Name: Modèle de rétinopathie induite par l’oxygène pour les maladies rétiniennes ischémiques chez les rongeurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Découvrez le modèle de rétinopathie induite par l'oxygène pour étudier les maladies rétiniennes ischémiques chez les rongeurs. Cette méthode permet d'évaluer des candidats thérapeutiques antiangiogéniques.

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Nous remercions Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen et Anne Kankkunen pour leur excellent soutien technique. Ces travaux ont été financés par l’Académie de Finlande, la Fondation Päivikki et Sakari Sohlberg, la Tampere Tuberculosis Foundation, la Fondation médicale finlandaise, la Pirkanmaa Hospital District Research Foundation et le Tampere University Hospital Research Fund.

Le protocole décrit ici a été approuvé par le Comité national d’éthique animale de Finlande (numéro de protocole ESAVI/9520/2020 et ESAVI/6421/04.10.07/2017).
1. Induction expérimentale de modèle d’OIR d’animaux et de souris
REMARQUE : Utilisez des animaux aciérés dans le temps, par exemple des souris C57BL/6J couramment utilisées, pour faire naître des petits le même jour. Utiliser des barrages d’accueil, p. ex., 129 souches (129S1/SvImJ ou 129S3/SvIM) pour allaiter les chiots pendant et après l’induction de l’hyperoxie. Sinon, assurez-vous qu’il y a des barrages de lactating supplémentaires disponibles au cas où les barrages de soins infirmiers doivent être remplacés en raison de l’épuisement. Limitez la taille de la portée à 6-7 petits pour chaque barrage lors de l’utilisation de souris/mères C57BL/6J (si les portées sont plus grandes que cela, les chiots ont tendance à avoir un gain de poids limité)16.
<ol><li>Enregistrez le poids des animaux avant et après l’induction de l’hyperoxie, et au moment du sacrifice.</li>
	<li>Assurez-vous qu’il y a suffisamment de nourriture au fond de la cage, de sorte que les barrages ont un accès facile à la nourriture.</li>
	<li>Ajouter de la chaux gazeuse avec un indicateur de couleur au fond de la chambre pour absorber l’excès de CO2 lorsqu’un système de filtration n’est pas utilisé.</li>
	<li>Surveillez l’humidité et la température à l’intérieur de la chambre et maintenez l’humidité entre 40 et 65 %. Augmenter l’humidité de la chambre, si nécessaire, en plaçant des plats avec de l’eau au fond de la chambre (p. ex., boîtes de Pétri).</li>
	<li>Calibrer le capteur O2 avec 100% O2 et l’air normal de la pièce.</li>
	<li>Placez les souris P7 dans une chambre et installez le niveau O2 à 75%. Gardez les souris dans la chambre pendant 5 jours, jusqu’à P12. Évitez d’ouvrir la chambre pendant l’induction de l’hyperoxie. Vérifiez la pression de gaz du cylindre O2 et remplacez le cylindre en cas de besoin. Surveillez les animaux pendant l’induction.</li>
	<li>Sortez les cages de souris de la chambre et pesez tous les chiots. Regroupez les chiots en fonction du poids de sorte que chaque groupe expérimental ait une répartition du poids similaire chez les chiots.</li>
</ol>2. Induction expérimentale de modèle d’animaux et de rat OIR (utilisant le système semi-fermé)
REMARQUE : Utilisez des animaux à osser dans le temps pour faire naître les petits le même jour. Pour rat OIR, utiliser une taille de litière accrue, environ 18 petits/barrage, pour obtenir une induction suffisante de NV dans le modèle de rat. Piscine chiots de plusieurs portées pour obtenir suffisamment de chiots à chaque portée.
<ol><li>Enregistrez le poids des animaux avant et après l’induction, et au moment du sacrifice.</li>
	<li>Assurez-vous qu’il y a suffisamment de nourriture au fond de la cage, de sorte que les barrages ont un accès facile à la nourriture.</li>
	<li>Ajouter de la chaux gazeuse avec un indicateur de couleur au fond de la chambre pour absorber l’excès de CO2 lorsque le système de filtration n’est pas utilisé.</li>
	<li>Surveillez l’humidité et la température à l’intérieur de la chambre. Absorber l’humidité supplémentaire (générée par plusieurs nombres de rats) en ajoutant du gel de silice sur le fond de la chambre.</li>
	<li>Calibrer le capteur O2 avec 100% N2 et l’air normal de la pièce.</li>
	<li>Placez les rats dans la chambre à P0 (quelques heures après la naissance). Réglez le niveau O2 à 50% et connectez le cylindre O2 à la chambre pendant 24 h. Après cela, passer les paramètres à 10% O2 et connecter l’azote (N2) cylindre à la chambre pendant 24 h. Continuer le cycle de 24 h entre 50% et 10% O2 niveaux pendant 14 jours.</li>
	<li>Surveiller la consommation de gaz et le bien-être des animaux pendant l’étude. Ouvrez la chambre pendant le changement entre 50/10% O2 et ajoutez plus de nourriture et d’eau si nécessaire. Changer les cages des animaux pour les nettoyer pendant l’induction.</li>
	<li>Sortez les cages à rats de la chambre et pesez tous les chiots. Regroupez les chiots en fonction du poids de sorte que chaque groupe expérimental ait une distribution de peser similaire chez les chiots.</li>
</ol>3. Administration de médicaments (facultatif)
REMARQUE : La voie couramment utilisée d’administration de drogue dans OIR est par traitement intravitreal (ivt), à P12-P14 pour des souris et à P14 pour des rats. Déterminez le jour du traitement en fonction de la configuration expérimentale. Lorsque plusieurs portées de petits sont utilisées dans des expériences, divisez les groupes de traitement pour avoir des animaux de toutes les portées. De préférence, injectez la drogue à un seul œil, et gardez l’œil contralatéral comme un contrôle.
<ol><li>Pesez les animaux et faites des marques d’identification à la queue et/ou à l’oreille.</li>
	<li>Anesthésier l’animal soit par anesthésie injectable (par exemple mélange de kétamine et de médetomidine, 30 mg/kg et 0,4 mg/kg pour les souris) soit par anesthésie par inhalation (isoflurane à 2-3,5% isoflurane et 200-350 mL/min de débit d’air). Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant les ateils. Gardez l’animal sur un coussin chauffant pendant le traitement.</li>
	<li>Pour l’anesthésie locale, appliquer une goutte d’analgésique sur la paupière. Ouvrez soigneusement la paupière avec des forceps avant d’effectuer l’ivt, comme les souris et les rats ouvrent les yeux autour de P14. Appliquer une goutte d’analgésique (p. ex., hydrochlorure d’oxybuprocaine) sur la cornée.</li>
	<li>Appliquer une goutte d’iode avant d’effectuer l’injection d’ivt.</li>
	<li>Pour l’injection ivt utiliser une seringue en verre avec une aiguille de 33-34 G attaché. Appuyez sur les paupières vers le bas et grap le globe oculaire avec des pinces. Faire l’injection postérieure aux limbes, environ dans l’aiguille d’angle de 45° pointant vers le nerf optique.</li>
	<li>Évitez d’injecter plus de 1,0 μL dans l’espace intravitreal. Gardez l’aiguille en place pendant 30 s après l’injection du médicament pour éviter le reflux de la solution injectée.</li>
	<li>Examiner l’œil (p. ex., à l’aide d’un ophtalmoscope) pour toute complication, comme des hémorragies ou des lésions rétiniennes, après avoir enlevé l’aiguille. Appliquer de l’onguent antibiotique sur la cornée après l’injection. REMARQUE : Le volume d’injection d’ivt pour les souris devrait être de 0,5 à 1,0 μL.</li>
	<li>Inverser l’anesthésie (par exemple avec un antagoniste α2 pour la médetomidine (2,5 mg/kg) et retourner le chiot dans la cage. Abritez la litière normalement jusqu’à la fin de l’étude.</li>
</ol>4. Imagerie in vivo et électrorétographie (facultatif)
<ol><li>Si désiré, effectuer une imagerie in vivo sur des animaux vivants pendant la période de suivi pour enregistrer les changements qui se développent dans la rétine pendant les réponses angiogéniques. Par exemple, effectuez une angiographie de fluorescéine (FA) ou une microscopie confoccale laserà balayage 19 pour visualiser la vascularisation (Figure 4). Utiliser la tomographie par cohérence optique du domaine spectral (SD-OCT) pour visualiser les couches rétiniennes in vivo (Figure 4).</li>
	<li>Si désiré, étudier les changements fonctionnels dans différentes populations de cellules rétiniennes après l’induction de l’OIR en utilisant l’électrorétinographie (ERG) (Figure 5).</li>
</ol>5. Collecte de tissus et préparation de montures plates rétiniennes
REMARQUE : Recueillir les tissus selon l’hypothèse de recherche souhaitée. Pour les souris, recueillir les échantillons par exemple à P12 (pour étudier la vaso-oblitération après la phase hyperoxique) ou à la période hypoxique (P13-P17). Recueillir les échantillons de souris OIR à P17, qui est le point de temps le plus commun pour l’échantillonnage, pour détecter le pic en quantité de NV. Dans rat OIR, recueillir les échantillons à P18-P21 pour observer la plus grande quantité de NV (Figure 3).
<ol><li>Pesez les animaux avant l’échantillonnage.</li>
	<li>Pour étiqueter la vascularisation rétinienne, les animaux profondément anesthésiés peuvent être transcardiés perfusés avec fitc-dextran. (Alternativement, tacher les montures plates rétiniennes avec isolectine plus tard).</li>
	<li>Sacrifier les animaux en utilisant soit une surdose de médicaments d’anesthésie (par exemple mélange de kétamine et de médetomidine, 300 mg/kg et 4 mg/kg pour les souris) ou l’inhalation de CO2.</li>
	<li>Recueillir les yeux des animaux en saisissant derrière le globe oculaire avec des forceps incurvés, couper le tissu autour des yeux et soulever l’œil hors de l’orbite.</li>
	<li>Incuber les globes oculaires dans du paraformaldéhyde fraîchement fait filtré et filtré (en solution saline tamponnée de phosphate, PBS) pendant 1-4 h. Retirer le fixatif et laver les globes oculaires 3 x 10 min avec PBS. Disséquer immédiatement les rétines ou les conserver en PBS à +4 °C. AVERTISSEMENT : Le paraformaldéhyde est toxique par inhalation, en contact avec la peau et s’il est avalé. Veuillez lire la fiche de données de sécurité avant de travailler avec elle. REMARQUE : N’appliquez pas de pression sur le globe oculaire pendant l’échantillonnage ou n’importe quelle phase du traitement des tissus afin d’éviter le décollement de la rétine, si des sections transversales de globes oculaires entiers sont effectuées.</li>
	<li>Préparez des supports plats rétiniens pour quantifier la quantité de NV et la taille des AVA. Alternativement, traiter les globes oculaires / rétines pour l’histologie, ou l’ARN ou l’analyse des protéines. Disséquer la rétine au microscope stéréo à l’aide de micro ciseaux et de forceps.<ol>
<li>Placez le globe oculaire dans PBS pour le garder humide et percer le globe oculaire à limbus avec une aiguille (23G) et couper autour des limbes avec des micro ciseaux incurvés pour enlever l’iris et la cornée.</li>
		<li>Placez soigneusement la pointe des ciseaux entre la sclère et la rétine et coupez la sclère vers le nerf optique. Faites de même de l’autre côté du globe oculaire, et coupez/déchirez soigneusement la sclère jusqu’à ce que la tasse rétinienne soit exposée. Retirez la lentille de la tasse rétinienne et ajoutez PBS à la tasse.</li>
		<li>Enlevez tous les vaisseaux hyaloïdes, vitreux et débris sans endommager la rétine. Lavez la rétine en ajoutant du PBS à la tasse rétinienne. Effectuer quatre incisions (à 12, 3, 6 et 9 heures) à la rétine avec des micro ciseaux droits pour faire une structure en forme de fleur. En option, faire les coupes avec la lame chirurgicale avant de monter les échantillons. Soulevez la rétine à l’aide d’un pinceau doux à une plaque de puits pour la coloration.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Étiquetez la vascularisation rétinienne à l’aide de l’isolectine B4 qui tache la surface des cellules endothéliales (si les animaux n’ont pas été perfusés avec fitc-dextran). Incuber les rétines dans le tampon de blocage (10% NGS + 0,5% Triton dans tbs) pendant 1 h et laver avec 1% NGS + 0,1% Triton dans tbs pendant 10 min. Incuber les rétines avec colorant fluorescent conjugué Isolectine B4 (5-10μg/ml) en 1% NGS + 0,1% Triton dans tbs nuit à +4 °C tout en étant protégé de la lumière. REMARQUE : Si désiré, étiquetez d’autres cellules telles que les cellules inflammatoires et les péricytes à l’aide d’anticorps spécifiques.</li>
	<li>Laver les rétines 3x pendant 10 min avec 1% NGS + 0,1% Triton dans tbs et soulever les rétines sur une lame microscopique, la rétine interne orientée vers le haut. Étendre soigneusement la rétine à l’aide d’un pinceau souple et enlever les vaisseaux hyaloïdes restants ou les débris. Ajouter le milieu de montage à un glissement de couverture et le placer sur le dessus de la rétine. Conservez les rétines à +4 °C et protégez-les de la lumière.</li>
</ol>6. Analyse des montures plates
<ol><li>Prenez des images des montures plates rétiniennes à l’aide d’un microscope à fluorescence avec objectif 10x. Concentrez-vous sur le plexus vasculaire superficiel et sur la néovascularisation préréaculaire. Faites une image de balayage de tuile pour capturer la rétine entière et fusionner les balayages de tuile</li>
	<li>Quantifier les images en mesurant les AVA, la zone de NV et la zone rétinienne totale à l’aide d’un programme de traitement d’image (voir tableau des matériaux).<ol>
<li>Dessinez les AVA et la zone rétinienne totale à l’aide d’un outil de dessin à main libre et sélectionnez les zones néovasculaires à l’aide d’un outil de sélection. Le logiciel mesure les régions d’intérêt pour les pixels, et les zones AVA et NV (exprimées en pixels) peuvent être utilisées pour calculer leur pourcentage par rapport à la zone rétinienne totale. En outre, certains outils logiciels sont disponibles pour quantifier NV. REMARQUE : Récemment, un programme open-source entièrement automatisé pour la quantification des valeurs clés des images OIR à l’aide de réseaux neuronaux d’apprentissage profond a été introduit et fournit un outil fiable pour la quantification reproductible de l’AVA rétinienne et du NV (p. ex., https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si vous utilisez des anticorps pour la détection immunohistochimique des populations cellulaires individuelles, quantifier le nombre de cellules tachées (comme les microglies, figure 2B)à partir des supports plats rétiniens à la main ou par des systèmes automatisés d’analyse d’image si désiré.</li>
</ol>7. Statistiques
<ol><li>Analyser les données normalement distribuées par le test t de l’étudiant ou anova à sens unique suivi du test de comparaisons multiples de Dunnett ou Tukey, le cas échéant. Utilisez des tests non paramétriques comme le test Mann-Whitney U ou le test Kruskal Wallis pour les données non normalement distribuées. Tenir compte des différences statistiquement significatives au niveau P < 0,05.</li>
</ol>

Les auteurs Maria Vähätupa, PhD, Niina Jääskeläinen, Marc Cerrada-Gimenez, PhD, et Rubina Thapa sont des employés d’Experimentica Ltd.
L’auteur Giedrius Kalesnykas, Ph.D., est un employé (président et chef de la direction) et actionnaire d’Experimentica Ltd. qui offre des services de recherche contractuelle utilisant des modèles oir précliniques utilisés dans cet article.
Tero Järvinen, M.D., Ph.D., et Hannele Uusitalo-Järvinen, M.D., Ph.D., n’ont rien à divulguer.

La sévérité du phénotype de la maladie dépend à la fois de la souche et même du fournisseur dans les modèles OIR souris et rat23. Ceci suggère qu’il y ait une grande variabilité génotypique dans le développement pathologique. En général, les rongeurs pigmentés développent un phénotype plus grave que les rongeurs albinos. Par exemple, la vascularisation rétinienne de l’albinos BALB/c se revascularise rapidement après l’hyperoxie et ne développe pas de NVdu tout 24. De même, ...

Des modèles expérimentaux fiables et reproductibles sont nécessaires pour étudier la pathologie derrière les maladies oculaires angiogéniques et pour développer de nouvelles thérapeutiques à ces maladies dévastatrices. L’angiogenèse pathologique est la marque de fabrique de la dégénérescence maculaire liée à l’âge humide (DMLA) et de nombreuses maladies rétiniennes ischémiques dont la rétinopathie de la prématurité (ROP), la rétinopathie diabétique proliférante (DP) et l’occlusion rétinienne des veines (RVO)1,2,3,4. Les rétines humaines et rongeurs suivent un modèle de développement similaire, car la rétine humaine et la rétine des rongeurs sont parmi les derniers tissus vascularisés. Avant que la vascularisation rétinienne se soit complètement développée, la rétine reçoit son approvisionnement en éléments nutritifs de la vascularisation hyaloïde, qui, à son tour, régresse lorsque la vascularisation rétiniennecommence à se développer 1,2. Chez l’homme, le développement vasculaire rétinien est achevé avant la naissance, tandis que chez les rongeurs la croissance de la vascularisation rétinienne se produit après la naissance. Puisque le développement vasculaire rétinien se produit postnatally chez les rongeurs, il fournit un système modèle idéal pour étudier l’angiogenèse2,3. Les rongeurs nouveau-nés ont une rétine avasculaire qui se développe progressivement jusqu’à ce que le développement complet de la rétine vasculaire soit atteint à la fin de la troisième semainepostnatale 4. Les vaisseaux sanguins croissants de la souris néonatale sont en plastique, et ils subissent une régression pendant le stimulus hyperoxie5.
Rop est la principale cause de cécité infantile dans les pays occidentaux, car il affecte près de 70% des prématurés ayant un poids à la naissance de moins de 1250 g6,7. Le ROP survient chez les prématurés nés avant que les vaisseaux rétiniens ne terminent leur croissance normale. Rop progresse en deux phases: dans la phase I, la naissance prématurée retarde la croissance vasculaire rétinienne où, après la phase II, la vascularisation inachevée de la rétine en développement provoque l’hypoxie, ce qui induit l’expression de facteurs de croissance angiogéniques qui stimulent la croissance nouvelle et anormale des vaisseauxsanguins 8. Le modèle OIR a été un modèle largement utilisé pour étudier la pathophysiologie du ROP et d’autres rétinopathies ischémiques ainsi que pour tester de nouveaux candidatsmédicaments 2,3,9. Il est largement considéré comme un modèle reproductible pour la réalisation d’études de preuve de concept pour les médicaments antiangiogéniques potentiels pour les maladies oculaires ainsi que non oculaires. Les deux modèles de rongeurs, c’est-à-dire la souris et le rat OIR diffèrent dans leur modèle d’induction et de phénotype de la maladie. Le modèle de rat imite le phénotype ROP avec plus de précision, mais le modèle de souris fournit un modèle plus robuste, rapide et reproductible pour la néovascularisation rétinienne (NV). Dans le modèle de souris, NV se développe à la rétine centrale. Cette lecture pathologique est importante dans les études pharmacologiques d’efficacité pour de nombreuses rétinopathies ischémiques, telles que la RDP, le VR et la DMR exsudative, ainsi que pour les maladies angiogéniques non oculaires comme le cancer. En outre, la disponibilité de souris génétiquement manipulées (transgéniques et knockout) fait du modèle OIR souris une option plus populaire. Cependant, ni la souris ni le rat OIR modèle crée la fibrose rétinienne, qui est typique dans les maladies humaines.
La compréhension que des niveaux élevés d’oxygène contribuent au développement du ROP dans les années1950 10,11 a conduit au développement de modèles animaux. Les premières études sur l’effet de l’oxygène sur la vascularisation rétinienne ont été faites en 195012,13,14 et jusqu’aux années 1990, il y avait beaucoup de raffinements au modèle OIR. Les recherches menées par Smith et coll. en 1994 ont établi une norme pour le modèle actuel d’OIR de souris qui sépare l’hyaloidopathy de la rétinopathie15. Une large adoption de la méthode pour quantifier la vaso-oblitération et la NV pathologique par Connor et coll. (2009) a encore accru sa popularité16. Dans ce modèle, les souris sont placées à 75% d’oxygène (O2) pendant 5 jours à P7, suivies de 5 jours dans des conditions normoxiques. L’hyperoxie de P7 à P12 provoque une régression de la vascularisation rétinienne dans la rétine centrale. Au retour aux conditions normoxiques, la rétine avasculaire devient hypoxique (Figure 1A). En raison des stimulus hypoxiques de la rétine centrale avasculaire, certains des vaisseaux sanguins rétiniens poussent vers le vitré, formant le NV preretinal, appelé touffes préretinales2,3. Ces touffes sont immatures et hyperpermérables. La quantité de NV culmine à P17, après quoi elle régresse. La rétine est entièrement revascularisée et le NV est complètement régressé par P23 - P25 (Figure 2A)2,3.
Le modèle rat OIR (utilisant différents niveaux d’O2) a été décrit pour la première fois dans les années 1990 montrant que les différents niveauxd’O 2 à 80% et 40% causent un NV plus prononcé que moins de 80% O2 exposition constante17. Plus tard, il a été découvert que le modèle d’hypoxie intermittente, où O2 est pédalé à partir de l’hyperoxie (50%) l’hypoxie (10-12 %), provoque encore plus de NV que le modèle O 218à 80/40 %. Dans le modèle 50/10%, les chiots rat sont exposés à 50% pendant 24 heures, suivis de 24 heures dans 10% O2. Ces cycles se poursuivent jusqu’au P14, lorsque les chiots rat sont retournés à des conditions normoxiques (figure 1B). Comme chez les patients humains de ROP, dans le modèle de rat les secteurs avasculaires se développent à la périphérie de la rétine en raison du plexus vasculaire rétinien immature (figure 3).
Dans les deux modèles, les principaux paramètres qui sont habituellement quantifiés sont la taille d’AVA et de NV. Ces paramètres sont généralement analysés à partir de supports plats rétiniens où les cellules endothéliales sontétiquetées 4,16. Auparavant, la quantité de NV préretinal a été évaluée à partir de sections transversales rétiniennes en comptant les noyaux de vaisseaux sanguins ou de cellules vasculaires s’étendant à vitreux au-dessus de la membrane limitante interne. La principale limite de cette approche est qu’il n’est pas possible de quantifier les AGA.

<table><tbody><tr><td>Calibre 33, petit moyeu RN Aiguille</td><td>Hamilton Company</td><td>7803-05, 10mm, 25&deg ;, PS4</td><td>Pour injection intravitréenne</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe Inc.</td><td></td><td>Pour l’analyse d’images</td></tr><tr><td>Pompe à air air100</td><td>Eheim GmbH & Co. KG.</td><td>143207</td><td>Pour l’anesthésie par inhalation</td>Unité d’anesthésie</tr><tr><td>410 AP</td><td>Univentor Ltd.</td><td>2360309</td><td>Pour l’anesthésie par inhalation</td></tr><tr><td>AnalaR NORMAPUR Huile de chaux sodée</td><td>VWR International Ltd</td><td>22666.362</td><td>Pour le contrôle du CO2 lors de l’induction du modèle</td></tr><tr><td>Attane Vet 1000 mg/g</td><td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td><td>vnr 17 05 79</td><td>Pour l’anesthésie</td></tr><tr><td>par inhalation Brosse</td><td></td><td></td><td>Pour la préparation des supports plats</td></tr><tr><td>Gaz carbonique</td><td></td><td></td><td>Pour le sacrifice</td></tr><tr><td>Celeris D430 ERG system</td><td>Diagnosys LLC</td><td>121</td><td>Pour in vivo ERG</td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire</td><td>Greiner Bio-One International GmbH</td><td>664 160</td><td>Pour la préparation de supports plats</td></tr><tr><td>Cepetor Vet 1 mg/mL</td><td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td><td>vnr 08 78 96</td><td>Pour l’anesthésie</td></tr><tr><td>Plaques de couverture</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15165452</td><td>Pour la préparation de supports plats</td></tr><tr><td>O2 Controlled InVivo Cabin, système de filtration aninal et déshumidificateur</td><td>Coy Produits de laboratoire</td><td></td><td>Système fermé pour l’induction du modèle de maladie, en option pour le système semi-fermé</td></tr><tr><td>E702 Capteur d’O2</td><td>BioSphenix, Ltd.</td><td>E207, 1801901</td><td>Pour la mesure du niveau d’oxygène</td></tr><tr><td>Envisu R2200 Tomographe à cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT)</td><td>Bioptigen, Inc.</td><td>BPN000668</td><td>Pour l’imagerie in vivo</td></tr><tr><td>Eye spears</td><td>Beaver-Visitec International, Inc.</td><td>0008685</td><td>Pour l’injection intravitréenne et l’imagerie in vivo</td></tr><tr><td>Flexilux 600LL Source de lumière froide</td><td>Mikron</td><td>11140</td><td>Pour l’injection intravitréenne ou le prélèvement de tissus</td></tr><tr><td>Sel de fluorescéine sodique</td><td>Merck KGaA</td><td>F6377-100G</td><td>Pour l’imagerie in vivo</td></tr><tr><td>Unité d’échappement de gaz (+Double valve à 3 voies, masques faciaux pour souris et rats, filtre UNOsorb)</td><td>UNO Roestvaststaal BV</td><td>GEX 17015249</td><td>Pour l’anesthésie par inhalation</td></tr><tr><td>Seringue en verre, modèle 65 RN</td><td>Hamilton Company</td><td>7633-01</td><td>Pour l’injection intravitréenne</td></tr><tr><td>Angiographe rétinienne HRA2 (FA)</td><td>Heidelberg Engineering GmbH</td><td>Spec-KT-05488</td><td>Pour l’imagerie in vivo</td></tr><tr><td>Isolectine GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugué</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>I21411</td><td>Pour le marquage du système vasculaire rétinien sur montures plates</td></tr><tr><td>Ketaminol Vet 50 mg/mL</td><td>Intervet International B.V.</td><td>vnr 51 14 85</td><td>Pour l’anesthésie</td></tr><tr><td>Oxygène médicinal gazeux</td><td></td><td></td><td>Pour l’induction de modèles de maladies</td></tr><tr><td>Souris C57BL/6JRj</td><td>Janvier Labs</td><td></td><td>Aussi d’autres souches possibles</td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>Pour la préparation de supports plats</td></tr><tr><td>Minims Povidone Iode 5 % (unité)</td><td>Bausch & Lomb U.K Limited</td><td>vnr 24 11 304</td><td>Pour injection intravitréenne</td></tr><tr><td>Azote gazeux</td><td></td><td></td><td>Pour l’induction de modèles de maladies (rat)</td></tr><tr><td>Oftan Chlora 10 mg/g</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 55 01 11</td><td>Pour injection intravitréenne</td></tr><tr><td>Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 55 03 43</td><td>Pour in vivo ERG</td></tr><tr><td>Oftan Obucain 4 mg/ml</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 55 03 50</td><td>Pour injection intravitréenne</td></tr><tr><td>Oftan Tropicamid 5 mg/ml</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 04 12 36</td><td>Pour l’imagerie in vivo</td></tr><tr><td>ProOx Model 110 Contrôleur O2 et chambre animale</td><td>BioSphenix, Ltd.</td><td>803</td><td>Pour l’induction du modèle de maladie, système semi-fermé, en option pour le système fermé</td></tr><tr><td>Contrôleur ProOx modèle P360 O2 et chambre animale</td><td>BioSphenix, Ltd.</td><td>538</td><td>Pour l’induction du modèle de maladie, système semi-fermé, facultatif pour le système fermé</td></tr><tr><td>Rats CD(SD)</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Aussi d’autres souches possibles</td></tr><tr><td>Revertor 5 mg/mL</td><td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td><td>vnr 13 04 97</td><td>Pour l’inversion de l’anesthésie</td></tr><tr><td>Gel</td><td></td><td></td> de silice <td>Pour le contrôle de l’humidité pendant l’induction du modèle</td></tr><tr><td>Systane Ultra 10ml</td><td>Alcon</td><td>Tamro 2050250</td><td>Pour l’hydratation de l’œil</td></tr><tr><td>Systane Ultra unité 0,7ml</td><td>Alcon</td><td>Tamro 2064871</td><td>Pour l’hydratation de l’œil</td></tr><tr><td>Pipette de transfert</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1343-9108</td><td>Pour la préparation des supports plats</td></tr><tr><td>VENTI-Line VL 180 PRIME Four de séchage</td><td>VWR</td><td>VL180S 170301</td><td>Pour le séchage du gel de silice</td></tr><tr><td>VisiScope SZT350 Stéréomicroscope</td><td>VWR</td><td>481067</td><td>Pour l’injection intravitréenne ou le prélèvement de tissus</td></tr></tbody></table>

modèle de rétinopathie induite par l’oxygène pour les maladies rétiniennes ischémiques chez les rongeurs

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

Un des modèles couramment utilisés pour les rétinopathies ischémiques est le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR). Ici, nous décrivons des protocoles détaillés pour l’induction du modèle OIR et ses readouts chez les souris et les rats. La néovascularisation rétinienne est induite dans l’OIR en exposant les petits rongeurs soit à l’hyperoxie (souris) soit en alternant les niveaux d’hyperoxie et d’hypoxie (rats). Les principales lectures de ces modèles sont la taille des zones néovasculaires (NV) et avasculaires (AVA) dans la rétine. Ce modèle in vivo préclinique peut être utilisé pour évaluer l’efficacité des médicaments anti-angiogéniques potentiels ou pour aborder le rôle de gènes spécifiques dans l’angiogenèse rétinienne en utilisant des animaux génétiquement manipulés. Le modèle a une certaine tension et la variation spécifique du fournisseur dans l’induction OIR qui doit être pris en considération lors de la conception des expériences.

Le principal résultat du modèle est le phénotype vasculaire : la taille des AVA et la quantité de NV. Dans le modèle OIR de souris, la vaso-oblitération se produit dans la rétine centrale (Figure 2A), tandis que dans le modèle de rat, il se développe dans la périphérie, c’est-à-dire, semblable à l’homme ROP22 (Figure 3A). C’est parce que le plexus vasculaire superficiel s’est déjà développé lorsque les souris sont exposées à l’hyperoxie, ...

La rétinopathie induite par l’oxygène (OIR) peut être utilisée pour modéliser les maladies rétiniennes ischémiques telles que la rétinopathie de la prématurité et la rétinopathie diabétique proliférative et pour servir de modèle pour des études de preuve de concept dans l’évaluation des médicaments antiangiogéniques pour les maladies néovasculaires. OIR induit une néovascularisation robuste et reproductible dans la rétine qui peut être quantifiée.

Modèle de rétinopathie induite par l’oxygène pour les maladies rétiniennes ischémiques chez les rongeurs

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Après son développement, le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène est devenu largement utilisé dans les études précliniques des maladies rétiniennes néovasculaires. Il a été utilisé comme modèle pour étudier l’angiogenèse pathologique en réponse à l’hypoxie. Le principal avantage de ce modèle est qu’il induit une réponse neurovasculaire robuste, reproductible et facilement quantifiable.Ce modèle peut être utilisé comme modèle préclinique pour étudier les effets d’éventuels candidats thérapeutiques. Il est considéré comme un modèle pertinent pour plusieurs maladies humaines, telles que la rétinopathie du prématuré, la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire liée à l’âge humide. Noter le poids des animaux avant et après l’induction de l’hypoxie et au moment du sacrifice.Assurez-vous qu’il y a suffisamment de nourriture au fond de la cage et ajoutez de la chaux sodée avec indicateur de couleur au fond de la chambre pour absorber l’excès de dioxyde de carbone lorsqu’un système de filtration n’est pas utilisé. Surveillez l’humidité et la température à l’intérieur de la chambre, en maintenant l’humidité entre 40 et 65 %Si nécessaire, augmentez l’humidité de la chambre en plaçant des plats avec de l’eau au fond. Calibrez le capteur d’oxygène avec de l’air ambiant normal et 100 % d’oxygène.Ensuite, placez les souris P7 dans une chambre et réglez le niveau d’oxygène à 75 %Gardez les souris dans la chambre pendant cinq jours jusqu’à P12, en surveillant les animaux pendant l’induction. Lorsque vous avez terminé, retirez les souris de la chambre. Pesez les animaux et faites des marques d’identification sur la queue ou l’oreille.Une fois l’animal anesthésié, effectuez un pincement des orteils. Un petit réflexe est acceptable. Gardez l’animal sur un coussin chauffant pendant le traitement.Utilisez une seringue en verre avec une aiguille de calibre 33 à 34 pour l’injection IVT. Appliquez une goutte d’iode, puis appuyez sur la paupière et saisissez le globe oculaire avec une pince. Faites l’injection postérieurement au limbe, à un angle d’environ 45 degrés pointant vers le nerf optique.Gardez l’aiguille en place pendant 30 secondes après l’injection du médicament pour éviter le reflux de la solution injectée. Examinez l’œil à la recherche de complications telles que des hémorragies ou des lésions rétiniennes après avoir retiré l’aiguille. Appliquez une pommade antibiotique sur le dessus de l’œil après l’injection.Si vous le souhaitez, effectuez une imagerie in vivo sur des animaux vivants pendant la période de suivi pour enregistrer les changements qui se développent dans la rétine au cours des réponses angiogéniques. Utilisez la tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral pour visualiser les couches rétiniennes in vivo. Prélevez les yeux des animaux en coupant le tissu autour de l’œil, en saisissant derrière le globe oculaire avec une pince incurvée et en soulevant l’œil hors de l’orbite.Incuber les globes oculaires dans du paraformaldéhyde filtré à 4 % fraîchement préparé pendant une à quatre heures. Retirez le fixateur et lavez les globes oculaires trois fois avec du PBS pendant 10 minutes par lavage. Disséquez immédiatement les rétines ou stockez-les dans du PBS à quatre degrés Celsius.Préparez des supports plats rétiniens pour quantifier le degré de néovascularisation et la taille des zones avasculaires ou AVA. Disséquez la rétine au microscope stéréoscopique à l’aide de micro-ciseaux et de pinces. Placez le globe oculaire dans du PBS pour le garder humide et perforez-le au niveau du limbe avec une aiguille de calibre 23, puis coupez autour du limbe avec des micro-ciseaux incurvés pour retirer l’iris et la cornée.Placez soigneusement la pointe des ciseaux entre l’EPR et la rétine neurale et coupez le complexe de la sclérotique choroïde EPR vers le nerf optique. Faites de même de l’autre côté du globe oculaire. Ensuite, coupez ou déchirez doucement le tissu jusqu’à ce que la cupule rétinienne soit exposée.Retirez la lentille de la coupe rétinienne et ajoutez du PBS dans la cupule. Retirez tous les vaisseaux hyaloïdes, le vitré et les débris sans endommager la rétine. Faites quatre incisions sur la rétine avec des micro-ciseaux droits pour créer une structure semblable à une fleur.Utilisez un pinceau doux ou une pipette de transfert pour le transférer sur une plaque à puits pour la coloration. Étiquetez le système vasculaire rétinien avec de l’isolectine B4 qui colore la surface des cellules endothéliales. Incuber les rétines dans un tampon de blocage pendant une heure et les laver avec 1 % de NGS et 0,1 % de Triton dans du TBS pendant 10 minutes.Incuber les rétines avec 5 à 10 microgrammes par millilitre d’isolectine B4 conjuguée à un colorant fluorescent pendant la nuit à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière. Le lendemain, lavez les rétines trois fois avec 1 % NGS et 0,1 % Triton dans TBS pendant 10 minutes par lavage. Placez les rétines sur une lame de microscope, la rétine interne vers le haut.Ensuite, étalez soigneusement la rétine à l’aide d’un pinceau doux et retirez tous les vaisseaux ou débris hyaloïdes restants. Ajoutez du milieu de montage sur l’échantillon et placez une lamelle sur la lame. Stockez les rétines à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière.Imagez les montures plates rétiniennes à l’aide d’un microscope à fluorescence avec un objectif 10X. Focus sur le plexus vasculaire superficiel et la néovascularisation pré-rétinienne. Créez une image de numérisation de tuiles pour capturer l’ensemble de la rétine et fusionnez les numérisations de tuiles.Quantifiez les images en mesurant les AVA, la zone de néovascularisation et la surface rétinienne totale à l’aide d’un programme de traitement d’images. Dessinez les AVA et la zone rétinienne totale à l’aide d’un outil de dessin à main levée et sélectionnez les zones néovasculaires à l’aide d’un outil de sélection. Dans le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène chez la souris, la vaso-oblitération se produit dans la rétine centrale.Alors que dans le modèle du rat, il se développe à la périphérie de la même manière que la RDP humaine. La néovascularisation pré-rétinienne se développe près des zones avasculaires, en particulier de la rétine centrale chez la souris et de la périphérie chez le rat. L’analyse histologique à l’aide de coupes transversales ou de montages plats peut être effectuée pour évaluer les changements morphologiques dans les rétines OIR ou la présence de types de cellules d’intérêt, par exemple, les cellules inflammatoires.En option, une imagerie in vivo non invasive peut être réalisée pendant la période de suivi de l’OIR. Le système vasculaire rétinien et hyaloïde peut être visualisé avec l’angiographie à la fluorescéine et la tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral peut être utilisée pour évaluer les changements structurels de la rétine. Les changements fonctionnels peuvent être mesurés par électrorétinographie.L’aflibercept, un piège VEGF soluble, inhibe la revascularisation néovasculaire et physiologique dans l’OIR. Les yeux OIR injectés à P14 avec une forte dose d’aflibercept présentaient des AVA rétiniennes encore plus importantes que les yeux non traités, ce qui suggère que l’aflibercept bloque également la revascularisation rétinienne physiologique provoquée par l’hypoxie. Lorsque vous essayez ce protocole, n’oubliez pas de considérer à l’avance la taille de portée appropriée pour votre expérience et de surveiller le bien-être des mères et des petits dans la chambre à oxygène.Tenez compte du fait que la prise de poids postnatale affecte le résultat dans le modèle. Les échantillons rétiniens obtenus à partir de ce modèle peuvent être utilisés pour des méthodes analytiques, telles que l’immunohistochimie, l’analyse de l’expression génique ou protéique, et pour mesurer les effets de candidats thérapeutiques potentiels sur la rétine au niveau moléculaire.

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Modèle de rétinopathie induite par l’oxygène pour les maladies rétiniennes ischémiques chez les rongeurs

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