Imagerie d’animaux entiers de Drosophila melanogaster à l’aide de la tomographie microcalculée

Ce protocole permet l’imagerie non destructive d’une résolution micronique intacte ou molle. Il peut être utilisé pour comprendre les mécanismes de la physiologie, de l’anatomie et du développement des animaux. Parce que les mouches sont imagées dans un état intact sans qu’il soit nécessaire de dissection tissulaire, l’architecture spatiale des tissus et des organes est maintenue dans leur état d’origine et est facilement observée.

La microtomodensitométrie est un outil idéal pour les études visant à modéliser les maladies humaines chez les mouches, ou pour comprendre les défauts de développement qui affectent la qualité de vie. Il s’est également avéré utile dans d’autres disciplines, telles que l’ingénierie, la physique, la science des matériaux, la géologie et l’anthropologie. Après avoir sélectionné le point de développement d’intérêt pour l’imagerie, transférez 5 à 20 animaux dans un millilitre de PBST dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre, et incubez le tube pendant cinq minutes à température ambiante avec des tapotements périodiques pour aider à l’élimination du revêtement hydrophobe et permettre aux animaux d’être complètement immergés.

À la fin de l’incubation, remplacez le PBST par un millilitre de solution Bouin et tapotez le tube pour immerger complètement les mouches. Pour les échantillons de larves et de nymphes, après une incubation de deux heures à température ambiante, laver les animaux trois fois pendant cinq minutes et un millilitre de PBS frais par lavage. Après le dernier lavage, transférez les échantillons dans une boîte de dissection multi-puits contenant du PBS frais par puits sous un microscope à dissection, et utilisez une petite épingle minutien fixée à un support pour percer un trou dans la cuticule antérieure et postérieure de chaque échantillon, en prenant soin de ne pas perturber les tissus mous sous-jacents.

Après avoir pénétré les cuticules, incubez les échantillons dans un millilitre de solution fraîche de Bouin dans un nouveau tube de 1,5 millilitre pendant 24 heures à température ambiante avant de laver l’échantillon trois fois pendant 30 minutes et un millilitre d’un tampon de lavage micro CT par lavage. Après le dernier lavage, ajoutez un millilitre de la solution de coloration appropriée dans le tube et incubez les échantillons à température ambiante pendant deux à sept jours. S’il est nécessaire de conserver l’image plus longtemps, déshydrater les échantillons de la série ascendante d’éthanol dans un millilitre d’éthanol pendant une heure par concentration indiquée, afin de préparer les échantillons pour le séchage au point critique.

Pour monter des échantillons séchés à des points critiques, placez les échantillons dans des tubes capillaires en plastique ou en verre avant de monter les tubes sur le support de platine rotatif. Pour le montage d’échantillons hydratés, remplissez une pointe de pipette P10 avec de l’eau et fixez l’extrémité étroite avec un film de paraffine. À l’aide d’une pince, transférez un seul échantillon dans la pointe de la pipette et utilisez un objet long et mince pour enfoncer délicatement l’échantillon dans la pointe jusqu’à ce qu’il entre en contact avec la paroi de la pointe pour maintenir l’échantillon en place.

Après avoir recouvert l’extrémité ouverte de la pipette, montez la pipette P10 sur un support conçu pour s’adapter à la cale de la platine rotative. Pour la numérisation, cliquez sur l’icône Porte ouverte dans le logiciel du scanner pour accéder à la cale de platine rotative et serrez le collier autour de la base du porte-échantillon pour fixer l’échantillon. Réglez les paramètres de balayage dans le logiciel pour une résolution et un contraste optimaux, puis cliquez sur Options et Source de rayons X pour ouvrir le contrôle de l’alimentation de la source de rayons X.

Utilisez les barres coulissantes pour régler la tension des rayons X sur 30 à 40 kilovolts et le courant sur 100 à 110 microampères pour produire un faisceau de rayons X d’une puissance de trois à quatre watts et d’un petit spot. Pour définir le nombre d’images de projection à acquérir pendant les numérisations, sélectionnez Options et Modes d’acquisition pour régler le temps d’exposition de l’appareil photo sur 500 à 800 millisecondes et utilisez la barre de défilement pour définir la taille de pixel de l’image souhaitée en fonction des paramètres et de la position de l’appareil photo. Cliquez et faites glisser le curseur sur la barre coulissante pour déplacer l’échantillon le long de sa trajectoire de rotation à 360 degrés, en maintenant l’échantillon dans le champ de vision.

Cliquez sur l’icône Commencer l’acquisition. Une boîte de dialogue s’affiche pour permettre de définir des paramètres de balayage supplémentaires. Nommez le fichier et le dossier de sortie dans lequel l’analyse sera enregistrée.

Réglez le mouvement aléatoire sur 10 et la moyenne sur quatre à six images. L’étape de rotation sera automatiquement calculée en fonction des paramètres de l’appareil photo utilisés, puis cliquez sur OK pour commencer l’acquisition. Une boîte de dialogue indiquant le temps de balayage s’affiche et le scanner commence à acquérir une série d’images de projection de l’échantillon le long de la trajectoire de rotation.

Pour générer les tomogrammes, ouvrez les images de projection dans le logiciel de reconstruction et sélectionnez l’algorithme de correction de décalage pour effectuer un alignement initial de l’image. Sélectionnez la valeur la plus élevée qui aligne correctement les images de projection et cliquez sur Réglage fin pour affiner chaque paramètre de reconstruction. Une série d’aperçus sera générée qui peut être utilisée pour sélectionner les valeurs correctes.

Vérifiez que les valeurs de paramètre optimales sont affichées dans l’onglet Paramètres et, dans l’onglet Sortie, ajustez les paramètres du fichier tels que la profondeur de bits, le nom du fichier et le dossier dans lequel les données seront enregistrées. Une région d’intérêt peut être utilisée pour reconstruire uniquement les structures d’intérêt. Si plusieurs reconstructions sont nécessaires, cliquez sur Démarrer et Ajouter au lot pour ajouter l’image actuelle au gestionnaire de lots et répéter la reconstruction pour les images restantes.

Pour l’analyse morphométrique des images reconstruites, sous l’onglet Segment, dans un logiciel d’analyse morphométrique approprié, cliquez sur Basique et Nouveau, donnez un nouveau nom à l’image et sélectionnez une couleur appropriée. Cochez la case Définir la plage et ajustez le curseur pour ajuster la plage de seuil qui englobe la structure d’intérêt. Pour peindre une zone définie par le seuil, maintenez la touche Ctrl enfoncée tout en maintenant la touche gauche de la souris enfoncée.

Pour supprimer une zone, maintenez la touche Maj enfoncée tout en maintenant la touche gauche de la souris enfoncée. Assurez-vous que les mesures de la région de maillage d’intérêt sont affichées dans le panneau d’information pour l’analyse morphométrique de base. Effectuez le rendu de l’objet maillé et de l’image du tomogramme dans son intégralité, puis visualisez l’image résultante en 3D, puis cliquez avec le bouton droit de la souris pour sélectionner Afficher Movie Maker afin de générer une vidéo de l’objet à l’aide d’images individuelles à partir du visualiseur.

Sur ces images, on peut observer un embryon, une larve du troisième stade, une chrysalide au stade adulte et une mouche femelle adulte colorée à l’iode et photographiée dans l’eau à l’aide d’un scanner de paillasse commercial. Une excellente conservation et une coloration uniforme des tissus délicats sont apparentes, ce qui permet d’identifier facilement tous les principaux organes. Ici, une comparaison de la même tête de mouche adulte, acquise à la fois en mode de balayage de projection lente et rapide, est présentée.

Il est important de noter que, bien que la résolution des images lentes soit plus élevée, l’analyse morphométrique ne diffère pas entre les balayages lents et rapides. À l’aide du logiciel de rendu, tout système de tissu ou d’organe d’intérêt peut être segmenté et utilisé pour l’analyse morphométrique et la visualisation 3D. Sur ces images, on peut observer l’abdomen d’une mouche coloré à l’acide phosphotungstique et imagé pendant qu’il était hydraté dans l’eau ou après un séchage au microscope à rayons X.

En utilisant l’acide phosphotungstique, les cellules épithéliales individuelles de l’intestin moyen et les faisceaux de spermatozoïdes dans les testicules sont facilement résolues. Alors que les images de séchage du point critique montrent une résolution légèrement accrue par rapport à l’échantillon hydraté, une meilleure préservation de l’ultrastructure des tissus délicats est obtenue avec des échantillons hydratés, tels que les cellules graisseuses près de la cuticule. Pour une résolution optimale, limitez les mouvements de l’échantillon et les vibrations excessives.

Pour cela, il est essentiel de fixer l’échantillon sur la scène, bien que la créativité et l’ingéniosité puissent être nécessaires pour y parvenir. Des méthodes d’imagerie supplémentaires, telles que la microscopie optique et électronique, peuvent être utilisées dans le cadre d’un flux de travail d’imagerie afin de comprendre une mutation génétique donnée de l’échelle nanométrique à l’organisme entier.