Name: Vitrification minimale en volume des ovocytes félins immatures (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Découvrez la vitrification minimale en volume des ovocytes félins immatures pour la préservation de la fertilité. Cette méthode rapide et réalisable sur le terrain contribue à la conservation de la biodiversité des espèces menacées.

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Ce travail a été en partie soutenu par EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 et par Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Nous tenons également à remercier la Dre MariaGiorgia Morselli pour sa contribution aux expériences décrites par les présentes et à l’acquisition d’images.

Les procédures décrites par les présentes n’ont pas fait l’objet d’une approbation éthique puisque les ovaires de chat ont été recueillis dans les cliniques vétérinaires comme sous-produits de l’ovariectomie de routine ou de l’ovariohystérectomie demandée par le propriétaire.
1. Collection d’ovocytes
<ol><li>Avant de commencer les expériences, préparer des solutions pour la collecte des ovaires et des ovocytes. Préparer une solution de collecte d’ovaires avec de la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) avec un mélange d’antibiotiques et d’antimycotiques (100 UI/mL de pénicilline G sodium, 0,1 mg/mL de sulfate de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotericine B). Préparer une solution de collecte d’ovocytes (c.-à-d. PBS/PVA) avec pbs avec 100 UI/mL de pénicilline G sodium, 0,1 mg/mL de sulfate de streptomycine et 0,1 % (w/v) d’alcool polyvinyle (APV).</li>
	<li>Stockez les solutions pour la collecte des ovaires et des ovocytes à 4 °C jusqu’à l’utilisation.</li>
	<li>Le jour de l’utilisation des reines, quelques heures avant le traitement des échantillons, prendre une partie des solutions de collecte des ovaires et des ovocytes et les laisser se réchauffer à température ambiante (RT; 25 ± 2 °C).</li>
	<li>Lorsque les échantillons arrivent au laboratoire, isoler les ovaires du tissu conjonctif environnant et de l’oviducte et les laver dans un milieu de collecte d’ovaires frais dans une boîte de Pétri.</li>
	<li>Remplissez une boîte de Pétri de 35 mm pour chaque reine avec environ 3 mL de RT PBS/PVA, et un plat de plus pour recueillir les ovocytes.</li>
	<li>Placez une paire d’ovaires dans une boîte de Pétri et émincer le cortex avec un scalpel chirurgical. Assurez-vous que tous les follicules ont été cassés à l’aide d’un stéréomicroscope (grossissement 8x).</li>
	<li>Recueillir les COC avec une pipette et les déplacer dans pbs frais / PVA dans la boîte de Pétri allouée. Choisissez de bonnes qualités COC, avec un cytoplasme homogène et sombre et entouré de plusieurs couches compactes de cellules cumulus (grade I18).</li>
</ol>2. Vitrification
<ol><li>Préparer les médias d’équilibre et de vitrification.<ol>
<li>Préparer une solution d’équilibre (ES) avec 7,5 % (v/v) d’éthylène glycol (EG) et 7,5 % (v/v) de diméthylsulphoxide (DMSO) dans le milieu 199, avec 20 % de sérum fœtal de bovins (FBS).</li>
		<li>Préparer la solution de vitrification (VS) avec 15% (v/v) EG, 15% (v/v) DMSO et 0,5 M de saccharose dans le moyen 199, avec 20% FBS (modifié à partir de 19).</li>
		<li>Laissez ES et VS se réchauffer à RT avant d’utiliser. REMARQUE : Les cryoprotectants (p. ex., EG, DMSO) sont connus pour être cytotoxiques. Une stratégie pour contrer leur toxicité est de réduire la température à laquelle les cellules sont exposées à eux20, et les ovocytes sont généralement exposés à des cryoprotectants à RT. Ainsi, l’ensemble de la procédure, de la collecte des ovocytes à la vitrification, est effectué à RT dans ce protocole pour éviter les fluctuations de température.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer le plat de vitrification (c.-à-d. un plat spécial composé de six puits coniques divisés en deux rangées, connu sous le nom de « plaque de repro »). Préparer une rangée (trois puits) pour chaque support de vitrification.<ol>
<li>Ajouter 20 μL d’ES au bas du premier puits.</li>
		<li>Ajouter 300 μL de VS au bas des deuxièmes (c.-à-d. 1VS) et troisième (c.-à-d. 2VS).</li>
	</ol></li>
	<li>Équilibrer les COC dans ES.<ol>
<li>Avec une pipette à petit forage (p. ex., une pipette Pasteur tirée sur un bec de Bunsen pour la rendre plus mince – le diamètre doit être d’au moins 200 μm), transférer un (ou plusieurs) COC(s) sur le fond du premier puits. REMARQUE : Choisissez la taille de la pipette en fonction du nombre de couches de cellules cumulus entourant les ovocytes, afin de réduire autant que possible le volume de support qui est transféré avec les COC à chaque étape. Avec le protocole actuel, les opérateurs formés peuvent vitrifier avec succès jusqu’à huit COC félins par chaque support de vitrification.</li>
		<li>Ajouter lentement 20 μL d’ES à la bordure de la goutte. Attendez 3 minutes.</li>
		<li>Ajouter lentement 20 μL d’ES à la frontière de la goutte. Attendez 3 minutes.</li>
		<li>Ajouter lentement 240 μL d’ES à la bordure de la goutte. Attends 9 minutes.</li>
		<li>En attendant, préparer une boîte avec de l’azote liquide (LN2),étiqueter un support de vitrification avec le code d’identification de l’expérience/chat et la laisser ouverte. Mettez les deux près du stéréomicroscope, de sorte qu’ils peuvent être facilement accessibles tout en travaillant. Attention! Portez de l’équipement de protection individuelle lors de la manipulation de LN2.</li>
		<li>Sinon, si plusieurs COC doivent être vitrifiés, commencez la première étape d’équilibre (voir l’étape 2.3.1 - 2.3.2) pour un autre groupe de COC (qui sera chargé sur un nouveau support de vitrification).</li>
	</ol></li>
	<li>Vitrifier les COC en VS en moins de 90 secondes.<ol>
<li>À l’aide de la même pipette à petit forage, remplissez-la de 1VS, prenez les COC du bas du premier puits (ES) et déplacez-les à la surface du second puits (1VS).</li>
		<li>Laver la pipette avec 1VS.</li>
		<li>Prenez les COC et déplacez-les dans une autre zone (au fond) du puits; mélanger le milieu qui les entoure avec la pipette.</li>
		<li>Remplissez la pipette de 1VS dans une autre zone du puits, prenez les COC, déplacez-les et mélangez le milieu qui les entoure avec la pipette.</li>
		<li>Répétez l’étape 2.4.4.</li>
		<li>Laver la pipette avec 2VS.</li>
		<li>Prenez les COC et déplacez-les sur le fond du troisième puits (2VS); mélanger le milieu qui les entoure avec la pipette.</li>
		<li>Remplissez la pipette de 2VS dans une autre zone du puits, prenez les COC, déplacez-les et mélangez le milieu qui les entoure avec la pipette.</li>
		<li>Répétez l’étape 2.4.8.</li>
		<li>Remplissez la pipette de 2VS dans une autre zone du puits, prenez les COC et chargez-les sur la bande du support de vitrification, aussi près que possible de la pointe. Aspirate en excès de milieu pour réduire le volume de VS autant que possible.</li>
		<li>Plongez immédiatement le support de vitrification dans LN2, le déplaçant. Fermez-le à l’aide de quelques pinces, en vous assurant qu’il reste toujours immergé dans LN2. REMARQUE : Le maintien du bon timing est crucial en raison de la toxicité des cellules cryoprotecantes. En raison de leur forte concentration dans les milieux vitrification, l’exposition cellulaire doit être contrôlée, également par l’exécution sans faille de la technique21. Si les échantillons sont abondants, envisagez de les diviser pour les traiter plus rapidement et de minimiser le temps entre la collecte des ovocytes et la vitrification.</li>
	</ol></li>
	<li>Conserver les supports de vitrification chargés dans un gobelet et les conserver dans un réservoir LN2 de stockage jusqu’à ce qu’ils se réchauffent. REMARQUE : Toutes les étapes précédentes du protocole peuvent également être appliquées dans des conditions de terrain si LN2 est disponible. Un expéditeur à sec sera nécessaire pour transporter les échantillons au laboratoire en toute sécurité, puis procéder aux phases suivantes.</li>
</ol>3. Réchauffement
<ol><li>Préparez les médias qui réchauffent.<ol>
<li>Préparer la solution de décongélation (TS) avec 1 M de saccharose en 199 moyen, avec 20% de FBS.</li>
		<li>Préparer la solution de dilution (DS) avec 0,5 M de saccharose en 199 moyen, avec 20% FBS.</li>
		<li>Préparer la solution de lavage (WS) avec Medium 199 avec 20% FBS.</li>
		<li>Avant utilisation, réchauffez TS à 38 °C et DS et WS à RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si nécessaire, préparer le milieu de culture pour l’utilisation ultérieure de COC réchauffés (p. ex., maturation in vitro, IVM).</li>
	<li>Placez le stade de chauffage près du stéréomicroscope et allumez-le (38 °C). Mettre le couvercle d’une boîte de Pétri pour réchauffer.</li>
	<li>Lorsque tout est prêt, transférer les supports de vitrification qui doivent être réchauffés du réservoir de stockage à une boîte avec LN2, et mettre la boîte près du stéréomicroscope.</li>
	<li>Préparez la « plaque Repro ». Préparez une rangée pour chaque support de vitrification qui doit être réchauffé.<ol>
<li>Ajouter 300 μL de DS au bas du premier puits.</li>
		<li>Ajouter 300 μL de WS au bas des deuxièmes (c.-à-d. 1WS) et les troisièmes (c.-à-d. 2WS).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faire une goutte de TS (100 μL) sur le couvercle de la boîte de Pétri.</li>
	<li>Avec des pinces, ouvrez un support de vitrification dans le LN2.</li>
	<li>Mettez la chute TS sous le stéréomicroscope et avec un mouvement rapide prendre le support de vitrification de la LN2 et plonger sa bande dans la goutte, le déplaçant jusqu’à ce que tous les COC se détachent. Retirez le support de la goutte dès qu’elle est vide, mais laissez les COC en TS pendant 1 minute au total (de l’immersion jusqu’à l’étape suivante).</li>
	<li>Prenez une pipette semblable à celle utilisée pour la vitrification et remplissez-la de DS. Prenez les COC de la baisse (TS) et déplacez-les vers le bas du premier puits (DS). Attendez 3 minutes.</li>
	<li>Laver la pipette avec 1WS. Prenez les COC et déplacez-les sur le bas du deuxième puits (1WS). Attendez 5 minutes.</li>
	<li>Laver la pipette avec 2WS. Prenez les COC et déplacez-les à la surface du troisième puits (2WS). Attendez qu’ils touchent le fond du puits.</li>
	<li>Répétez l’étape 3.11 à l’aide d’une autre zone du puits.</li>
	<li>Laver la pipette avec un milieu de culture et déplacer les ovocytes dans le plat de culture pour l’utilisation suivante (p. ex., IVM).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La cryoconservation des ovocytes est une technique cruciale de conservation du germplasme, en particulier dans les taxons où de nombreuses espèces sont en voie de disparition, comme la famille des Felidae. Dans ce manuscrit, un protocole simple et respectueux du terrain pour la vitrification des ovocytes immatures de chat a été présenté. Les médias fabriqués en laboratoire, les soutiens à la vitrification minimale en volume et le personnel formé sont les facteurs clés du succès de cette méthode, qui permet d’obtenir des ...

La cryoconservation est devenue une étape clé des techniques de procréation assistée (ART). Chez l’homme, il permet la préservation de la fertilité ou le report de la parentalité pour des raisons médicales ou personnelles. Chez les animaux, il est nécessaire de surmonter la distance et le temps dans les accouplements planifiés, en particulier chez les animaux de ferme et les animaux de compagnie, ou de préserver le matériel génétique de sujets précieux dans les programmes de conservation, en particulier chez les espèces sauvages menacées. La cryoconservation des ormons est le meilleur choix lorsque les individus à élever n’ont pas encore été choisis ou afin d’éviter les problèmes éthiques associés à la congélation d’embryons, en particulier en médecine humaine1. Les spermatozoïdes sont relativement faciles à préserver et donnent des résultats satisfaisants après la décongélation, mais les ovocytes, en raison de leurs caractéristiques structurelles, pourraient être plus complexes à stocker. En effet, le faible rapport surface/volume, ainsi que la présence de la zona pellucida entourant l’ooplasma, limite le mouvement des cryoprotectants et de l’eau à travers la cellule2. En outre, chez les animaux domestiques, y compris les félidés, ils sont caractérisés par un cytoplasme riche en lipides, qui est pensé pour les rendre plus sensibles à la cryoconservation3.
La plupart des félidés sont menacés, et le chat domestique est utilisé comme un modèle pour développer des protocoles pour la préservation du germplasme grâce à la disponibilité des gonades de l’ovariectomie de routine. Chez les animaux sauvages, les gonades peuvent être obtenues après des chirurgies électives ou (plus fréquemment) post-mortem,et les gamètes immatures (vésicule germinale) peuvent être récupérés. La stimulation hormonale visant à obtenir des ovocytes matures (métaphase II) n’est pas aussi commune que dans les ARTs humains en raison des questions éthiques et de la réponse spécifique à l’espèce et à l’individu aux traitements4.
Par conséquent, le développement de stratégies de cryoconservation s’est concentré sur les gamètes immatures, qui peuvent généralement être récupérés après la mort inattendue ou soudaine d’individus rares. D’un point de vue biologique, il existe certaines différences dans la cryoconservation des gamètes immatures ou matures, chacun ayant ses avantages. Tout d’abord, l’ADN est plus protégé dans les ovocytes immatures, dont la vésicule germinale contient des chromosomes entourés d’une membrane nucléaire, tandis que le fuseau meiotique des ovocytes métaphasé II pourrait être plus vulnérable aux cryoin jurys5. Deuxièmement, les dommages causés par le cytosquelette induits par le froid pourraient affecter la rotation des fuseaux, l’extrusion du corps polaire, la migration pronucléaire et la cytokinesis, qui pourraient avoir des impacts différents selon la phase développementale des ovocytes, influençant la progression de la méiose ou les événements post-fertilisation. Enfin, et peut-être le plus important, alors que les ovocytes matures sont prêts à être fécondés, les gamètes immatures s’appuient sur le soutien des cellules cumulus environnantes pour passer par la maturation nucléaire et cytoplasmique6, et c’est la raison pour laquelle des complexes cumulus-ovocytes entiers (COC) sont cryopréservés. Cependant, la perte de cellules cumulus et/ou la perte de connexion fonctionnelle entre le ormiste et les cellules somatiques environnantes sont probablement l’effet le plus néfaste de la cryoconservation des COC immatures.
Parmi les techniques de cryoconservation, la vitrification est une que l’on peut appliquer plus facilement dans des conditions de terrain. Comparativement à la congélation lente (ou à taux contrôlé), la vitrification est plus rapide et ne nécessite pas d’équipement spécifique, comme un congélateur programmable. Afin de satisfaire les trois principes fondamentaux de la vitrification (c.-à-d. une viscosité élevée, liée à une forte concentration cryoprotecteur, de petits volumes et une diminution de température ultra-rapide), plusieurs milieux et supports ont été développés et utilisés spécialement chez les chats pour les ovocytes immatures et matures. En commençant par de simples pailles7, des dispositifs ont ensuite été développés pour atteindre l’objectif « volume minimum ». Cryoloop8, pailles à tiré ouvertes (OPS)9, gouttières en plastique (paille modifiée)10 et cryotubes11 ont été utilisés, jusqu’à ce qu’un dispositif plus efficace (c.-à-d. Cryotop) a été utilisé11, améliorant la survie et la reprise de la méiose. Cryotop (Figure supplémentaire 1) est un support disponible dans le commerce qui est devenu le système ouvert électif pour la vitrification. Développé pour la vitrification des ovocytes humains et des embryons, il se compose d’une petite bande de film attachée à un support en plastique dur, protégé par un bouchon de tube en plastique pendant le stockage12. Grâce à sa facilité d’utilisation et à la réduction extrême du volume de vitrification (aussi peu que 0,1 μL), ce qui conduit également à des taux de refroidissement et de réchauffement extrêmement rapides, ce soutien à la vitrification a été de plus en plus appliqué chez plusieurs espèces, y compris le chat domestique, dans lequel il a été utilisé avec une variété de médias13,14,15,16,17.
Le but de ce manuscrit est de décrire un protocole de réchauffement de la vitrification-vitrification de collection, avec des modifications mineures de celui initialement développé pour les ovocytes humains, qui emploie des supports de laboratoire et commerciaux pour la vitrification minimale de volume et peut être facilement appliqué dans des conditions de champ pour la cryoconservation des COC félins immatures.

<table><tbody><tr><td>Amphotéricine B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td>/</td></tr><tr><td>Pipettes automatiques & pointes</td><td>/</td><td>/Nécessaire</td> <td>pour pipeter 20, 100, 240 et 300 &micro ; L</td></tr><tr><td>Scalpels chirurgicaux</td><td>/</td><td>/</td><td>La taille 10 est généralement acceptable</td></tr><tr><td>Bec Bunsen</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td>Pinces courtes</td><td>/</td><td>/</td><td>Certaines petites (pince anti-moustiques) pour l’isolement des ovaires, d’autres plus grandes (pince Klemmer) pour travailler dans l’azote liquide</td></tr><tr><td>Cryotop</td><td>Kitazato (distributeur : MBT - Medical Biological Technologies)</td><td>01.CR</td><td>Les distributeurs et le numéro de catalogue peuvent changer dans différents pays</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>/</td></tr><tr><td>Éthylène glycol (EG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9129</td><td>/</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>/</td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur en verre</td><td>/</td><td>/</td><td>Longueur conseillée 230 mm (100+130)</td></tr><tr><td>Gobelets</td><td>/</td><td>/</td><td>Selon les bidons de la cuve de stockage</td></tr><tr><td>Étape de chauffage</td><td>/</td><td>/Toutes</td> <td>les étapes de chauffage sont correctes, tant qu’elles peuvent garder 38&ordm ; C</td></tr><tr><td>Azote liquide</td><td>/</td><td>/</td><td>/Medium</td></tr> <tr><td>199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4530</td><td>/</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>/</td></tr><tr><td>Pénicilline G</td><td>sodique Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td>/</td></tr><tr><td>Alcool polyvinylique (PVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td>/</td></tr><tr><td>Plaque</td> <td>de reproductionKitazato (distributeur : MBT - Medical Biological Technologies)</td><td>01.K-2</td><td>Les distributeurs et le numéro de catalogue peuvent changer dans différents pays</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>/</td><td>/Tant</td> <td>que l’opérateur peut sélectionner les ovocytes, les autres stéréomicroscopes sont ok</td></tr><tr><td>Réservoir de stockage</td><td>/</td><td>/</td><td>Tout réservoir régulièrement rempli est ok</td></tr><tr><td>Sulfate de streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td>/</td></tr><tr><td>Boîte en polystyrène / boîte résistante à l’azote</td> <td>/</td> <td>/</td> <td>Toutes les boîtes pouvant contenir de l’azote liquide sont ok, tant que l’opérateur est à l’aise. La boîte Kitazato s’appelle « Cool Rack"Sucrose</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1888</td><td>/</td></tr><tr><td>Timers</td><td>/</td><td>/Tous</td> <td>les timers qui peuvent être réglés sur des horaires jusqu’à 9 minutes sont ok</td></tr></tbody></table>

vitrification minimale en volume des ovocytes félins immatures

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

Dans les programmes de conservation des animaux sauvages, la banque de mentières est cruciale pour protéger les ressources génétiques d’individus précieux et d’espèces rares et pour promouvoir la préservation de la biodiversité. Chez les félidés, la plupart des espèces sont menacées d’extinction, et les races domestiques sont utilisées comme modèle pour accroître l’efficacité des protocoles pour les services bancaires de germplasme. Parmi les techniques de cryoconservation des ovocytes, la vitrification est de plus en plus populaire dans la procréation assistée humaine et vétérinaire. La vitrification cryotop, qui a d’abord été développée pour les ovocytes humains et les embryons, s’est avérée bien adaptée aux ovocytes de chat. Cette méthode offre plusieurs avantages, tels que la faisabilité dans les conditions de terrain et la vitesse de la procédure, qui peut être utile lorsque plusieurs échantillons doivent être traités. Toutefois, l’efficacité dépend fortement des compétences de l’opérateur, et une normalisation intra- et inter-laboratoires est nécessaire, ainsi que de la formation du personnel. Ce protocole décrit la vitrification minimale du volume des ovocytes félins immatures sur un support commercial dans un protocole étape par étape respectueux du terrain, de la collecte des ovocytes au réchauffement. Conformément au protocole, la préservation de l’intégrité des ovocytes et la viabilité au réchauffement (jusqu’à 90 %) bien qu’il y ait encore place à l’amélioration des résultats de maturation après le réchauffement et de développement embryonnaire.

Après la vitrification et le réchauffement des ovocytes de chat selon le protocole actuel (figure 1 et figure supplémentaire 1),la grande majorité des gamètes survivent. Après la vitrification, entre autres techniques, la viabilité peut être évaluée au microscope optique comme l’intégrité morphologique22 ou avec l’utilisation de taches vitales. L’un de ces derniers est le diacétate/propidium de fluorescéine/ipodure de propidium (FDA/PI), qui permet l’...

Ce manuscrit décrit un protocole pour la vitrification minimale de volume des ovocytes immatures de chat avec des médias de laboratoire-faits sur des supports commerciaux. Il couvre chaque étape de l’isolement des ovocytes des gonades ex vivo à la vitrification et au réchauffement.

Vitrification minimale en volume des ovocytes félins immatures

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Ce protocole est utile pour la conservation à long terme des ovocytes félins grâce à une technique de cryopréservation connue sous le nom de vitrification, qui est cruciale pour la fertilité et la préservation de la biodiversité chez les espèces animales. Les principaux avantages de la vitrification sont sa vitesse puisqu’elle peut être achevée en moins de 17 minutes et sa faisabilité sur le terrain si de l’azote liquide est disponible. Le chat domestique est un modèle viable pour les félins sauvages en voie de disparition.Le développement et l’optimisation de protocoles de cryopréservation permettraient d’établir des biobanques de gamete pour les programmes de conservation féline. Commencez par préparer une plaque de vitrification Repro avec trois puits coniques dans une rangée. Ajouter 20 microlitres de solution d’équilibrage au premier puits et 300 microlitres de solution de vitrification aux deuxième et troisième puits.Pour équilibrer les complexes d’ovocytes cumulus, ou COCs, utilisez une pipette à petit alésage pour transférer un ou plusieurs complexes au fond du premier puits. Ajouter lentement 20 microlitres de solution d’équilibrage à la limite de la goutte et attendre trois minutes, puis ajouter 240 microlitres supplémentaires de solution d’équilibrage et attendre neuf minutes. En attendant, préparez une boîte avec de l’azote liquide et étiquetez un support de vitrification avec l’expérience ou le code d’identification du chat.Placez la boîte et soutenez près du microscope stéréo. Après avoir équilibré les COC, effectuez la vitrification en moins de 90 secondes. Pour vitrifier les COC, remplissez la pipette à petit alésage de la solution de vitrification du deuxième puits.Prenez les COC du bas du premier puits et déplacez-les à la surface du deuxième puits. Lavez la pipette avec la solution de vitrification, puis déplacez les COC dans une autre zone du puits et mélangez la solution environnante. Remplissez la pipette d’une solution provenant d’une autre zone du puits.Déplacez les COC et mélangez le milieu qui les entoure avec la pipette. Répétez ce processus une fois de plus. Ensuite, lavez la pipette avec la solution de vitrification du troisième puits et utilisez-la pour déplacer les COC au bas du troisième puits.Encore une fois, mélanger la solution environnante. Après avoir rempli la pipette de solution à partir d’une autre zone du puits, déplacez les COC et mélangez la solution. Répétez ce processus.Remplissez la pointe pipette avec la solution de vitrification d’une autre zone du puits et utilisez-la pour charger les COC sur la bande du support de vitrification près de la pointe, puis aspirez l’excès de milieu. Plongez immédiatement le support de vitrification dans de l’azote liquide et utilisez des pinces pour le fermer, en vous assurant qu’il reste immergé. Conservez les supports de vitrification chargés dans un gobelet et gardez-les dans un réservoir d’azote liquide de stockage jusqu’à ce qu’ils se réchauffent.Placez l’étage chauffant près du microscope stéréo et allumez-le à 38 degrés Celsius. Réchauffer le couvercle d’une boîte de Pétri sur le dessus de la scène, puis transférer les supports de vitrification du réservoir de stockage à une boîte avec de l’azote liquide. Préparez une rangée d’une plaque Repro pour réchauffer chaque support de vitrification.Ajouter 300 microlitres de solution de dilution au premier puits et 300 microlitres de solution de lavage aux deuxième et troisième puits. Sortez la solution de décongélation de l’incubateur et déposez 100 microlitres sur le couvercle de la boîte de Pétri. Utilisez les pinces pour ouvrir le support de vitrification à l’intérieur de l’azote liquide.Placez le couvercle de la boîte de Petri sous le microscope stéréo, puis prenez rapidement le support de vitrification et plongez sa bande dans la goutte, en la déplaçant jusqu’à ce que tous les COC se détachent. Retirez le support de la goutte dès qu’il est vide, mais laissez les COC dans la solution de décongélation pendant une minute. Remplissez une pipette d’une solution de dilution et utilisez-la pour déplacer les COC de la solution de décongélation vers le fond du premier puits avec une solution de dilution.Laissez les COC là pendant trois minutes. Lavez la pipette avec la solution de lavage du deuxième puits, puis prenez les COC et déplacez-les au fond du deuxième puits. Attends cinq minutes.Lavez la pipette avec une solution à partir du troisième puits et utilisez-la pour déplacer les COC du deuxième puits à la surface du troisième puits. Attendez que les COC touchent le fond du troisième puits. Répétez ensuite le processus avec un autre puits.Une fois terminée, laver la pipette avec le milieu de culture et déplacer les ovocytes dans un plat de culture. La grande majorité des gamètes survivent après la vitrification des ovocytes et le réchauffement selon ce protocole. Une image représentative d’un complexe viable vitrifié d’oocytes chauds de chat souillés avec le diacétate de fluorescéine et l’iodure de propidium est montrée ici.Ce tableau montre le pourcentage de survie après vitrification, qui représente les données post-réchauffement des ovocytes destinés à la maturation in vitro. Sur 435 ovocytes, 395 ont survécu, avec une viabilité globale de 90,8 % après le réchauffement. Cependant, certains changements morphologiques peuvent être remarqués après le réchauffement.Les anomalies morphologiques les plus fréquentes sont les changements dans la forme et la granulation d’ooplasme, la perte partielle ou parfois totale des cellules de cumulus, et les ruptures de pellucida de zona. Lorsque vous essayez cette procédure, n’oubliez pas de préparer les médias à l’avance afin qu’ils soient la bonne température avant utilisation et de suivre les températures du protocole et les calendriers pour éviter la toxicité cellulaire. Le protocole pourrait également être appliqué aux ovocytes d’autres espèces.En cas de succès, cela pourrait également contribuer à la banque de plasmes germinales pour la préservation de la biodiversité chez les félins en voie de disparition.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Ce manuscrit décrit une approche expérimentale pour caractériser morphologiquement et biochimiquement les ovocytes à cheval. Plus précisément, le présent travail illustre comment recueillir des ovocytes à cheval immatures et matures par captage d'ovules guidé par ultrasons (OPU) et comment étudier la ségrégation des chromosomes, la morphologie de la broche, l'acétylation des histones mondiales et l'expression de l'ARNm.

Analyse de la ségrégation chromosomique, de l&#39;acétone d&#39;histone et de la morphologie de la broche dans les ovocytes

Présenté ici sont deux protocoles pour l’encapsulation des ovocytes porcins dans les conditions de culture 3D. Dans le premier, les complexes cumulus-oocytes (COC) sont encapsulés dans des perles de fibrine-alginate. Dans la seconde, ils sont enfermés avec des particules de poudre d’éthylène fluoré (microbioréacteurs). Les deux systèmes assurent des conditions optimales pour maintenir leur organisation 3D.

Hydrogels d’Alginate et microbioréacteurs hydrophobes protéolytically dégradés pour l’encapsulation des oocytes porcins

La cryoconservation des ovocytes est reconnue par plusieurs sociétés scientifiques internationales comme la norme d’or pour la préservation de la fertilité chez les femmes postpubères. Des stratégies cliniques et de laboratoire appropriées garantissent une efficacité, une efficience et une sécurité maximales des traitements de préservation de la fertilité.

Préservation de la fertilité par vitrification des ovocytes : perspectives cliniques et de laboratoire

Le protocole vise à fournir une méthode standard pour la vitrification des ovocytes de moutons adultes et juvéniles. Il comprend toutes les étapes de la préparation du milieu de maturation in vitro à la culture post-réchauffement. Les ovocytes sont vitrifiés au stade MII en utilisant Cryotop pour assurer le volume essentiel minimum.

Vitrification d’ovocytes mûris in vitro prélevés sur des ovaires adultes et prépubéraux chez des moutons

Une équipe dédiée peut offrir aux patientes Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser la possibilité d’effectuer une stimulation ovarienne contrôlée et une cryoconservation ovocytaire au moment de la vaginoplastie laparoscopique.

Prélèvement d’ovocytes laparoscopiques et cryoconservation au cours de la vaginoplastie pour le traitement du syndrome de Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser

Un protocole de vitrification du tissu ovarien, en tant que méthode de cryoconservation alternative au protocole de congélation lente largement utilisé, est présenté.

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Ce protocole décrit des méthodes standardisées pour isoler et traiter le liquide folliculaire, les cellules somatiques et les ovocytes immatures à partir de procédures de FIV, permettant des analyses moléculaires et cellulaires de haute qualité. Ces approches soutiennent la recherche translationnelle sur la fertilité, le vieillissement reproductif et le dysfonctionnement ovarien à l’aide de matériaux généralement jetés dans les soins cliniques.

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Ce protocole décrit les procédures de maturation in vitro des ovocytes de souris, la fécondation in vitro et la culture embryonnaire subséquente jusqu’au stade de blastocyste.

Maturation in vitro des ovocytes de souris, fécondation et culture des embryons préimplantatoires

Nous rapportons ici l'expression robuste et efficace de protéines fluorescentes après l'injection d'ARNm dans des ovocytes non fécondés de Branchiostoma lanceolatum. Le développement de la technique de micro-injection dans ce chordés basale ouvrira la voie à grande portée des innovations techniques dans ce système de modèle émergent, y compris l'imagerie in vivo et les manipulations spécifiques de gènes.

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Découvrez la vitrification minimale en volume des ovocytes félins immatures pour la préservation de la fertilité. Cette méthode rapide et réalisable sur le terrain contribue à la conservation de la biodiversité des espèces menacées.

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