Extraction et quantification de polyphosphates solubles et radioalétiques d’inositol provenant de différentes espèces végétales à l’aide de SAX-HPLC

Le protocole démontré ici peut aider à élucider la biosynthèse des polyphosphates d’inositol des plantes et à répondre aux questions concernant leur rôle dans certains aspects du métabolisme et du développement des plantes. Cette méthode est très sensible car l’utilisation du précurseur radioactif des phosphates d’inositol permet une détection fiable de toutes les espèces de phosphate d’inositol chez les plantes. La démonstration visuelle de cette méthode est importante parce que la plupart des biologistes végétaux ne sont pas familiers avec l’analyse HPLC et la configuration nécessaire.

En outre, les étapes critiques de ce protocole, comme l’extraction des phosphates d’inositol, sont difficiles à suivre sans démonstration appropriée. Commencez par mettre en place un système composé de deux pompes HPLC indépendantes, l’une pour le tampon A et l’autre pour le tampon B.Les deux pompes doivent être contrôlées ensemble via un ordinateur ou une pompe principale. Mettre en place un lavage de joint à piston pour les deux pompes, soit par la force gravitationnelle ou par une troisième pompe basse pression.

Connectez les deux pompes à un mélangeur dynamique, puis connectez le mélangeur à une valve d’injection avec une boucle d’échantillon d’au moins un millilitre. Utilisez des capillaires pour connecter la valve d’injection à la colonne et la colonne au collecteur de fractions. Sèmez les graines de lotus en une rangée sur des boîtes carrées de Petri remplies de solides supports de croissance composés de 0,8% d’agar bactériologique dans de l’eau déionisée.

Laissez les graines stratifier pendant au moins trois jours à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Placer les graines dans un incubateur de croissance. Transférer 10 à 20 semis dans un puits d’une plaque de culture à fond plat de 12 puits remplie de deux millilitres de solution de sel de SP demi-résistance qui est complétée par 1 % de saccharose et ajustée au pH 5,7.

Ajouter 45 microcourards de myo-inositol 3H à l’assiette et le tourbillonner doucement. Couvrir la plaque d’un couvercle et la sceller de ruban chirurgical microporeux. Ensuite, placez-le de nouveau dans l’incubateur de croissance.

Après cinq jours d’étiquetage, retirer les semis des médias et les laver brièvement avec de l’eau déionisée. Séchez-les avec des serviettes en papier et transférez-les dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre, en vous assurant de ne pas trop remplir le tube. Casser le tube dans de l’azote liquide et le conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’extraction.

Prélevez les échantillons du congélateur et conservez-les dans de l’azote liquide jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi. Moudre avec un pilon tube de microcentrifugeuse jusqu’à ce qu’ils commencent à décongeler, puis ajouter 500 microlitres de tampon d’extraction de froid glacé. Continuer le broyage jusqu’à ce que l’échantillon soit homogénéisé et que la solution soit colorée.

Centrifugeuse les échantillons pendant 10 minutes à 18 000 fois G et quatre degrés Celsius. Transférer ensuite le supernatant dans un tube frais de 1,5 millilitre. Les tubes utilisés pour l’extraction sont considérés comme des déchets radioactifs solides et doivent être éliminés en conséquence.

Ajouter soigneusement 300 microlitres de tampon de neutralisation à l’extrait, ce qui provoquera immédiatement des précipitations de protéines et de bouillonnement. Après une minute, mélanger l’échantillon avec une pointe de pipette et pipette cinq microlitres sur du papier pH pour s’assurer que le pH est entre sept et huit. Si nécessaire, ajouter de petites quantités de tampon de neutralisation ou de tampon d’extraction jusqu’à ce que le pH désiré soit atteint et laisser reposer les échantillons sur la glace pendant au moins une heure avec un couvercle ouvert.

Ensuite, centrifugez-les pendant 10 minutes et transférez le supernatant dans un tube frais de 1,5 millilitre. Équipez le collecteur de fractions de 96 petits flacons de scintillation et remplissez chaque flacon de deux millilitres d’un cocktail de scintillation approprié compatible avec de faibles tampons de pH et des concentrations élevées de phosphate d’ammonium. Démarrez le système HPLC, puis activez le lavage du joint de piston et maintenez-le activé pendant toute la course.

Injecter manuellement l’échantillon avec une seringue appropriée. Démarrez les pompes et le gradient. Pendant que l’exécuter HPLC est en cours, vérifiez la pression régulièrement.

La pression de départ devrait être d’environ 18 à 24 barre et devrait lentement passer à 50 à 60 barre une fois que 100% tampon B est atteint. Après la course, fermez les fioles hermétiquement et secouez vigoureusement les fractions avec le cocktail de scintillation à mélanger. Si vous ne procédez pas directement à la mesure, gardez les flacons en position verticale dans l’obscurité.

Pour mesurer les fractions, insérez les flacons dans les supports de comptoir de scintillation à l’aide de supports qui s’adaptent aux petits flacons et mesurez chaque flacon pendant cinq minutes dans un comptoir de scintillation liquide. Préparez un graphique de ligne 2D où les dénombrements mesurés par minute ou CPM sont tracés en fonction du temps de rétention. Pour comparer les échantillons les uns avec les autres, normalisez les données en résumant le CPM de chaque fraction élisée de la minute 25 à 96 pour chaque échantillon individuel et en divisant le CPM total de cet échantillon par le CPM total des autres échantillons.

Afin d’effectuer des quantifications relatives de certains pics de polyphosphate d’inositol et de créer par la suite des graphiques à barres contenant des données de réplications pour des analyses statistiques, poursuivez l’analyse avec un logiciel spécialisé qui permet de calculer les zones de pointe des chromatogrammes. Un spectre complet de polyphosphate d’inositol obtenu à partir des extraits d’A.thaliana après comptage de scintillation est montré ici. Les sommets sont bien séparés et peuvent être attribués à différents isomères.

Quand une colonne âgée est employée, une réduction claire de l’hexakisphosphate d’inositol et de l’absence du pyrophosphate d’inositol est visible. L’analyse SAX-HPLC a également été effectuée sur les semis de L.japonica qui ont été cultivés et étiquetés dans les mêmes conditions que les semis d’Arabidopsis. Bien que l’on puisse vraisemblablement voir toutes les espèces et pics de polyphosphate d’inositol connus d’Arabidopsis, il existe des différences dans les quantités relatives d’isomères polyphosphate d’inositol spécifiques entre les deux espèces.

Pour démontrer que les échantillons n’ont pas à être analysés immédiatement après l’extraction, un échantillon a été divisé en deux et la moitié a été analysé le lendemain après l’entreposage à moins 80 degrés Celsius. Les différences entre les profils SAX-HPLC des échantillons frais et congelés n’étaient pas significatives, ce qui démontre qu’un cycle gel-dégel ne nuit pas à l’échantillon et que la méthode elle-même génère des résultats reproductibles. Lorsque vous essayez ce protocole, toujours moudre les échantillons à fond, congelés et avec tampon d’extraction, et viser près de pH neutre après neutralisation pour assurer une récupération maximale du phosphate d’inositol radio-étiqueté pour l’analyse SAX-HPLC.

Il est possible de purifier la radio-étiquetée à partir d’une course SAX-HPLC pour une utilisation ultérieure, par exemple dans les réactions mutuelles en collectant des fractions sans cocktails de scintillation et en mesurant seulement de petits aliquots.