguille si nécessaire.

Lorsque tout l’ARN a été injecté utiliser des forceps souples pour libérer la larve de l’agarose et placer la larve dans un nouveau récipient d’eau à température ambiante à 25 à 28 degrés Celsius et une lumière de 14 heures 10 heures cycle sombre. Dans cette analyse représentative, trois gènes différents ont été renversés à divers stades de développement du coléoptère plongeur T.marmoratus. L’interférence d’ARN est exécutée comme démontré en injectant l’ARN double-échoué à un stade très tôt de l’embryogenèse.

Certains embryons ne survivent pas au processus et deviennent nécrotiques. Dans ces images, ils contrôlent l’individu et un individu avec une couleur légèrement plus claire des yeux peut être observé. Chez cet individu, un renversement plus grave dans lequel les mensonges plus ventrals de l’amas sont complètement non pigmentés, mais les alliés ne montrent encore une certaine pigmentation peut être observée.

Ici, un exemple d’un autre individu avec la perte de pigment essentiellement complète dans tous les yeux est montré. Lac2 renversé dans les larves se traduit par une cuticule moins pigmentée, des individus adultes plus légers avec des ailes quelque peu déformées probablement en raison de la douceur inhabituelle du tissu ont également été obtenus. Assurez-vous de regarder attentivement pour observer de près vos animaux injectés sur une base quotidienne et d’enlever immédiatement tous les individus morts.

La puissance de cette technique est qu’elle peut être appliquée aux gènes de nombreux organismes différents. Cette technique a également été largement et avec succès appliquée à la biologie évolutionnaire du développement.