Quantification spontanée Ca²⁺ Fluxes et leurs effets en aval dans les neurones midbrains de souris primaires

Ce protocole quantifie les flux calciques dans les neurones dopaminergiques, qui sont perdus dans la maladie de Parkinson. Ceci est utile pour comprendre comment le calcium anormal provoque la perte de neurones dopaminergiques dans la maladie de Parkinson. Pour la première fois, nous démontrons des flux spontanés de calcium dans les neurones primaires cultivés de midbrain.

Cette méthode peut être utilisée pour disséquer des contributions spécifiques aux récepteurs impliquées dans l’apoptose à 100 000 °C. Notre méthode offre un moyen pour les écrans de médicaments à haute teneur de découvrir des composés neuroprotecteurs spécifiques et efficaces pour la maladie de Parkinson. Ces composés neuroprotecteurs empêcheraient l’apoptose calcium- médiatisée dans le neurone dopaminergique.

Commencez par préparer un millilitre de milieu DMEM sans sérum avec un microlitre d’AAV hSyn-GCaMP6f par plat. Aspirez le milieu de culture cellulaire de chaque plat et remplacez-le par un millilitre du DMEM préparé par hSyn-GCaMP6f. Remettre les plats dans l’incubateur de 37 degrés Celsius pendant une heure.

Après l’incubation, aspirer le milieu avec des AAV et le remplacer par trois millilitres de milieu de culture cellulaire. Incuber les plats à 37 degrés Celsius pendant cinq à sept jours. Changer le milieu tous les deux à trois jours tout au long de cette période d’infection virale.

Préparez un litre du tampon d’enregistrement HEPES, 200 millilitres de tampon d’enregistrement de glutamate de 20 micromolaires et 200 millilitres de tampon d’enregistrement NBQX de 10 micromolaires selon les instructions manuscrites. Remplissez une boîte de Pétri stérile de 35 millimètres de trois millilitres du tampon d’enregistrement. Prenez la boîte de Pétri avec les cultures infectées de l’incubateur, puis prenez soigneusement le bord d’un glissement de couverture avec des forceps fine pointe et le transférer dans le plat avec le tampon d’enregistrement.

Placez le reste du couvercle dans le milieu de retour dans l’incubateur de 37 degrés Celsius et transportez le plat avec tampon d’enregistrement au microscope confocal. Démarrez le logiciel d’imagerie. Pendant qu’il est para para paralysant, démarrez la pompe périssaliste et placez la ligne dans le tampon d’enregistrement.

Ensuite, calibrez le débit à deux millilitres par minute. Transférer le bordereau de couverture infecté de la boîte de Pétri au bain d’enregistrement avec des forceps fins. En utilisant l’objectif d’immersion d’eau 10X et la lumière brightfield, trouver le plan de mise au point et chercher une région avec une forte densité de corps cellulaires neuronaux, puis passer à l’objectif 40X et recentrer l’échantillon.

Sélectionnez et appliquez AlexaFluor 488 dans la fenêtre liste des Dyes. Afin d’éviter la surexposition et le blanchiment photo des fluorophores, commencez par les réglages de faible puissance du VH et du laser. Pour le canal AlexaFluor 488, réglez le HV à 500, le gain à 1x, et le décalage à zéro.

Réglez la puissance à 5% pour la ligne laser 488. Augmentez la taille du sténopé à 300 micromètres et utilisez l’option de balayage focus x2 pour ajuster de manière optimale les signaux d’émission aux niveaux de sous-saturés. Les paramètres peuvent ensuite être ajustés pour une visibilité optimale de chaque canal.

Une fois que les paramètres du microscope sont optimisés, déplacez la scène pour localiser une région avec plusieurs cellules affichant des changements spontanés dans la fluorescence GCaMP6f et concentrez-vous sur le plan désiré pour l’imagerie. Utilisez l’outil Clip rect pour couper le cadre d’imagerie à une taille qui peut atteindre un intervalle d’image d’un peu moins d’une seconde. Réglez la fenêtre d’intervalle à une valeur de 1,0 et la fenêtre Num à 600.

Pour capturer un film de série T, sélectionnez l’option Temps, puis utilisez l’option de numérisation Xyt pour commencer l’imagerie. Surveillez la barre de progression de l’imagerie et déplacez la ligne du tampon d’enregistrement HEPES dans le tampon d’enregistrement de glutamate de 20 micromolaires au moment opportun. Lorsque l’imagerie est terminée, sélectionnez le bouton de la série faite et enregistrez le film fini de la série T.

Continuez à parcourir le glutamate pendant cinq minutes supplémentaires afin que la culture des neurones ait été exposée au glutamate pendant un total de 10 minutes. Répétez ce processus pour que chaque feuillet de couverture soit image. Il est possible de visualiser les traces de calcium et les corps neuronaux des cellules immédiatement après l’expérience.

Utilisez l’outil Ellipse pour dessiner le nombre désiré d’IA autour du soma neuronal. Et utilisez le bouton Analyse de série pour visualiser les traces. Après l’exposition supplémentaire de cinq minutes au glutamate, retirez le glissement du couvercle du bain avec des forceps fins et placez-le de nouveau dans la boîte de Pétri avec le tampon d’enregistrement jusqu’à ce que toute l’imagerie soit terminée.

Le jour de l’imagerie, les cultures vm ont été traitées avec du glutamate ou une combinaison de glutamate et de NBQX. Dans les deux conditions, des changements hétérogènes et spontanés dans la florescence de GCaMP6f ont été observés indiquant des flux spontanés de calcium. L’application du glutamate a généré une réponse robuste et soutenue de calcium dans les neurones spontanément actifs et quiescents.

L’application de NBQX a réduit l’activité spontanée, et a partiellement bloqué la réponse de glutamate. La mesure dans laquelle l’application de glutamate a stimulé une réponse de calcium dans chaque condition a été quantifiée utilisant la zone sous la courbe, l’amplitude maximale, et la latence pour répondre. La latence à la réponse a augmenté sous l’état de NBQX et de glutamate.

Pour mesurer l’apoptose glutamate- médiatisée, les cellules ont été fixées et tachées avec un anticorps anti-Caspase-3. L’intensité moyenne de caspase-3 était sensiblement plus élevée dans les deux conditions de traitement comparées aux contrôles non traités. Une analyse plus approfondie de la mort toxique excitée de cellules peut être faite en comptant le nombre de neurones dopaminergiques positifs d’hydroxylase d’immunostain tyrosine dans l’état traité de contrôle et de glutamate.

Cette technique a ouvert la voie à la compréhension des contributions relatives des différents récepteurs et canaux de fer impliqués dans l’apoptose à base de calcium dans le neurone dopaminergique.