Name: Obtention d’ostéocytes primaires par fractionnement calvariaire murin d’ostéocytes exprimant la GFP (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Découvrez une méthode efficace d'isolation d'ostéocytes primaires GFP+ à partir de souris dmp1-topaz. Ce protocole réduit le temps de manipulation et maximise le rendement cellulaire avec une contamination minimale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu en partie par une subvention JSPS KAKENHI de la Société japonaise pour la promotion de la science (n ° 19K10397 à H.K. et n ° 18K09862 à I.M.).

Toutes les procédures et tous les soins aux animaux ont été effectués conformément aux règles et règlements de l’Université de Tohoku.
1. Dissection du calvaire de souris dmp1-topaze nouveau-né
<ol><li>Pour ce protocole, utilisez des petits de 6 à jours de souris C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. Euthanasier les souris avec une inhalation d’isoflurane à 5%, puis transférer les petits dans de l’éthanol à 70%.</li>
	<li>Transférer le chiot euthanasié dans un plat de culture non traité.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux et de pincettes, saisissez la peau à la base du crâne et faites une incision.</li>
	<li>En utilisant la première incision comme point de départ, coupez les deux côtés latéraux du crâne devant les oreilles, retirez la peau et exposez le calvaire.</li>
	<li>Tenez la tête de l’arête nasale et coupez le calvaire le long de la suture lambdoïde. Coupez le long des bords latéraux des os pariétaux et étendez-le pour inclure la partie frontale.</li>
	<li>Séparez le calvaire du tissu cérébral sous-jacent. REMARQUE: Pour assurer un calvaire osseux propre avec une fixation minimale des tissus mous, ne coupez pas profondément dans l’os; Pour référence, on devrait pouvoir voir l’ombre des ciseaux sous l’os.</li>
	<li>Transférer le calvaire dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4 tout au long du protocole). Assurez-vous que la partie concave est orientée vers le haut.</li>
</ol>2. Fractionnement du calvaire de souris nouveau-né
<ol><li>Transvaser jusqu’à 5 calvariae dans un tube conique de 50 mL contenant 5 mL de solution de collagénase à 2 mg/mL. Utilisez une solution de collagénase fraîche préparée juste avant utilisation.<ol><li>Pour préparer une solution de collagénase fraîche, ajouter la poudre de collagénase au tampon d’isolement (70 mM de NaCl, 10 mM de NaHCO3, 60 mM de sorbitol, 3 mM K 2 HPO4, 1 mM de CaCl 2, 1 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA), 5 mg/mL de glucose et 25 mM de HEPES) à 2mg/mL. Dissoudre la poudre de collagénase sur un agitateur magnétique.</li>
		<li>Faites passer la solution de collagénase à travers une unité filtrante stérile de 0,22 μm dans un tube de 50 ml et gardez-la sur la glace tout au long du protocole.</li>
	</ol></li>
	<li>Incuber le calvaire à 37 °C pendant 20 min sur un agitateur à 300 rpm pour obtenir la fraction 1.</li>
	<li>Jeter la digestion de la fraction 1, laver le calvaire avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et jeter le lavage.</li>
	<li>Incuber le calvaire dans 5 mL d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 5 mM contenant 1 mg/mL de BSA dans du PBS, PH 7,4 à 37 °C pendant 15 min sur un agitateur à 300 tr/min.</li>
	<li>Recueillir le digest dans un tube conique de 50 mL. Laver le calvaire avec 5 mL de PBS et ajouter la solution de lavage à la digestion. NOTE: À chaque étape de la collecte de la digestion et du lavage, pipeter les os dans leur solution pour détacher les cellules de l’os et empêcher les doublets et les agrégats cellulaires.</li>
	<li>Pour obtenir la fraction 2, centrifuger le digest à 300 x g à 4 °C pendant 5 min. Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille dans 8 mL de milieu essentiel (MEM) α-minimum contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 100 UI/mL de pénicilline G et 100 μg/mL de streptomycine. Semer sur un plat de culture de 10 cm. Incuber la fraction 2 à 37 °C sous 5 % de CO2.</li>
	<li>Incuber le calvaire dans 5 mL de solution de collagénase à 37 °C pendant 20 min sur un agitateur à 300 rpm.</li>
	<li>Pour collecter la fraction 3, répétez les étapes 2.5\u20122.6. Incuber la fraction 3 à 37 °C sous 5 % de CO2. REMARQUE: À ce stade, les os deviendront plus petits et ils seront réduits en fragments. Pour vous assurer qu’aucun os n’est accidentellement aspiré dans les digestes, ce qui entraîne une perte de cellules dans le processus, utilisez une petite pipette à pointe pour recueillir les digestes (1000 à 2000 μL d’embouts de pipette).</li>
	<li>Incuber le calvaire dans 5 mL de solution de collagénase à 37 °C pendant 20 min sur un agitateur à 300 rpm.</li>
	<li>Pour collecter la fraction 4, répétez les étapes 2.5\u20122.6. Incuber la fraction 4 à 37 °C sous 5 % de CO2.</li>
	<li>Incuber le calvaire dans 5 mL de 5 mM d’EDTA contenant 1 mg/mL de BSA dans du PBS (pH 7,4) à 37 °C pendant 15 min sur un agitateur à 300 rpm.</li>
	<li>Pour collecter la fraction 5, répétez les étapes 2.5\u20122.6. Incuber la fraction 5 à 37 °C sous 5 % de CO2. Les ostéocytes peuvent être préparés pour le tri le même jour ou cultivés jusqu’à 24 heures avant le tri.</li>
</ol>3. Préparation des ostéocytes pour le tri cellulaire activé par fluorescence
<ol><li>Aspirer le milieu de chaque fraction cellulaire et laver doucement avec 10 mL de PBS deux fois.</li>
	<li>Ajouter 5 mL de trypsine-EDTA à 0,5 % dans du PBS et incuber les cellules pendant 5 min à 37 °C. Ajouter 5 mL de FBS à 10 % α-MEM et pipette pour détacher délicatement les cellules. Combiner les cellules de chaque fraction en tamisant une crépine cellulaire de 40 μm dans un tube centrifuge conique de 50 mL.</li>
	<li>Laver les cellules avec 10 ml de PBS et recueillir en tamisant à travers une crépine cellulaire de 40 μm dans un tube à centrifuger conique de 50 ml. Centrifuger les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 5 min.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et ajouter 10% FBS α-MEM à la pastille. Ajuster la concentration cellulaire à environ 1 x 107 cellules/mL.</li>
	<li>Filtrer les cellules dans un tube à mailles en nylon de 35 μm. Les cellules sont maintenant prêtes pour FACS.</li>
	<li>Pour ce protocole, utilisez une buse de 100 μm. Le liquide de collecte doit être composé de 10% de FBS α-MEM. Maintenir l’échantillon trié sous agitation et à 4 °C pendant toute la durée du tri si possible.</li>
	<li>Avant le tri, optimisez les points de contrôle pour supprimer les artefacts et les cellules en ajustant la zone de diffusion latérale (SSC) et la zone de diffusion vers l’avant (FSC). Éliminez les doublets en ajustant la largeur SSC par rapport à la hauteur SSC et la surface FSC par rapport à la largeur FSC. Les ostéocytes GFP négatifs doivent être utilisés comme contrôle pour ajuster les paramètres de l’instrument de tri.</li>
	<li>Une fois la collecte des cellules terminée, centrifuger les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 10 min. Lavez les cellules avec du PBS. Centrifuger les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 5 min.</li>
	<li>Remettez les cellules en suspension et ajustez le nombre comme vous le souhaitez en utilisant 10% FBS α-MEM.</li>
</ol>

<ol><li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+and+death+of+bone+cells%3A+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+osteovision%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li>
<li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li>
<li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Osteocyte%3A+An+Endocrine+Cell+...+and+More%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li>
<li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li>
<li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li>
<li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li>
<li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+Wnt%2F%CE%B2-Catenin+Signaling+Is+Required+for+Normal+Bone+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Osteocyte Wnt/β-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li>
<li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line%2C+MLO-Y4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li>
<li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li>
<li>Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+Osteocytes+in+Their+3D+Native+Matrix+Versus+2D+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).</li>
<li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li>
<li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li>
<li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li>
<li>Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+tumor+characteristic+gene+expression+in+cell+lines+using+a+tissue+similarity+index+%28TSI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).</li>
<li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dentin+matrix+protein+1+expression+during+osteoblastic+differentiation%2C+generation+of+an+osteocyte+GFP-transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene.</a> Bone. 35 (1), 74-82 (2004).</li>
<li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li>
<li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li>
<li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology.</a> Bone. 54 (2), 296-306 (2013).</li>
<li>Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li>
<li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHalleux%2C+C+%22Bone+Research+Protocols%22">Bone Research Protocols</a>. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana Press. 55-66 (2012).</li>
<li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedizinische+Technik+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le premier ostéocyte isolé provenait d’un poulet calvaria7 isolé à l’aide de (OB7.3) ou de la variante aviaire de PHEX; Cependant, cette méthode est limitée par la disponibilité d’anticorps exploitables, car des anticorps spécifiques aux ostéocytes qui sont également spécifiques à l’espèce doivent être fabriqués. Les chercheurs ont utilisé une modification différente du processus enzymatique séquentiel pour obtenir des ostéocytes à partir d’os longs de souris et de rats; La pureté déclarée de ces ...

Les ostéocytes sont des cellules terminales différenciées des progéniteurs ostéoblastiques qui se sont intégrés dans leur matrice sécrétée1. Ce sont les cellules les plus abondantes et les plus anciennes parmi les populations de cellules osseuses. Ils résident dans des lacunes et ont une morphologie stellaire caractéristique avec des dendrites qui s’étendent à travers des canaux appelés canalicules formant un vaste réseau de communication et d’échange métabolique avec leur environnement et la surface osseuse2. Les ostéocytes chorégraphient à la fois les rôles des ostéoblastes et des ostéoclastes dans le remodelage osseux, ils sont les cellules mécanosensorielles primaires conférant une adaptation à la charge mécanique3, sont impliqués dans l’homéostasie phosphate4 et la minéralisation de la matrice osseuse5, et avec le système lacunocanaliculaire, ils agissent comme un organe endocrinien signalant des tissus distants6.
Les ostéocytes sont situés dans une matrice minéralisée, ce qui limite l’accessibilité et rend leur isolement difficile, entravant ainsi l’investigation in vitro. L’une des premières méthodes d’isolement a décrit des ostéocytes isolés du calvaire de poulet à l’aide d’un anticorps monoclonal spécifique aux ostéocytes (OB7.3)7 qui a été connu plus tard pour être la variante aviaire de PHEX (gène régulateur de PHosphate avec homologie aux endopeptidases sur le chromosome X)8. D’autres chercheurs ont utilisé la digestion séquentielle d’os longs de rat 9 ou de souris 10 pour obtenir des fractions riches en ostéocytes dans lesquelles la pureté des ostéocytes était d’environ70%9. Les limites de cette procédure comprennent la pureté sous-optimale des cultures contaminées par d’autres types de cellules que les ostéocytes et le fait que les ostéocytes pourraient être potentiellement envahis par d’autres cellules en culture puisque les ostéocytes ont perdu la capacité de se diviser. Ces défis limitent la facilité d’utilisation des cultures à long terme.
Pour surmonter ces limitations, différentes lignées cellulaires ostéopacytaires ont été développées. La lignée cellulaire MLO-Y411 et la lignée cellulaire MLO-A512 sont notamment les lignées cellulaires les plus étudiées qui sont utiles pour l’étude des ostéocytes à un stade précoce; cependant, ils sont moins utiles pour étudier la signalisation des ostéocytes matures car ils expriment de faibles niveaux de sclérostine et de FGF2313, qui sont tous deux des marqueurs ostéocytes matures. D’autres lignées cellulaires, y compris IDG-SW3 14 et Ocy45415, expriment des niveaux élevés de sclérostine et de FGF23 et sont utiles pour étudier le stade ostéocytaire tardif. Les lignées cellulaires s’avèrent être des outils de recherche utiles; Néanmoins, ils ne viennent pas sans limites car ils ne représentent pas pleinement la biologie de la cellule primaire. Différentes lignées cellulaires représentent différents stades de développement du spectre de maturité des ostéocytes, et les lignées cellulaires ne parviennent pas à représenter l’hétérogénéité des ostéocytes primaires16,17.
Pour obtenir des cultures pures d’ostéocytes primaires, les chercheurs ont tiré parti du modèle murin cre dans lequel le promoteur dmp1 de 8 kb est utilisé pour stimuler l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) dans les ostéocytes18,19. Des souris transgéniques doubles (pOB-Col 2.3- GFP-cyan et DMP1-GFP-topaz) de Paic et al.19 et des souris transgéniques dmp1-topaze de Nakashima et al.20 ont été utilisées pour obtenir des populations d’ostéocytes. Dans lequel ils ont utilisé la digestion séquentielle et le FACS des ostéocytes exprimant la GFP pour acquérir des cultures d’ostéocytes primaires19,20. La direction de cre chez la souris rapporteure dmp1 de 10 kb Ai9, qui active la protéine tdTomato, s’est avérée présente dans les ostéocytes, les ostéoblastes, les muscles et les cellules de la moelle osseuse. Le promoteur dmp1 de 8 kb avait le même schéma d’expression, mais seule une proportion d’ostéoblastes et de cellules de moelle osseuse exprimait la protéine, ce qui indique que le promoteur dmp1 de 8 kb est plus spécifique21. Malgré cela, les résultats obtenus à l’aide du promoteur dmp1 de 8 kb doivent être interprétés avec prudence, et les profils d’expression génique doivent être systématiquement réalisés à l’aide de marqueurs spécifiques aux ostéocytes par rapport aux ostéoblastes pour s’assurer que la population obtenue est d’une pureté suffisamment élevée.
Les marqueurs ostéoclastes OSCAR et Dcstamp ont été trouvés dans des populations d’ostéocytes hématopoïétiques non appauvris vs appauvris, cette découverte a conduit les auteurs à conclure que les digestions obtenues par fractionnement de calvaire néonatal dmp1-topaze de 8 kb et le tri GFP sont contaminés par des cellules hématopoïétiques. La contamination par les cellules hématopoïétiques aurait pu être atténuée en resserrant la porte de tri de la GFP puisque les cellules hématopoïétiques GFP positives avaient une intensité de GFP raisonnablement inférieure à celle des cellules mésenchymateuses (ostéocytes) GFP-positives22.
Les méthodes d’étude des ostéocytes in vitro ont contribué à la richesse récente des informations sur la biologie des ostéocytes. Cependant, l’isolement des ostéocytes reste une procédure longue et laborieuse avec de faibles rendements cellulaires. La méthode décrite de digestion osseuse utilisant la collagénase et l’EDTA souvent jusqu’à la fraction 823, prend plusieurs heures au cours desquelles la viabilité des ostéocytes est taxée. Des chercheurs ont rapporté utiliser des fractions (2\u20125) pour le tri cellulaire 20, et ont montré que le profil d’expression des gènes associés aux ostéocytes par rapport à ceux des ostéoblastes confirme le succès de l’isolement des populations d’ostéocytes purs20. Dans cet article, nous décrivons le processus d’obtention des fractions (2\u20125), et nous comparons le rendement des ostéocytes de chaque fraction en commençant par la fraction 1 à 8 pour déterminer le retour des ostéocytes dans chaque fraction. Nous décrivons également la dissection du calvaria de souris dmp1-topaze nouveau-née et la digestion calvariaire à l’aide de collagénase et d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), ainsi que la préparation de cellules pour FACS.

<table><tbody><tr><td>BD FACSDiva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Acquisition et analyse de données</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>Tube de 12 x 75 mm avec capuchon de crépine de cellule, 35 &mu ; Maille en nylon M.</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, MO, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Wako, Osaka, Japon</td><td>034-22363</td><td>0,2 % (p/v), mélange brut de collagénase provenant de C. histolyticum.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japon</td><td></td><td>5 mM d’EDTA préparé avec 0,1 % de BSA</td></tr><tr><td>FACSAriaTM II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Biowest, Nuaill&eacute ;, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td> d’isolement <td>70 mM NaCl, 10 mM NaHCO, 60 mM de sorbitol, 3 mM K2HPO4, 1 mM CaCl2, 0,1 % (p/v) BSA, 0,5 % (p/v) de glucose et 25 mM HEPES</td></tr><tr><td>Millex Unité de filtre stérile</td><td>Merck Millipore, Irlande</td><td>SLGV033RS</td><td>0,22&mu ; m</td></tr><tr><td>Crépine à cellules en nylon</td><td>FALCON, NY, USA</td><td></td><td>40&mu ; m</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies, NY, États-Unis</td><td></td><td>0,5 % x10. dilué à x1 dans du PBS</td></tr><tr><td>&alpha ;-MEM</td><td>Wako, Osaka, Japon</td><td></td><td>Contenant 10 % de sérum fœtal bovin, 100 UI/ml de pénicilline G et 100 &mu ; g/ml de streptomycine</td></tr></tbody></table>

obtention d’ostéocytes primaires par fractionnement calvariaire murin d’ostéocytes exprimant la gfp

Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

L’ostéocytes, autrefois considéré comme un résident passif de l’os étant donné la fonction de détection de la charge mécanique en coulisses, est maintenant mis en lumière et a été montré pour avoir de multiples fonctions majeures comme la modification active de la matrice extracellulaire et la formation d’un organe endocrinien avec le système lacunocanaliculaire qui l’entoure envoyant des messages à des sites distants. Grâce aux méthodes qui ont permis de tester l’ostéocyte in vitro à partir d’ostéocytes primaires isolés en lignées cellulaires de type ostéocytes, les ostéocytes connaissent aujourd’hui un intérêt retentissant et une vague de connaissances sur la structure et la fonction. De nombreux aspects de la biologie des ostéocytes et de l’interaction avec d’autres composants moléculaires restent à découvrir. Dans ce protocole, nous décrivons en détail l’isolement efficace des ostéocytes primaires à partir du calvaire néonatal de souris dmp1-topaze, qui expriment la protéine fluorescente verte dans les ostéocytes, par fractionnement cellulaire et acquisition ultérieure de cultures d’ostéocytes primaires par FACS.

Le but de ce protocole est de démontrer le processus d’obtention de cultures d’ostéocytes primaires à partir de calvaire de souris néonatale dmp1-topaze par un processus de fractionnement utilisant la collagénase pour dégrader la matrice de collagène et l’EDTA pour la chélation du calcium, après quoi les cellules sont préparées pour FACS afin de séparer les ostéocytes des autres populations cellulaires.
Les méthodes d’obtention des ostéocytes primaires du calvaire de souris néonatale décrivent...

Ce protocole décrit la dissection du calvaire néonatal de souris dmp1-topaze et l’isolement des ostéocytes exprimant la protéine fluorescente verte par digestion et fractionnement cellulaire, en plus de la préparation des ostéocytes pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).

Obtention d’ostéocytes primaires par fractionnement calvariaire murin d’ostéocytes exprimant la GFP

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

L’isolement primaire des ostéocytes est une procédure longue qui laisse souvent de côté dans les zones à faibles cellules. Ce protocole fournit des méthodes efficaces pour isoler un grand nombre d’ostéocytes primaires exprimant la GFP. Ce protocole réduit le temps de manipulation et permet d’obtenir un plus grand nombre d’ostéocytes en une seule procédure avec une contamination minimale par des cellules hématopoïétiques ou mésenchymateuses.Pour isoler les ostéocytes exprimant la GFP, placez des bébés souris transgéniques euthanasiés, après la naissance, du sixième au septième jour dans une boîte de culture non traitée, et utilisez des ciseaux et une pince à épiler pour saisir la peau à la base de votre crâne. Utilisez les ciseaux pour faire une première incision dans la peau soulevée, suivie de coupures le long des deux côtés du crâne devant les oreilles. Retirez la peau pour exposer le calvaria et en tenant la tête de l’arête nasale, coupez le calvaria le long de la suture loboïde et le long des bords des os pariétaux jusqu’à la partie frontale du tissu.Séparez la calvaria du tissu cérébral sous-jacent et placez les os côté concave vers le haut dans le PBS. Pour obtenir la fraction un, mettez en commun jusqu’à cinq calvarias par tube de 50 millilitres dans cinq millilitres de collagénase fraîchement préparée de deux milligrammes par millilitre, et incubez les tissus à 37 degrés Celsius et 300 tours par minute pendant 20 minutes. À la fin de l’incubation, jetez le digestat de la première fraction et lavez la calvaria avec cinq millilitres de PBS.Remplacez le lavage par cinq millilitres d’EDTA de cinq millimolaires complétés par un milligramme par millilitre d’albumine sérique bovine dans du PBS pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius en secouant. À la fin de l’incubation, transférez le digestat dans un tube conique de 50 millilitres et lavez la calvéria avec cinq millilitres de PBS. Transférez ensuite la solution de lavage dans le digestat.Pour obtenir la fraction deux, placez le digestat pour la centrifugation et jetez le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans huit millilitres de milieu essentiel alpha-minimum contenant 10 % de sérum de veau fœtal, ou FBS, et des antibiotiques, et ensemencez les cellules dans une boîte de culture de 10 centimètres. Placez ensuite la fraction de deux cellules dans l’incubateur de culture cellulaire.Après avoir collecté et cultivé les fractions trois et quatre, comme nous venons de le démontrer. Incuber la calvérie dans cinq millilitres d’EDTA de cinq millimolaires complétés par un milligramme par millilitre d’albumine sérique bovine dans du PBS pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius en secouant. À la fin de l’incubation, prélever et cultiver la fraction cinq comme démontré pour les fractions deux, trois et quatre.Immédiatement après le fractionnement, récupérez les cellules pour le tri. Alternativement, prélevez les cellules après 24 heures de culture en aspirant le milieu et lavez doucement les cellules deux fois avec 10 millilitres de PBS par plat et par lavage. Après le deuxième lavage, traitez les cellules avec cinq millilitres de 0,5 % de tripsin EDTA en PBS par plaque.Après cinq minutes à 37 degrés Celsius, ajoutez cinq millilitres de milieu essentiel alpha minimum complet dans chaque plaque et détachez doucement les cellules avec un pipetage. Pour combiner les cellules dans chaque fraction, filtrez les suspensions de cellules à travers une crépine de cellules de 40 microns dans un seul tube de centrifugation conique de 50 millilitres. Après avoir lavé les cellules avec 10 millilitres de PBS, ajoutez-les dans le tube.Filtrez les cellules à travers une crépine et collectez les cellules par centrifugation. Une fois que les cellules sont granulées, remettez en suspension la pastille dans un milieu essentiel minimal complet à une fois 10 à 10 à la septième cellules par millilitre de concentration de milieu et filtrez les cellules à travers un tube recouvert d’un maillage en nylon de 35 microns. Pour tester l’efficacité de cette méthode, les fractions ont été triées séparément et cultivées pendant 24 heures afin de déterminer le pourcentage et le rendement des ostéocytes de chaque fraction.La densité des ostéocytes dans les fractions deux à cinq était supérieure à celle observée pour la fraction un et a diminué remarquablement dans les fractions six, sept et huit. Bien que le pourcentage d’ostéocytes obtenu entre toutes les fractions ne soit pas statistiquement significatif, la densité des ostéocytes diffère considérablement entre les fractions. Ici, la stratégie de contrôle pour isoler les ostéocytes positifs à la GFP de leurs homologues négatifs par tri cellulaire activé par fluorescence est présentée.Après le tri, les ostéocytes peuvent être analysés pour l’expression de marqueurs ostéocytaires d’intérêt. Dans cette analyse, les gènes marqueurs ostéocytaires ont été exprimés à des niveaux plus élevés dans les ostéocytes isolés positifs à la GFP par rapport à la fraction de tri deux, connue sous le nom de fraction ostéoblastique élevée. Ici, la morphologie d’un ostéocyte positif à la GFP conservant une forme étoilée avec des dendrites s’étendant du corps cellulaire après 24 heures de culture sur une boîte de culture en plastique, post sort, peut être observée.Faites attention lorsque vous aspirez les digests car la calvéria sera réduite en minuscules granulés. N’oubliez pas d’utiliser un petit aspirateur à pointe pour éviter la perte de cellules. Les ostéocytes ont été énigmatiques parce qu’ils sont enterrés dans l’os.Cette technique a ouvert la voie à l’étude des interactions moléculaires entre les ostéocytes et de leur contrôle sur les ostéoclastes et les ostéoblastes.

obtaining-primary-osteocytes-through-murine-calvarial-fractionation

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

La mesure quantitative de la fonction progénitrices de l'os dans la guérison des fractures nécessite haute résolution technologie d'imagerie de série. Ici, les protocoles sont fournies à l'aide de la microscopie intravitale suivi et l'ostéo-lignée pour quantifier séquentiellement l'image et la migration, la prolifération et la différenciation des cellules souches / progénitrices ostéogéniques endogènes dans le processus de réparation de fracture osseuse.

Séquentiel<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des cellules souches / progénitrices ostéogéniques lors de la réparation de la fracture

Traitement des ostéoblastes primaires de souris avec de l'acide rétinoïque produit une population homogène de cellules ramifiés portant des caractères morphologiques et moléculaires des ostéocytes. La méthode permet de surmonter la difficulté d'obtenir et de maintenir ostéocytes primaires en culture, et peut être avantageux d'étudier les cellules dérivées de modèles transgéniques.

Application de l&#39;acide rétinoïque pour obtenir des cultures de ostéocytes de primaires ostéoblastes de souris

La nature des interactions entre les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices (HSPCs) et les niches de la moelle osseuse est mal comprise. Mesure des modifications de matériel et un protocole d'acquisition en plusieurs étapes permettent l'utilisation de deux photons et la microscopie confocale à l'image ex vivo des HSPCs marqués hébergés dans les zones de la moelle osseuse, les interactions de suivi et mouvement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Les ostéoclastes sont des cellules du capital de résorption osseuse dans le corps. Une capacité à isoler les ostéoclastes en grand nombre a conduit à des avancées significatives dans la compréhension de la biologie des ostéoclastes. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour l'isolement, la culture et la quantification de l'activité des ostéoclastes in vitro.

Ostéoclastes Dérivation de moelle osseuse de souris

Dans cet article, nous présentons des méthodes pour isoler et de différencier les cellules stromales de la moelle osseuse et de cellules souches hématopoïétiques des os longs de souris. Deux protocoles différents sont présentés agronomiques différentes populations cellulaires appropriées pour l’expansion et la différenciation dans les ostéoblastes, les ostéoclastes et les adipocytes.

Isolement, Culture et différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse et les ostéoclastes progéniteurs de souris

Les ostéoclastes sont des polycaryons macrophages spécifiques aux tissus dérivés de la lignée monocyte-macrophages des cellules souches hématopoïétiques. Ce protocole décrit comment isoler les cellules de la moelle osseuse afin que de grandes quantités d’ostéoclastes soient obtenues tout en réduisant le risque d’accidents que l’on retrouve dans les méthodes traditionnelles.

Isolement, purification et différenciation des précurseurs d’Ostéoclast de la moelle osseuse de rat

Ce protocole décrit la détection de la migration des cellules souches squelettiques périostées médiées par CCL5 en temps réel à l’aide de la microscopie intravitale d’animaux vivants.

Imagerie en temps réel de la migration induite par CCL5 de cellules souches squelettiques périostées chez la souris

Nous décrivons ici la méthode d’imagerie des mégacaryocytes et des proplaquettaires dans la moelle de l’os du crâne de souris vivantes en utilisant la microscopie à deux photons.

In Vivo Imagerie à deux photons de mégacaryocytes et de proplaquettaires dans la moelle osseuse du crâne de souris

Le présent article décrit la mise en œuvre d’une approche d’imagerie intravitale pour observer la signalisation calcique induite mécaniquement des ostéocytes intégrés in vivo en temps réel en réponse à la charge mécanique au niveau tissulaire du troisième métatarsien de souris.

Une approche d’imagerie intravitale fluorescente pour étudier la dynamique de la signalisation calcique induite par la charge dans les ostéocytes de souris

Cette étude décrit la méthode de visualisation et de développement de modèles tridimensionnels (3D) d’ostéocytes au sein du réseau lacunaire-canaliculaire (LCN) pour l’analyse de la dynamique des fluides numérique (CFD). Les modèles générés à l’aide de cette méthode aident à comprendre la mécanosensation des ostéocytes dans les os sains ou malades.

Analyse et imagerie des ostéocytes

La microscopie intravitale permet d’étudier des processus biologiques dynamiques tels que la régénération tissulaire et le développement tumorale. La moelle osseuse calvaire, un tissu très dynamique, offre des informations sur l’hématopoïèse et la fonction vasculaire. L’utilisation d’un implant de fixation de la tête biocompatible imprimé en 3D permet une imagerie longitudinale répétitive, améliorant ainsi notre compréhension de la dynamique des tissus et du microenvironnement tumoral.

Imagerie longitudinale intravitale de la dynamique vasculaire dans la moelle osseuse calvaire

Découvrez une méthode efficace d'isolation d'ostéocytes primaires GFP+ à partir de souris dmp1-topaz. Ce protocole réduit le temps de manipulation et maximise le rendement cellulaire avec une contamination minimale.

Obtention d’ostéocytes primaires par fractionnement calvariaire murin d’ostéocytes exprimant la GFP

Explorer plus de vidéos