Électrorétinogramme couplé direct (DC-ERG) pour l’enregistrement des réponses électriques évoquées par la lumière de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris

La technique DC-ERG peut être utilisée pour l’évaluation non évasive de la fonction d’épithélium pigmentaire rétinien pour surveiller les changements liés à l’âge ou la progression de la maladie et pour évaluer les effets d’intervention pharmacologique. Cette technique améliore la capacité de reproduction dc-ERG et la facilité d’utilisation en simplifiant la préparation des électrodes capillaires. Il peut également être complété par une application logicielle ohm standard pour faciliter l’analyse.

Commencez par glisser soigneusement une aiguille de seringue de calibre 25 à travers le joint en caoutchouc de silicone jusqu’à la paroi arrière du support d’électrode. Remplissez la base du support d’électrode avec du HBSS dégazé tout en rétractant lentement l’aiguille, en prenant soin de ne pas introduire de bulles, et remplacez le bouchon fileté sans serrer. Réinsérer l’aiguille de seringue pour remplir l’espace vide dans l’espace avec HBSS et tenir le capillaire horizontalement tout en remplissant pour empêcher la solution s’échapper de l’autre extrémité.

Saisir le capillaire rempli à l’extrémité pliée, insérer lentement l’autre extrémité à travers le bouchon desserré et serrer le bouchon de vis en place. Inclinez les supports d’électrode avec les électrodes capillaires orientées vers le haut pour permettre à toutes les bulles de s’écouler et dégazer les capillaires dans une chambre à vide pendant cinq à dix minutes. Ensuite, relâchez lentement le vide et remplissez les porte-électrodes et les capillaires en verre, comme démontré.

Pour faire un stand personnalisé pour le support microélecrode, retirez les clips polytacétaux noirs d’un côté d’un t-clip numéro huit et utilisez une base de cylindre avec des joints de boule magnétique usinés en deux pour ajuster la hauteur. Fixez les t-clips modifiés aux vis de montage de boule magnétique avec des écrous de taille M3 et une glissière dans la poignée en bois conique d’environ un pouce, modifiée à partir d’un bâton de nettoyage de pointe de coton, dans le stand à un angle pour fixer le support de microélecrode dans le support magnétique fait sur mesure de boule magnétique de T-clip. Ensuite, utilisez la base du cylindre des aimants de terres rares pour positionner en toute sécurité le support d’électrode personnalisé sur la plaque métallique de la scène, permettant une rotation de 360 degrés sur un axe à 180 degrés.

Pour effectuer un test d’électrode, d’abord, abaissez doucement les microélecrodes capillaires remplies de HBSS entièrement assemblées dans un petit récipient de HBSS. Placez l’électrode au sol de l’aiguille et l’électrode de référence de granulés argentée au chlorure argenté dans le même HBSS pour compléter le circuit et sélectionner ou créer un identificateur approprié pour décrire la souris à tester. Pour sélectionner le protocole d’électrorétogramme couplé direct à effectuer, cliquez sur protocoles et sélectionnez DC-ERG.

Cliquez sur exécuter. Une boîte de dialogue apparaîtra avec les informations du patient. Si l’information est correcte, cliquez sur oui et passez aux étapes une des six.

Fermez les portes de la cage de Faraday et cliquez sur impedance pour afficher le mode d’impedance. Vérifiez que les valeurs de référence de la bouche, du sol arrière et des électrodes d’enregistrement sont acceptables et cliquez sur l’étape pour passer à l’étape quatre de six pour tester la stabilité de base. Pour commencer à visualiser les traces, cliquez sur aperçu.

Les traces devraient être un faible bruit avec une amplitude de pointe à maximale de moins de 200 microvolts. Pour positionner la souris et les électrodes pour une expérience, anesthésier la cornée d’une souris sédated avec une goutte d’acide chlorhydrique proparacaine de 5%avant de dilatation de la cornée avec une baisse de 2,5% phényléphrine HCL et 5% tropicamide. Dans le logiciel du système ERG, vérifiez que le bon patient est sélectionné.

Cliquez sur protocoles. Sous la description du protocole, sélectionnez DC-ERG et cliquez sur exécuter. Cliquez sur oui pour vérifier que le test correct est effectué.

Utilisez l’étape un des six pour allumer une faible lumière rouge à l’intérieur du dôme et placer la souris sur une table d’enregistrement chauffée. Utilisez des forceps pour tenter soigneusement la peau de la jambe arrière. Et en utilisant une main pour tenir fermement l’électrode aiguille, utiliser l’autre main pour insérer l’électrode sous-cutanée dans la jambe arrière pour fixer l’électrode en place.

Placez l’électrode de chlorure d’argent et d’argent de référence dans la bouche de l’animal afin que la pastille centrée repose le long de la joue arrière et soit maintenue en place derrière les dents. Avant de placer les électrodes capillaires sur l’œil, placez le support d’électrode avec les capillaires en verre orientés verticalement et faites glisser le support d’électrode avec un index pour enlever toutes les bulles qui pourraient avoir été introduites. Utilisez une aiguille de calibre 25 pour remplir les pointes capillaires avec hbss et inspecter les capillaires pour s’assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air piégées dans les extrémités.

Placez le support d’électrode de sorte que les extrémités ouvertes des capillaires remplis de HBSS soient en contact doux avec la cornée. Et en prenant soin d’éviter d’introduire des bulles, inverser le distributeur de gel pour les yeux lubrifiant pour jeter les gouttes initiales. Ensuite, placez une goutte de gel pour les yeux lubrifiant sur chaque œil pour maintenir la conductivité et prévenir la dessiccation pendant l’enregistrement.

Pour enregistrer les DC-ERGs, cliquez sur étape pour sélectionner l’étape cinq sur six et cliquez sur impedance pour utiliser l’écran de vérification d’impedance pour examiner les résistances des yeux gauche et droit. Les valeurs d’impédance pour les électrodes d’enregistrement à chaque œil doivent être similaires. Et les valeurs d’impédance pour le sol et les électrodes de référence devraient être inférieures à 10 kilohms.

Cliquez sur aperçu pour afficher les traces pour les yeux gauche et droit et attendre jusqu’à 10 minutes pour une ligne de base stable à atteindre. Ensuite, cliquez sur arrêter pour quitter l’aperçu de la trace et cliquez sur exécuter pour démarrer l’enregistrement. Ici, un ensemble de données d’échantillons de souris conditionnelles knock-out et de type sauvage est montré.

Dans cette analyse, la trace a souffert de bulles minuscules dans l’électrode. Il a augmenté le bruit de pointe à pointe dans la trace. Dans une analyse distincte, les bulles ont été éliminées à l’aide de la chambre à vide avant d’assembler les microélectrodes à l’intérieur des peuplements du support d’électrode.

Les meilleures lignes d’ajustement aux 25 secondes initiales peuvent être calculées, ce qui permet de réaguiller les réponses corrigées de la dérive et d’identifier les amplitudes des composants DC-ERG. Comme prévu, l’expression réduite des canaux de potassium de traitement 7.1 dans le RPE atténue considérablement l’onde c et l’oscillation rapide, indiquant une affaiblissement significative des propriétés électriques rétiniennes d’épithélium de pigment. Ici, les amplitudes relatives des composants DC-ERG, normalisées de type sauvage et tracées contre les deux plus grandes amplitudes d’ondes a évoquées par la lumière, sont montrées.

Cette forme d’analyse peut déterminer si les réponses électriques réduites de l’EPR peuvent être expliquées par la réduction de l’activité photoréceptrice seule. Ou s’il y a un défaut sous-jacent qui provient de l’EPR. N’oubliez pas d’atteindre une base de référence stable avant de passer à l’enregistrement de la souris et de réinspecter périodiquement les électrodes pour les bulles qui peuvent avoir été introduites.

Les ERG adaptés à l’obscurité peuvent être enregistrés avant le DC-ERG pour mesurer la fonction rétinienne entraînée par le cône. Des ERGs adaptés à la lumière peuvent également être effectués après le DC-ERG pour évaluer les réponses rétiniennes entraînées par les cônes.