Techniques d’immunohistochimie pour analyser la prolifération cellulaire et la neurogenèse chez le rat à l’aide de l’analogue de thymidine BrdU

Il s’agit d’un protocole clé dans le domaine de la neurogenèse adulte. Nous vous présentons ici une description détaillée des étapes nécessaires pour réaliser une coloration réussie. Cette technique permet d’identifier simultanément des protéines spécifiques co-exprimées dans les cellules en division tout en préservant l’intégrité des tissus.

Nous vous recommandons de tester les anticorps et les affections tissulaires à l’avance. Les étapes cruciales sont la perméabilisation de la membrane, la dénaturation minutieuse de l’ADN et le test des temps de blocage et de lavage. La normalisation de la technique est un défi pour les nouveaux laboratoires.

La préparation du réactif et l’administration de l’analogue de la thymidine chez le rongeur sont essentielles au succès des résultats Pour l’administration de l’analogue de la thymidine BrdU, immobilisez la cavité abdominale inférieure pour retenir le rat expérimental et utilisez une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 23 pour injecter par voie intrapéritonéale une solution de BrdU fraîchement préparée de 50 milligrammes par kilogramme dans l’animal. Au point final expérimental approprié, prélever le cerveau et congeler le cerveau pour permettre l’acquisition de coupes coronales de 40 micromètres d’épaisseur à l’aide d’un microtome cryostat et placer les sections dans des puits individuels d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits en solution de cryoprotection dans l’ordre de leur collecte. Lorsque toutes les sections ont été prélevées, conservez les échantillons à moins 20 degrés Celsius pendant quelques mois au maximum.

Pour évaluer la coloration BrdU, à l’aide d’une réaction de peroxydase, avec le complexe avidine-biotine-peroxydase, transférez les tranches de la solution de cryoprotection dans 0,1 molaire de PBS jusqu’à ce que les échantillons atteignent la température ambiante et rincez les tissus trois fois pendant 10 minutes avec du PBS frais de 0,1 molaire par lavage. Après le dernier lavage, incuber les sections dans une solution de blocage de la peroxydase endogène pendant 30 minutes, à température ambiante, suivi de trois lavages de 10 minutes dans du PBS 0,1 molaire. Après le dernier lavage, incubez les sections pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius dans deux molaires d’acide chlorhydrique, puis un rinçage de 10 minutes dans un tampon de borate 0,1 molaire.

Après trois lavages dans du PBS froid glacé de 0,1 molaire, incuber les échantillons pendant deux heures à température ambiante dans une solution de blocage PBS+, suivie d’une incubation d’une nuit avec un anticorps primaire anti-BrdU de souris dans PBS+à quatre degrés Celsius. Après trois lavages de PBS de 0,1 molaire, incubez les échantillons pendant deux à quatre heures avec l’anticorps secondaire biotinylé de souris approprié dans du PBS+ à température ambiante. Après le lavage, traitez les sections avec la solution ABC pendant une heure à température ambiante, suivie de trois lavages PBS de 0,1 molaire.

Après le dernier lavage, transférez les tranches dans une solution de substrat de peroxydase DAB pour une incubation de deux à 10 minutes jusqu’à ce que les tranches deviennent gris foncé. Si des cellules positives peuvent être visualisées, rincez les échantillons avec trois lavages à l’eau du robinet de 15 minutes suivis de trois lavages PBS de 0,1 molaire. Après le dernier lavage Utilisez une brosse douce pour monter soigneusement les tranches sur des lames gélatinisées, pour un séchage à l’air libre pendant la nuit à température ambiante.

Le lendemain matin, utilisez un support de montage permanent pour placer des lamelles de recouvrement sur les échantillons. Pour quantifier les cellules positives à BrdU, utilisez d’abord le grossissement 4x, au microscope, pour identifier le gyrus denté et recherchez soigneusement la couche cellulaire granulaire le long de l’axe Z pour les noyaux marqués à BrdU. Après avoir sélectionné une section d’intervalle pour la recherche de cellules dans tout le gyrus denté, comptez toutes les cellules positives à BrdU.

La morphologie du noyau marqué peut changer en fonction de la quantité de BrdU incorporée par la cellule. Déplacez-vous lentement sur l’axe Z pour quantifier tous les noyaux d’au moins 10 sections par animal et d’au moins cinq animaux par groupe qui intègrent un cluster. Pour la déconvolution de l’image, ouvrez le plugin 3D de la fonction d’étalement des points de diffraction, remplissez toutes les données requises, cliquez sur OK et enregistrez le fichier.

Ensuite, ouvrez le plugin DeconvolutionLab2 et faites glisser l’image Z-stack et le fichier PSF correspondants vers l’emplacement de fenêtre correspondant. Sélectionnez l’algorithme de déconvolution et le nombre d’itérations, puis cliquez sur Exécuter. Pour combiner les images déconvolutées en une seule image Z-stack, sélectionnez Image et piles et cliquez sur Projet Z.

Dans le menu du type de projection, sélectionnez Intensité maximale. Cliquez sur OK et enregistrez le fichier. Pour créer une image RVB, sélectionnez Image et couleur, puis cliquez sur Fusionner les couches pour définir l’image correspondante sur la couche de couleur souhaitée dans le menu déroulant.

Décochez ensuite la case Créer un composite. Cliquez sur OK et enregistrez le fichier. Une fois que toutes les images de canal ont été créées, ouvrez au moins deux des fichiers image et sélectionnez des canaux de couleur différents pour chaque fichier image afin de créer une image RBG.

Sur ces images, on peut observer des coupes représentatives de gyrus denté avec des cellules marquées à BrdU. Comme observé dans ces images agrandies des coupes, les cellules marquées présentent une coloration sombre intense. Il convient de noter qu’il existe des différences significatives dans le nombre de cellules positives à BrdU entre les rats contrôlés qui n’ont pas fait d’activité physique et le groupe expérimental qui a été exposé à une activité physique, ce qui correspond à d’autres résultats rapportés qui ont démontré que l’activité physique augmente la prolifération cellulaire dans le gyrus denté adulte.

Lorsque vous essayez ce protocole, utilisez des solutions fraîchement préparées et manipulez le tissu avec douceur. L’hippocampe est susceptible de se séparer du reste des lames lorsqu’il est traité à travers celui-ci et peut être manqué. Cette procédure pourrait être adaptée pour l’évaluation du marquage et de l’indice de l’ADN de la synthèse de l’ADN et des études de prolifération cellulaire de coloration double.

Nous espérons que cet effort a été utile à la communauté scientifique et qu’il sera plus facile de répondre à de nouvelles questions dans l’étude de la prolifération cellulaire, lorsque la technique d’immunohistochimie.