Name: Isolement et culture myofiber uniques à partir d’un modèle murin de la dystrophie musculaire Emery-Dreifuss dans le développement post-natal précoce (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Découvrez l'isolement de myofibres uniques chez des souris modèles de la dystrophie musculaire d'Emery-Dreifuss. Cette méthode permet d'étudier les cellules satellites et la régénération musculaire au cours du développement postnatal précoce.

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Nous remercions Andrea Bianchi, le Réseau italien de Laminopathies et les membres du laboratoire pour le soutien et tous les commentaires constructifs. Nous sommes reconnaissants à Chiara Cordiglieri pour l’aide précieuse au microscope confocal. Les auteurs remercient la Dre Béatrice Biferali pour son aide dans la prise de photos pour les chiffres. Le travail présenté ici a été soutenu par My First AIRC Grant n. 18535, AFM-Téléthon n. 21030, le ministre italien de la Santé n. GR-2013-02355413 et Cariplo 2017-0649 à C.L. C.M. est soutenu par My First AIRC grant n.18993 et AFM-Téléthon n. 22489.

Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées sous l’approbation éthique du Ministère italien de la santé et du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (autorisation n. 83/2019-PR). Les animaux ont été maintenus dans un établissement autorisé à l’hôpital San Raffaele, Milan, Italie (autorisation n. N. 127/2012-A).
1. Dissection musculaire et culture myofiber
<ol><li>Préparation de l’équipement.<ol>
<li>Avant de commencer, préparer toutes les solutions nécessaires telles que décrites dans le tableau 1. Ces solutions doivent être préparées fraîchement.</li>
		<li>Nettoyez toutes les surfaces et les outils qui seront utilisés pendant la procédure avec 70% d’éthanol.</li>
		<li>Avant de commencer par le sacrifice des souris, effectuer le revêtement de 100 mm et 35 mm petri plats à l’aide de sérum de cheval (HS). Enrober tous les plats pour empêcher les myofibers de s’attacher au plastique. Envisagez d’utiliser un plat de 100 mm et quatre plats de 35 mm par souris.</li>
		<li>Après avoir enlevé l’excès de SH, conserver les plats enrobés dans un incubateur à 37 °C pendant 30 min. Remplissez-le ensuite d’une solution de lavage ou d’un milieu de culture (deux plats de 35 mm par souris). REMARQUE : Alternativement, une solution de 10 % de HS dans le milieu modifié de l’Aigle (DMEM) de Dulbecco peut être utilisée pour enrober les plats. Utilisez toujours des plats enrobés. Il est possible d’utiliser des plats de culture de différentes tailles, mais les petits plats Petri de dimension sont recommandés.</li>
		<li>Pour l’isolation des fibres, préparez des pipettes Pasteur stériles comme le montre la figure 2. Pour chaque souris préparer une pipette de forage grand trou pour la manipulation musculaire et la désagrégation mécanique (Figure 2A) et une pipette petit trou pour la sélection des fibres (Figure 2B). Couper chaque pipette en verre, éventuellement à l’aide d’un stylo diamant, sur la longueur désirée et les bords lisses de la pipette sur une flamme.</li>
		<li>Enrober chaque pipette en la mouillant brièvement avec du SH avant utilisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Sacrifice de souris et dissection musculaire<ol>
<li>Préchauffer la solution de digestion à température ambiante pendant 10 min avant de commencer la procédure de dissection. Les tubes à fond rond FACS en polypropylène sont les contenants les plus appropriés à cet effet.</li>
		<li>Immédiatement avant le début de la récupération musculaire, sacrifier la souris selon la recommandation nationale appropriée IACUC.</li>
		<li>Mouiller son bas du corps avec 70% d’éthanol avant de couper la peau pour faciliter l’enlèvement des cheveux.</li>
		<li>Mettez la souris dans une position couchée sur un support de polystyrène recouvert de papier d’aluminium et coupez la peau à partir du milieu du dos longitudinalement et dans la direction des jambes.</li>
		<li>Retirez soigneusement la peau sans toucher les muscles et les tendons. Il est possible d’arracher toute la peau.</li>
		<li>Couper les deux pattes de la souris et procéder rapidement à la dissection. REMARQUE : S’il est plus confortable, il est possible de poursuivre la dissection sur l’ensemble de la souris, mais travailler sur la jambe permet plus de mobilité et de précision dans les coupes ultérieures.</li>
		<li>Fixer la jambe sur le support au niveau du pied à l’aide d’une broche et commencer à isoler les muscles squelettiques d’intérêt dans cet ordre: TA, EDL, Gastrocnemius et Soleus.</li>
		<li>Soulevez le tendon inférieur de TA avec une pince à épiler forte à hauteur de cheville et coupez-le, puis coupez-le avec des ciseaux fins tout autour du muscle TA à l’autre tendon au niveau de la rotule (Figure 3A). Transférer dans la solution de digestion.</li>
		<li>Soulevez le tendon inférieur de l’EDL et séparez-le des autres muscles en le tirant doucement vers le haut jusqu’à l’autre tendon. Coupez-le et placez-le dans la solution de digestion. REMARQUE : Étant donné que l’EDL peut être extrêmement petit à couper séparément de l’AT, ils peuvent être disséqués ensemble (figure 3B). Ensuite, si le muscle entier est trop grand, coupez-le en 2-3 morceaux à partir du tendon et en suivant les fibres dans une direction longitudinale (Figure 3C).</li>
		<li>Faire pivoter la jambe montrant les muscles du dos et fixer le pied à l’aide de la broche. Soulevez le tendon de l’Achille, Gastrocnemius se séparera automatiquement des autres muscles. Le tendon supérieur est à l’arrière de la rotule. Coupez-le et ajoutez le muscle à la digestion.</li>
		<li>Soulevez le tendon externe de la jambe (par rapport au corps) et obtenez le Soleus. Séparez-le doucement des autres muscles en faisant défiler sous la pince à épiler.</li>
		<li>Faites de même pour l’autre jambe (étapes de 1.2.7. à 1.2.11.).</li>
	</ol></li>
	<li>Digestion musculaire<ol>
<li>Incuber la solution de digestion contenant tous les muscles d’un bain d’eau à 37 °C pendant environ 45-50 min. Pendant la digestion, vérifiez régulièrement le muscle pour éviter la sur digestion. Toutes les 10 minutes inversent les tubes de digestion 10x avec un mouvement énergétique (éviter le vortex).</li>
		<li>Arrêter la digestion lorsque les muscles commencent à se desserrer et les myofibers sont visibles.</li>
		<li>À la toute fin du temps de digestion secouer les échantillons.</li>
		<li>Pour arrêter la digestion, transférer soigneusement la suspension de digestion dans une boîte de Pétri préchauffée de 100 mm avec 10 mL de solution de lavage. NOTE : Évitez la sur digestion musculaire car cela se traduira inévitablement par l’isolement des myofibers hyper-contractés. Habituellement avec ce protocole, les muscles des souris mutantes homozygotes prennent 45 min à digérer, tandis que les muscles des souris de type sauvage prennent 50-55 min. Le temps de digestion doit être validé expérimentalement.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolement des myofibers uniques<ol>
<li>Isoler d’abord les fibres déjà dissociées sous un microscope à dissection en les choisissant individuellement avec une pipette P200 enduite ou un petit trou Pasteur et les transférer du Petri de 100 mm dans une nouvelle boîte de Pétri de 35 mm avec 5 mL de solution de lavage préchauffée.</li>
		<li>Pour libérer d’autres myofibers, pipette le muscle de haut en bas à l’aide d’un grand trou portait pipette en verre avec milieu chaud, jusqu’à ce que les fibres sont libérés mécaniquement. Ne soyez pas trop persistant car cela se traduira par des fibres dommageables.</li>
		<li>Continuer à libérer les myofibers du muscle jusqu’à ce que le plat contienne une quantité souhaitable. Si la boîte de Pétri est conservée à température ambiante pendant plus de 8 min, arrêtez-vous et effectuez une incubation d’au moins 5 min à 37 °C, 5 % de CO2 pour rééquilibrer le milieu.</li>
		<li>Avant de transférer les myofibères simples au milieu de culture, laissez-les à 37 °C, 5% de CO2 dans le plat de lavage pendant au moins 1 h. Cela aide les myofibers à s’adapter à l’état in vitro. REMARQUE : Les myoibers adultes sont moins sensibles au stress et peuvent être lavés ~ 2-3x. Cependant, dans cet état (à 19 jours d’âge postnatal), il est préférable d’effectuer seulement une étape de lavage pour empêcher des dommages de myofiber. Par conséquent, toujours faire attention à garder les myofibers sélectionnés suffisamment propre en ne transportant pas de débris ou de fibres hypercontractées.</li>
	</ol></li>
	<li>Culture myofiber unique<ol>
<li>Transférer les myoibers individuels dans un nouveau plat préchauffé avec le milieu de culture approprié (milieu sérique élevé pour permettre l’activation des cellules satellites, voir la figure 1).</li>
		<li>Changez le milieu pour les myofibers isolés, en les transférant dans un nouveau plat enrobé avec un nouveau milieu de culture, seulement après 48-72 h de culture pour éviter tout stress qui conduira à l’hypercontraction et la perturbation des myofibers.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Applications en aval : Myofibers crosslinking et immunofluorescence
REMARQUE : Les cellules satellites associées aux myofibers peuvent être visualisées par immunofluorescence (IF) au moment de l’intérêt. Puisque la plupart des protocoles publiés sont optimisés pour effectuer la FI sur les myofibers adultes, ici un protocole détaillé est présenté pour obtenir des résultats fiables également sur les myofibers isolés des muscles postnatals.
<ol><li>Myofiber crosslinking<ol>
<li>Avant de commencer, préparer toutes les solutions nécessaires décrites dans le tableau 2.</li>
		<li>Précoat avec HS autant de tubes de microcentrifuge de 1,5 mL que le nombre d’échantillons. Assurez-vous de supprimer tous les SH avant de procéder. Puisque les fibres croisées sont plus dures que les fibres vivantes et plus difficiles à pipette, assurez-vous de croiser environ 200-300 fibres séparément par tube.</li>
		<li>Sous un microscope de dissection, recueillir toutes les fibres qui peuvent être considérées comme saines, les transférer au tube de microcentrifuge et laisser le tube vertical pendant 5 min à l’intérieur de l’incubateur pour permettre aux fibres de s’installer.</li>
		<li>Retirer le supernatant très lentement du tube.</li>
		<li>Fibres crosslink en ajoutant 1 mL de 4% de paraformaldéhyde (PFA) à RT au tube. Faites-le doucement pour éviter la détresse des fibres.</li>
		<li>Pour éviter l’entrelacement des fibres pendant le croisement, gardez le tube dans une agitation très douce pendant 10 min.</li>
		<li>Gardez le tube en position verticale pendant 5 min à RT pour permettre aux fibres de s’installer, puis jetez le supernatant en veillant à enlever la majorité du volume PFA.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de saline tamponnée de phosphate (PBS) et garder les tubes verticaux pendant 5 min à RT pour laisser les fibres aux sédiments.</li>
		<li>Retirez le supernatant et répétez la procédure de lavage (étape 2.1.8.) deux fois à nouveau.</li>
		<li>Conservez les échantillons croisés à 4 °C. REMARQUE : Il est possible de conserver les myofibers croisés à 4 °C pendant une semaine. Si les fibres restent plus d’une semaine dans cet état, cela se traduira inévitablement par l’intersiment des myofibers.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunofluorescence<ol>
<li>Gardez les tubes contenant les fibres debout à RT pendant au moins 5 min pour permettre la sédimentation des fibres.</li>
		<li>Retirez le supernatant, en laissant juste un petit volume pour être sûr de ne pas enlever toute fibre.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de 0,5% de Triton X-100 en PBS et incuber pendant 5 min avec une légère agitation.</li>
		<li>Mettre les tubes en position verticale pendant 5 min, puis retirer le supernatant.</li>
		<li>Ajouter 1,5 mL de PBS et incuber avec une douce agitation pendant 5 min.</li>
		<li>Maintenir les tubes en position verticale pendant 5 min, puis retirer le supernatant.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de solution de blocage et incuber pendant 1 h à RT avec une agitation douce.</li>
		<li>Garder les tubes 5 min en position verticale, puis retirer le supernatant.</li>
		<li>Diluer les anticorps primaires dans la solution de blocage, les ajouter aux tubes et incuber sur nuit à 4 °C dans une agitation douce (pour les concentrations suggérées voir Tableau des matériaux). REMARQUE : Alternativement, l’anticorps primaire peut être incubé pendant 3 h à RT. Cependant, l’incubation de nuit a donné la coloration optimale. Le volume d’incubation des anticorps primaires et secondaires devrait être de 300 μL lorsque les fibres sédimentées atteignent l’encoche de 100 μL du tube de microcentrifuge de 1,5 m L. Lorsque les fibres sont moins abondantes, un volume de 100-200 μL est recommandé.</li>
		<li>Laissez les tubes en position verticale pendant 5 min, puis retirez le supernatant.</li>
		<li>Effectuer 3 lavages en 1 mL de 0,25% Tween-20 en PBS, incuber pendant 5 min dans une agitation douce, puis laisser les tubes debout pendant 5 min à chaque fois. NOTE: À partir de maintenant, effectuer toutes les étapes dans l’obscurité, pour éviter le blanchiment des fluorochromes.</li>
		<li>Diluer les anticorps secondaires dans la solution de blocage, les ajouter aux tubes et incuber pendant 1 h à RT avec une agitation douce (pour les concentrations voir Tableau des matériaux).</li>
		<li>Laver deux fois en 1 mL de 0,1% Tween-20 en PBS, incuber pendant 5 min avec une légère agitation, puis laisser les tubes en position debout pendant 5 min.</li>
		<li>Retirer le supernatant, ajouter 1 mL de solution DAPI et incuber pendant 5 min avec une agitation douce.</li>
		<li>Laisser les tubes reposer verticalement dans un rack pendant 5 min, puis retirer le supernatant.</li>
		<li>Laver avec 1 mL de PBS, incuber pendant 5 min avec une légère agitation, puis laisser les tubes reposer dans une grille pendant 5 min.</li>
		<li>Retirer le supernatant, en laissant un volume d’environ 50 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Montage de myofibers fluorescents étiquetés sur des lames de microscope<ol>
<li>Couper une pointe de pipette P200 et l’enrober d’une solution de blocage REMARQUE : Pour enrober la pointe, pipette la solution de haut en bas plusieurs fois avant de ramasser les fibres, ceci évitera des fibres pour coller au mur de pointe.</li>
		<li>Recueillir les fibres du tube et les étaler sur une lame de verre microscope.</li>
		<li>Sous un microscope de dissection, en utilisant uniquement la lumière naturelle réfléchie par le miroir, utilisez une nouvelle pointe de pipette P200 (non coupée) pour répandre les fibres et pour enlever l’excès de solution liquide.</li>
		<li>Laisser sécher les lames à l’air dans l’obscurité pendant environ 10-15 min, jusqu’à ce que la très faible quantité de solution reste.</li>
		<li>Ajouter le support de montage sur la lame (la quantité appropriée de support de montage doit être calibrée sur la dimension du couvercle : pour un couvercle de 24 x 40 mm, 20 μL suffit) puis posez lentement un verre de couverture sur la zone contenant les fibres. Veillez à ne pas créer de bulles entre les verres.</li>
		<li>Appuyez sur le couvercle de sorte que les fibres seront couchés sur un plan horizontal unique.</li>
		<li>Fixer le couvercle à l’aide de vernis à ongles.</li>
		<li>Conserver les échantillons à 4 °C jusqu’à 4 semaines.</li>
		<li>Acquérir les images souhaitées de myofibers fluorescents étiquetés avec un microscope confocal.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Pas d’intérêts concurrents.

L’isolement des myofibers uniques intacts est une méthode essentielle dans le domaine de la myogenèse lorsque l’objectif principal est de caractériser les capacités régénératrices autonomes des cellules souches musculaires dans leur niche, dans des conditions saines et pathologiques. Cependant, lorsque les études biochimiques ou génomiques sont intéressantes, les cellules satellites isolées par le FACS pourraient être la meilleure option.
L’isolement des myofibers uniques permet de suivre l’ex-vivo, mais de la manière la plus physiologique, la dynamique de toutes les étapes que subissent les cellules satellites uniques pendant la régénération musculaire, c’est-à-dire : activation, division cellulaire (asymétrique et symétrique), différenciation et retour à la quiescence par auto-renouvellement. Une fois que les myofibers sont cultivés dans des conditions flottantes, les cellules satellites uniques s’activent et se dilatent formant un amas de cellules, toutes provenant de la même cellule satellite. L’analyse de l’immunofluorescence pour les marqueurs de prolifération, de différenciation, d’activation ou de stemness est alors optimale pour quantifier la proportion entre les stades cellulaires.
L’étape clé de notre protocole pour obtenir des myofibers viables et intacts peut être considérée comme la dissection musculaire rapide mais douce, par l’isolement tendon-tendon, pour éviter tout dommage musculaire. Notre conseil est d’utiliser seulement des ciseaux pointus et de petites pinces pointues et de limiter toute la procédure de dissection musculaire à dix minutes. Lorsqu’il est difficile d’isoler de très petits muscles (c.-à-d. EDL et TA), il est possible de les couper ensemble et de les diviser plus tard en utilisant des ciseaux fins coupant le long du plan longitudinal suivant les fibres. Cette stratégie finira par donner moins de myofibers intacts, mais la viabilité ne sera pas compromise. La même chose doit être effectuée sur les grands muscles comme Gastrocnemius pour faciliter la digestion. L’optimisation du temps de digestion, qui doit être validée empiriquement, et la manipulation minimale des fibres isolées sont également deux aspects cruciaux pour le résultat positif de l’analyse ultérieure.
L’avantage du protocole rapporté ici est qu’il peut être appliqué sur de très petites souris (en âge et en dimension), même lorsque leurs muscles sont extrêmement fragiles. Même s’il n’est pas mentionné ci-dessus, il est possible de suivre ce protocole de dissection à la culture myofibers viable pour une plus longue période en utilisant des plats recouverts de membrane de sous-sol18,19. Il est important de considérer que cette situation est complètement différente de la condition flottante, où les stimuli d’adhérence et les stimuli de proximité sont absents.

Le muscle squelettique est un tissu différencié avec l’une des capacités les plus étendues à se régénérer après l’exercice ou un traumatisme1. Cette caractéristique est principalement due à la présence de cellules souches, appelées cellules satellites en raison de leur position périphérique entre la lamina basale et le plasmalemme du myofiber2. Pendant le développement postnatal, les cellules satellites prolifèrent et se différencient progressivement, contribuant ainsi à la croissance des muscles squelettiques. Une fois à l’âge adulte, les cellules satellites entrent dans un état de quiescent réversible, et sur un traumatisme physiologique ou pathologique, elles activent, prolifèrent et se différencient afin de réparer les muscles endommagés3. Les défauts dans la capacité des cellules satellites de passer correctement par ces différentes phases régénératrices et de subir l’auto-renouvellement ont été fermement liés au gaspillage musculaire, soit pendant le vieillissement physiologique4,5,6 ou dans les maladies dégénératives musculaires, telles que les dystrophies musculaires7,8,9,10.
Deux approches de culture principale existent pour étudier les cellules satellites ex vivo : les cultures myogènes primaires à partir de cellules mononucléées, mécaniquement et chimiquement dissociées du muscle entier11,12; ou culture des myofibers isolés13,14,15,16,17,18,19,20. Dans le premier cas, le processus d’isolement des cellules satellites implique la trituration des muscles entiers extraits de la souris, une digestion chimique, la filtration et le tri des cellules fluorescentes activées (FACS)21. Cette procédure, bien qu’efficace pour isoler les cellules satellites d’une variété de modèles, implique plusieurs variables qui exposent les cellules satellites au stress et perturbe leur niche physiologique22,23. En revanche, l’isolement du myofiber implique une digestion plus douce du tissu musculaire avec des enzymes dégradantes matricielles et un déchiquetage mécanique qui provoque une réduction des traumatismes aux cellules souches20. Cette deuxième approche permet une récupération beaucoup plus efficace des cellules satellites viables, qui restent physiquement attachées à leur myofiber entre la lamina basale et le sarcolemma, permettant ainsi l’analyse dans leur niche physiologique19,20.
De nombreux protocoles différents ont été proposés au cours des dernières années pour isoler correctement et efficacement les myofibers simples des muscles squelettiques. Déjà en 1986 Bischoff a proposé un protocole pour isoler les fibres du Flexor Digitorum Brevis13 et plus tard, en 1995, Rosenblatt et coll. ont modifié le protocole pour obtenir une séparation plus efficace des myofibers14. Depuis lors, de nombreux autres auteurs ont proposé des procédures ajustées sur d’autres muscles, tels que Extensor Digitorum Longus (EDL) et Tibialis Anterior (TA)15,16,17,18,19,20, qui sont plus longs, même si plus fragiles, muscles14. Les myoibers isolés peuvent alors être cultivés à la fois en adhérence, pour permettre l’expansion des myoblastes dérivés des cellules satellites, ou dans des conditions flottantes, jusqu’à 96 heures, pour suivre la descendance dérivée des cellules satellites simples19 (Figure 1). Des concentrations variables de sérum dans le milieu de culture sont utilisées pour déclencher l’activation, la prolifération et/ou la différenciation des cellules satellites, afin d’étudier leur capacité à transiter correctement par ces différentes phases1.
Nous avons récemment décrit le mécanisme épigénétique derrière l’épuisement de la piscine de cellules souches satellites dans le modèle de souris de l’EDMD, le Lamin Δ8-11 -/- souris7. Puisque ces souris meurent habituellement entre 4-8 semaines de l’âge24, en raison de la perte de muscle grave, une tentative a été faite pour capturer les défauts moléculaires sous-jacents au début tôt de la maladie en concentrant notre analyse sur le développement de muscle post-natal. Les myofibers flottants simples ont été isolés et cultivés de type sauvage et Lamin Δ8-11 -/- mutant7 souris de 19 jours. À ce stade, les défauts musculaires sont déjà évidents, mais les souris sont encore viables. Cependant, puisque tous les protocoles mentionnés ci-dessus pour l’extraction de myofibers simples ont été optimisés pour les muscles squelettiques des souris adultes, nous avons dû les adapter à nos objectifs : de très petites souris en termes d’âge et de taille, et des myofibers très fragiles. Ainsi, nous décrivons ici notre ré-adaptation du protocole proposé par le laboratoire Rudnicki19 pour obtenir un nombre significatif de myofibers viables simples de souris pendant le développement post-natal et des muscles dystrophiques graves, tels que ceux dérivés de Lamin Δ8-11 -/- souris24. L’objectif final de cette approche est de fournir une procédure normalisée pour l’étude des cellules souches musculaires associées aux myofibers dans n’importe quel autre modèle de souris lorsque les premiers stades du développement postnatal sont d’intérêt, ou dans le cas des modèles de souris portant une maladie spécifique qui rend les myofibers plus sensibles au stress mécanique.

<table><tbody><tr><td>4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Extrait d’embryon de poulet</td><td>Seralab</td><td>CE650-DL</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase type I</td><td>SIGMA</td><td>C0130-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Rabbit 488 Donkey</td><td>Thermofisher</td><td>R37118</td><td>à utiliser 1:200</td></tr><tr><td>Medium Eagle modifié de Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps MyoG</td><td>Millipore</td><td>219998</td><td>à utiliser 1:100</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>SIGMA</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Pax7</td><td>Etudes développementales Banque</td><td></td><td>d’hybridomes à utiliser 1:20</td></tr><tr><td>Pénicilline et streptomycine</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Tampon salin phosphate</td><td>Euroclone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>Prolong gold antifade mountant</td><td>Thermofisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Équipement de laboratoire</td><td>Fabricant</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bec Bunsen Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>confocal</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond pen</td><td>bio-optica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Broches</td><td></td><td></td><td></td>de dissection</tr><tr><td>FACS Tubes en polypropylène</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes (50 et 15 mL)</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur en verre (22cm)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lames en verre</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro ciseaux</td><td></td><td></td><td></td>de dissection</tr><tr><td>Micropipette (1 mL et 200 &micro ; L)</td><td>Pointes de</td> micropipette Gilson <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Boîtes de Pétri Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(100 et 35 mm de diamètre)</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes en plastique (5 et 10 mL)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampoules de pipette en caoutchouc</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td></td><td></td><td></td>pointue</tr><tr><td>Microscope à stéréodissection avec transmission éclairage</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hotte de culture tissulaire ou armoire</td><td></td><td></td><td></td>à flux laminaire</tr><tr><td>Incubateur de culture tissulaire (humidifié, 37&deg ; C, 5 % CO2)Bain-marie</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>à 37&deg ; C</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et culture myofiber uniques à partir d’un modèle murin de la dystrophie musculaire emery-dreifuss dans le développement post-natal précoce

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

La dystrophie musculaire autosomique dominante Emery-Dreifuss (EDMD) est causée par des mutations dans le gène LMNA, qui code les lamines nucléaires de type A, les protéines de filament intermédiaire qui soutiennent l’enveloppe nucléaire et les composants du nucléoplasme. Nous avons récemment signalé que le gaspillage musculaire dans EDMD peut être attribué à des dysfonctionnements épigénétiques intrinsèques affectant la capacité régénératrice des cellules souches musculaires (satellites). L’isolement et la culture des myofibers simples est l’une des approches ex-vivo les plus physiologiques pour surveiller le comportement des cellules satellites dans leur niche, car ils restent entre la lamine basale entourant la fibre et le sarcolemme. Par conséquent, il représente un paradigme expérimental inestimable pour étudier les cellules satellites à partir d’une variété de modèles murins. Ici, nous décrivons une méthode ré-adaptée pour isoler les myofibers uniques intacts et viables des muscles postnatals de l’arrière --tibialis antérieur, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius et Soleus). Suivant ce protocole, nous avons pu étudier les cellules satellites de Lamin Δ8-11 -/- souris, un modèle grave de murine EDMD, à seulement 19 jours après la naissance.
Nous détaillons la procédure d’isolement, ainsi que les conditions de culture pour obtenir une bonne quantité de myofibers et leur progéniture associée dérivée des cellules satellites. Lorsqu’elles sont cultivées dans un milieu riche en facteurs de croissance, les cellules satellites dérivées de souris de type sauvage activent, prolifèrent et finissent par se différencier ou subissent un auto-renouvellement. Chez les souris homozygotes Lamin Δ8-11 -/- mutantes, ces capacités sont gravement altérées.
Cette technique, si elle est strictement suivie, permet d’étudier tous les processus liés à la cellule satellite associée au myofiber, même au début des stades de développement postnatal et dans des muscles fragiles.

Nous digérons généralement quatre muscles différents (TA, EDL, Soleus et Gastrocnemius)pour récupérer une bonne quantité de fibres longues et viables qui pourraient survivre 96 h dans le milieu riche en facteurs de croissance (Figure 4A,B). Seules les fibres les plus intactes devraient être transférées dans le milieu de la culture, car elles survivront; tous les autres, qui sont faciles à discriminer et à sélectionner, doivent être écartés.
Lorsque les myofibers sont maintenus dans un système de croissance riche en cellules satellites moyennes dérivés de souris de type sauvage commencent à s’activer et à proliférer, voir la figure 1. À 48 h de culture, en bon état(Lamin Δ8-11 +/+), les cellules satellites upregulent myoD et subissent leur première division. Activées Pax7+/MyoD+ cellules satellites prolifèrent alors et par 72 h en culture, ils génèrent des agrégats cellulaires liés au myofiber, qui sont encore plus visibles à 96 h (Figure 5). Au cours de ces divisions, certains d’entre eux peuvent réprimer l’expression MyoD, subissant l’auto-renouvellement pour repeupler la piscine de cellules souches, tandis que ceux qui maintiennent MyoD s’engagent à la différenciation en réduisant l’expression Pax7. Après 96 h, les groupes de cellules satellites contiennent des cellules committed MyoG+ clairement visibles, qui peuvent se différencier en nouveaux myofibers (figure 1 et figure 6). Notamment, avec cette expérience, nous avons décrit une dynamique retardée de la différenciation cellulaire par satellite chez les souris lamin Δ8-11 mutants homozygotes (-/-) par rapport à leurs homologues de type sauvage (+/+), voir figure 6.
Le résultat final de chaque expérience nous permet de penser que le protocole développé pour l’isolement des myofibers unique et la culture de ce modèle de dystrophie musculaire sévère assure myofibers de bonne qualité pour toutes les autres applications.
<img alt="Diagramme de myofibres multinucléées ; Pax7 et MyoD/MyoG jouent un rôle dans la chronologie de la différenciation musculaire." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Représentation graphique des phases régénératrices des cellules satellites modélisées dans des myofibers flottants. Sur 48 h de culture dans les facteurs de croissance riches, les cellules Pax7+ sont activées et subissent la première division, donnant lieu à un doublet de cellules Pax7+/MyoD+. Les cellules positives myoD prolifèrent et se développent, donnant lieu, en 72 h de culture, à un amas de plusieurs cellules qui sont la descendance d’une seule cellule satellite. À 96 h de culture, les cellules Pax7+/MyoD+ deviennent différenciantes les cellules Pax7-/MyoG+. Au cours de la phase d’expansion, un sous-ensemble de cellules Pax7+/MyoD+ downregulate l’expression MyoD subissant l’auto-renouvellement en quiescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Méthode de scellage des pipettes de laboratoire ; Schéma de montage avec pipette en verre et vue d’ensemble de l’étanchéité." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 : Préparation des pipettes pasteur. (A) Vue longitudinale et frontale de l’apparence de la pipette de forage du grand trou. (B) Vue longitudinale et frontale de la façon dont la pipette de forage de petit trou doit finalement apparaître. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Processus de dissection des tendons TA et EDL ; extraction musculaire ; Schéma d’étude anatomique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 : Photos représentatives de la dissection musculaire unique. (A) Isolement du muscle TA. Éviter l’enlèvement de la couche mince couvrant le muscle protège les myofibers à l’intérieur. (B) Muscles TA et EDL isolés ensemble encore attachés à leur tendon supérieur au niveau de la rotule. (C) Division de TA et EDL après isolement en les coupant le long de l’axe longitudinal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Image au microscope d’une myofibre viable, d’une fibre brisée ; Analyse des tissus musculaires, comparaison structurelle." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4 : Exemples de myofibers sains et viables. Phase représentative contraste des images de myofibers viables en suspension. (A) La flèche rouge indique un myofiber avec une organisation sarcomère visible et une cellule satellite sur le côté; les flèches oranges indiquent quelques morceaux de myofibers cassés, et quelques débris présents dans le premier plat avant la sélection finale pour la culture. Barre d’échelle 100 μm. (B) Vue plus complète des autres myofibers sous un grossissement plus petit. Barre d’échelle 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Microscopie à fluorescence de la coloration DAPI et Pax7 dans le modèle Lamin Δ8-11 ; étude de différenciation cellulaire." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figure 5 : Différence dans la dimension des grappes de cellules souches chez les souris wt et mutantes. Coloration d’immunofluorescence des myofibers extraites de 19 jours de souris Lamin Δ8-11 (+/+ et -/-) après 96 h de culture. Les cellules satellites Pax7+ sont affichées. La dimension du groupe cellulaire dans la plupart des cas était significativement plus grande chez Lamin Δ8-11 +/+ que chez Lamin Δ8-11 -/- en termes de nombre de cellules. Barre d’échelle 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Microscopie à fluorescence montrant les marqueurs de cellules musculaires DAPI, Pax7, MyoG ; Comparaison Lamin Δ8-11." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figure 6 : Expérience d’immunofluorescence représentative. L’expérience d’immunofluorescence a effectué, après 96 h de culture, sur des myofibères extraits de 19 jours de souris Lamin Δ8-11 (+/+ et -/-). Des cellules Pax7+/MyoG- (rouge) et Pax7-/MyoG+ (vertes) ont été observées. Images obtenues au microscope confocal. Barre d’échelle 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nom de la solution dans le texte</td>
			<td>Composant</td>
			<td>Pourcentage</td>
			<td>volume/échantillon final suggéré</td>
			<td colspan="2">Notes</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">solution de lavage</td>
			<td>DMEM taux élevé de glucose</td>
			<td>90%</td>
			<td rowspan="2">4 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Garder stérile, garder à 4°C jusqu’à l’utilisation</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sérum de cheval (HS)</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">solution de digestion</td>
			<td>DMEM taux élevé de glucose</td>
			<td>9.80%</td>
			<td rowspan="2">20 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Poudre extrêmement nocive. Filtrer la solution avec un filtre de 0,22 μm, puis conserver stérile. Conserver à 4°C jusqu’à l’utilisation</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagène I</td>
			<td>0.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">milieu culturel</td>
			<td>DMEM taux élevé de glucose</td>
			<td>78%</td>
			<td rowspan="4">10 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="4">Garder stérile, garder à 4°C jusqu’à l’utilisation</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td>
			<td>20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extrait d’embryon de poulet (CEE)</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pénicilline-Streptomycine (P/S)</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Recettes de solutions utilisées à la section 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nom de la solution dans le texte</td>
			<td>Composant</td>
			<td>Pourcentage</td>
			<td>volume/échantillon final suggéré</td>
			<td colspan="2">Notes</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">4% PFA</td>
			<td>Paraformaldéhyde (PFA)</td>
			<td>4%</td>
			<td rowspan="2">2-3 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">La poudre puis la solution sont extrêmement nocives</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>96%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">0,5 % Triton X-100</td>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>0.50%</td>
			<td rowspan="2">2-3 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Triton X-100 est extrêmement visqueux, coupez préférentiellement la pointe de la pipette pour l’aliquote</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.50%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">0,25% Tween-20</td>
			<td>Tween-20</td>
			<td>0.25%</td>
			<td rowspan="2">10 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Tween-20 est extrêmement visqueux, coupez de préférence la pointe de la pipette pour l’aliquoter</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.75%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">0,1 % Tween-20</td>
			<td>Tween-20</td>
			<td>0.10%</td>
			<td rowspan="2">10 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Tween-20 est extrêmement visqueux, coupez de préférence la pointe de la pipette pour l’aliquoter</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.90%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">solution de blocage</td>
			<td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td>
			<td>10%</td>
			<td rowspan="2">10 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Préparer une solution fraîche et conserver à 4°C pendant au plus 3 semaines (vérifiez toujours la clarté avant l’utilisation)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Dapi</td>
			<td>Dapi</td>
			<td>0.10%</td>
			<td rowspan="2">2-3 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Restez dans l’obscurité</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.90%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Recettes de solutions utilisées à la section 2.

Ici, nous proposons une méthode pour obtenir efficacement des fibres musculaires simples aux premiers stades post-natals du développement de l’homozygote mutant Lamin Δ8-11 modèle de souris, un modèle très sévère pour Emery-Dreifuss dystrophie musculaire (EDMD).

Isolement et culture myofiber uniques à partir d’un modèle murin de la dystrophie musculaire Emery-Dreifuss dans le développement post-natal précoce

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

De nombreux protocoles existent pour isoler les myofibers simples des muscles squelettiques des souris adultes. Notre protocole est conçu pour les souris très jeunes et pour les petites souris avec un myofibers très fragile. Cette procédure normalisée peut être utilisée pour étudier les cellules souches musculaires assistées par myofiber pendant le développement postnatal ou dans les modèles muraux de maladies qui rendent les myofibers particulièrement sensibles au stress mécanique.La procédure sera démontrée par Gloria Pegoli, doctorante, et Federica Lucini, post-doctorat, toutes deux d’un laboratoire. Pour la dissection musculaire et la récolte, utilisez une épingle pour fixer un membre postérieur d’une souris euthanasiée, très jeune ou très petite sur une planche de dissection, et utilisez des pinces pointues pour soulever le tendon inférieur de la hauteur antérieure de tibialis à la cheville. Coupez le tendon et utilisez de fines ciseaux pour couper tout autour du muscle au tendon au niveau de la rotule.Placez le muscle dans un tube de solution de digestion et soulevez le tendon inférieur de l’extenseur digitorum longus, tirant doucement vers le haut sur le tendon pour séparer le digitorum longus extenseur des autres muscles. Coupez et récoltez le muscle. Faites pivoter la jambe pour voir les muscles du dos et soulever le tendon d’Achille.Un muscle gastrocnemius se séparera automatiquement des autres muscles. Couper le tendon supérieur à l’arrière de la rotule et placer le muscle dans la solution de digestion. Soulevez le tendon externe de la jambe et roulez les pinces sous le tendon pour séparer doucement le tendon du muscle.Ensuite, coupez pour récolter le muscle et recueillir les mêmes muscles de l’autre jambe de la même manière. Lorsque tous les muscles ont été recueillis, placez le tube de collecte dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 45 à 50 minutes et inversez vigoureusement le tube 10 fois toutes les 10 minutes. Lorsque les muscles commencent à se desserrer et que les myofibers deviennent visibles, secouez les échantillons une dernière fois avant de transférer soigneusement la suspension de digestion dans une boîte Petri préchauffée ou recouverte de sérum de 100 millimètres contenant 10 millilitres de solution de lavage.Pour isoler les myofibers simples, placez le plat sous un microscope disséquant et utilisez un sérum de cheval enduit de tuyautte de 200 microlitres pour démonter les fibres musculaires individuelles. Transférer les myofibers viables dans un sérum de cheval recouvert de 35 millimètres de boîte petri contenant cinq millilitres de solution de lavage préchauffée. Lorsque tous les myofibers viables ont été prélevés, équilibrer les échantillons de myofiber dans l’incubateur de culture cellulaire pendant cinq minutes.Si plus de myofibers sont nécessaires, utilisez une pipette en verre à gros alésage pour triturer l’échantillon de tissu musculaire restant jusqu’à ce que des fibres supplémentaires soient libérées mécaniquement. Lorsque suffisamment de myofibers ont été recueillis, placez le plat dans l’incubateur de culture cellulaire pendant une heure pour une période d’équilibrage supplémentaire. À la fin de l’incubation, transférer les myofibers individuels dans un nouveau plat recouvert de sérum de cheval préchauffé contenant le milieu de culture approprié et remettre l’assiette à l’incubateur de culture cellulaire.Pour une analyse immunofluorescente des myofibers, après liaison croisée, enlever tout sauf assez supernatant, de ne pas enlever les fibres et ajouter au même tube un millilitre de 0,5%Triton X-100 dans PBS pour une incubation de cinq minutes avec agitation douce. À la fin de l’incubation, laisser les fibres se déposer pendant cinq minutes avant de remplacer le supernatant par 1,5 millilitres de PBS. Après cinq minutes d’agitation douce, laisser les fibres se contenter pendant encore cinq minutes avant de remplacer le supernatant par un millilitre de solution de blocage.Après une heure d’agitation douce, remplacez la solution de blocage par une solution de blocage fraîche contenant des anticorps primaires d’intérêt pour une incubation nocturne à quatre degrés Celsius par une légère agitation. Le lendemain matin, lavez les fibres avec trois lavages de cinq minutes en un millilitre de 0,25 % de Tween 20 en PBS en utilisant une agitation douce et cinq minutes de sédimentation à température ambiante pour le lavage. Après le dernier lavage, étiqueter les fibres avec les anticorps secondaires conjugués fluorochrome appropriés dilués dans la solution de blocage pendant une heure à température ambiante avec agitation douce, protégé de la lumière, suivie de trois lavages en PBS plus 0,1%Tween, protégé de la lumière, comme démontré.Après le dernier lavage, remplacer le supernatant par un millilitre de solution DAPI pour une incubation de cinq minutes à température ambiante par une agitation douce, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les fibres et utiliser une pipette enduite de solution de blocage avec une pointe coupée pour recueillir les fibres et étendre soigneusement les fibres sur une glissière en verre. Placez la lame sous un microscope disséquant, et en utilisant seulement la lumière naturelle réfléchie par le miroir, utilisez une nouvelle pointe de pipette de 200 microlitres pour étendre doucement les fibres et enlever la solution excédentaire.Après avoir enlevé la solution excédentaire, laissez sécher la glissade dans l’obscurité pendant 10 à 15 minutes jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un très petit volume de solution. Ensuite, ajoutez un volume approprié de milieu de montage sur les fibres avant de placer soigneusement un glissement de couverture sur les tissus. Pour récupérer un nombre suffisant de fibres longues et viables qui peuvent survivre 96 heures dans le milieu riche en facteur de croissance, quatre muscles différents sont généralement récoltés et digérés.Seules les fibres les plus intactes doivent être transférées au milieu de culture. Les fibres cassées et autres débris doivent être jetés. Après 72 heures de culture, les cellules satellites activées génèrent des agrégats cellulaires liés au myofiber.Nous observons que la culture cellulaire est dérivée du delta de Lamin huit 11 souris doubles négatives sont formées par un plus petit nombre de cellules. Après 96 heures, les cellules satellites expriment MyoG, deviennent visibles dans le cluster cellulaire, initiant la différenciation vers de nouveaux myofibers. Notamment, une dynamique retardée de différenciation des cellules satellitaires est observée chez les souris mutantes homozygotes lamin knockout par rapport à leurs homologues de type sauvage.Assurez-vous de pratiquer les étapes de dissection musculaire comme une récolte musculaire rapide et précise est essentielle au succès de l’expérience. Cette technique permet le suivi des cellules satellites individuelles lors de l’activation et de la différenciation, facilitant l’étude des processus clés sous-jacents à la croissance et à la régénération musculaires dans différentes conditions physiologiques et pathologiques.

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La technique de micro-disséqués explants est une méthode robuste et fiable pour isoler proliférative des cellules musculaires squelettiques de juvéniles, adultes ou embryonnaires muscles comme source de cellules souches du muscle squelettique. Uniquement, ces cellules ont été tirés par clonage pour produire des lignes squelettiques musculaires cellules souches utilisées pour la transplantation in vivo.

Adultes et embryonnaires Culture squelettique Microexplant musculaire et isolement de cellules souches du muscle squelettique

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Isolation des myofibres : une technique pour obtenir des myofibres uniques à partir d’un muscle extenseur digitorum long (EDL) de souris récolté

Mesures de la fonction musculaires contribuer à l'évaluation des agents thérapeutiques potentiels pour les pathologies musculaires, ainsi que pour la détermination des mécanismes sous-jacents physiologie de ce tissu. Nous allons démontrer la préparation du long extenseur des orteils et muscles du diaphragme pour les tests fonctionnels. Les protocoles de contractions isométriques et excentriques seront affichés, ainsi que les différences de résultats entre les muscles dystrophiques, ce qui...

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Isolement et culture des fibres musculaires individuelles et de leurs cellules satellites du muscle squelettique adulte

Poisson zèbre sont d'un nouveau système pour la modélisation de maladies humaines du muscle squelettique. Nous décrivons une méthode rapide et efficace pour isoler les fibres musculaires des muscles squelettiques de poisson zèbre embryonnaire et larvaire. Cette méthode produit une préparation de haute densité myofiber approprié pour l'étude de la morphologie unique de fibres de muscle squelettique, la localisation subcellulaire des protéines, et la physiologie des muscles.

Analyse des embryonnaire et larvaire de poisson-zèbre squelettiques fibres musculaires de préparations dissociées

Ce protocole utilise l’électroporation pour introduire et exprimer des protéines marquées par fluorescence dans les fibres musculaires de souris. Après récupération après électroporation, les fibres sont isolées. Les fibres individuelles sont ensuite imagées à l’aide de la microscopie confocale à haute résolution pour visualiser la structure musculaire.

ADN électroporation, isolement et d&#39;imagerie de myofibres

Les cellules musculaires font partie des cellules eucaryotes les plus complexes. Nous présentons un protocole pour la différenciation in vitro de myofibres hautement matures qui permet une manipulation génétique et une imagerie claire à tous les stades du développement.

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Dans ce protocole, une méthode de culture in vitro et d’analyse fonctionnelle des cellules souches musculaires est décrite, qui préserve la plupart de leurs interactions avec leur niche endogène.

Essai de culture de myofibère unique pour l’évaluation de la fonctionnalité des cellules souches musculaires adultes Ex Vivo

Dans ce travail, un protocole de décellularisation a été optimisé pour obtenir des matrices décellularisées du muscle squelettique de souris fœtale. Les myoblastes C2C12 peuvent coloniser ces matrices, proliférer et se différencier. Ce modèle in vitro peut être utilisé pour étudier le comportement cellulaire dans le contexte de maladies musculaires squelettiques telles que les dystrophies musculaires.

Préparation de matrices décellularisées 3D à partir de muscle squelettique de souris fœtale pour culture cellulaire

Ce protocole fournit une méthode standardisée pour isoler et enrichir les myoblastes primaires du muscle squelettique de la souris adulte et néonatale via la dissociation tissulaire, la filtration séquentielle, le préplaque et des conditions de culture définies, permettant l’établissement et le maintien de cultures de myoblast dérivées des cellules satellites pour des applications expérimentales en aval.

Isolement des cellules satellites du muscle squelettique pour les études de myogenèse in vitro

Ce protocole décrit l’isolement des fibres musculaires uniques intactes du solèus oxydatif et l’établissement de cultures de myoblast hautement purifiées dérivées de ces fibres. La procédure optimisée permet de fournir de manière fiable environ 300 à 500 myofibres intactes par souris, permettant des analyses moléculaires et cellulaires en aval.

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Découvrez l'isolement de myofibres uniques chez des souris modèles de la dystrophie musculaire d'Emery-Dreifuss. Cette méthode permet d'étudier les cellules satellites et la régénération musculaire au cours du développement postnatal précoce.

Isolement et culture myofiber uniques à partir d’un modèle murin de la dystrophie musculaire Emery-Dreifuss dans le développement post-natal précoce (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement et culture myofiber uniques à partir d’un modèle murin de la dystrophie musculaire Emery-Dreifuss dans le développement post-natal précoce

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