Production automatisée de neurones corticals et dopaminergiques pluripotents induits par l’homme avec surveillance intégrée des cellules vivantes

L’objectif global de cette étude est de montrer comment mettre en œuvre des procédures automatisées pour la culture et la différenciation des cellules IPS humaines en lignées neuronales, ainsi que leur imagerie automatisée. Les procédures automatisées normalisées permettent de faibles variations expérimentales tout en assurant une reproduisabilité phénotypique élevée. En outre, le système peut être adapté à l’élaboration de nouveaux protocoles.

Joachim Tager et Elisangela Bressan, post-docs de notre laboratoire, démontreront les procédures. Dans l’interface utilisateur graphique du système automatisé, cliquez sur la vue du processus des instruments de ressources et sélectionnez le processus de l’instrument de ressources. Cliquez sur exécuter le processus de l’instrument et exécuter le capot HEPA exécuté et les processus de rechargement.

Sélectionnez les ressources à charger, ouvrez la porte et chargez les plaques de culture cellulaire et les conseils jetables dans les positions appropriées comme indiqué par les images popup. Décontaminez ensuite la porte avec 70 % d’éthanol avant de fermer et d’exécuter le processus de décontamination. Le système sera stérilisé par rayonnement UV pendant 30 minutes.

Pour charger les plaques avec un support de culture ou un reagent de dissociation, exécutez l’étape de capot HEPA et ouvrez la porte de la station de manutention liquide. Après décontamination avec 70 % d’éthanol, placez les réservoirs sur le pont jusqu’à la position assignée et dé-couverclez-les. Fermez la porte de la station de manutention liquide, puis exécutez le processus d’instrument de ressources InitHepaHood pour alimenter le capot HEPA.

Pour exécuter une méthode de culture automatisée, dans la vue calendrier de l’interface utilisateur graphique, cliquez sur ajouter l’étape du processus et sélectionnez la ligne cellulaire à utiliser dans l’expérience. Utilisez l’assistant pour sélectionner le projet et marquer le lot à utiliser. Cliquez sur la pointe des flèches orientée vers la droite et accédez à la page suivante de l’assistant pour sélectionner l’étape de processus à exécuter.

Dans la dernière page de l’assistant, planifiez l’expérience et définissez les paramètres appropriés détaille les variables nécessaires à l’exécution de la méthode. Ensuite, cliquez sur OK. Après le chargement d’un tube de 50 millilitres avec la suspension cellulaire IPS humaine, chargez les plaques de culture enduites pour recevoir les cellules sur l’étagère et exécutez l’ensemencement des plaques à partir de la méthode des tubes. Pour compter les cellules du cytomètre d’imagerie Brightfield, préparez automatiquement une plaque de comptage de 384 puits avec suspension cellulaire sur le pont et utilisez le bras robotique pour transférer la plaque de comptage de 384 puits du pont au cytomètre d’imagerie Brightfield.

Après comptage, le système retournera la plaque à sa position d’origine et transférera une culture enduite ou une plaque d’essai de l’étagère à la plate-forme de pipetting. Le système ensemencera ensuite les cellules dans le nombre et les volumes définis par l’utilisateur qui conviennent à la plaque et se mélangeront par pipetting. Après l’ensemencement, la plaque sera déplacée au shaker sur le pont pendant 10 secondes à 500 tours par minute pour la distribution cellulaire avant d’être transférée à l’incubateur de dioxyde de carbone.

Pour évaluer la confluence automatisée, exécutez la méthode de confluence de vérification et sélectionnez un lot qui contient au moins une plaque de culture et aucune plaque d’analyse. Dans la section détail des paramètres, entrez les iPSCf_2020 l’acquisition d’images dans les paramètres d’analyse d’imagerie. Le système transférera ensuite la première plaque de l’incubateur au cytomètre d’imagerie Brightfield et imagera la confluence cellulaire.

Pour changer la culture cellulaire ou les supports de plaques d’analyse, exécutez le changement médiatique de la méthode des plaques de culture et sélectionnez un lot contenant uniquement des plaques de culture. Le système transférera les plaques sur le pont et inclinera les plaques pour permettre l’aspiration du surnatant. Le supernatant sera jeté au module de collecte des déchets et jetera les pointes et 12 millilitres de milieu frais seront ajoutés à chaque assiette.

Le système re-couvercle les plaques et retourner les plaques à l’incubateur de culture cellulaire. Alternativement, pour changer le milieu des plaques d’essai, exécutez le changement de médias de la méthode de plaques d’essai. Pour sublimer les cellules, exécutez la subcultivation de la méthode des cellules adhérentes et sélectionnez le lot contenant les plaques de culture qui ont besoin d’être subcultivées.

Après avoir jeté le milieu, le système lavera les cellules une fois avec huit millilitres de PBS par plaque avant d’ajouter huit millilitres de 0,5 millimolar EDTA aux cellules. Après huit minutes sur le pont avec option d’inclinaison, l’EDTA sera remplacé par 12 millilitres de milieu frais par assiette. Le système va secouer les plaques à 2000 révolutions par minute pendant une minute pour déloger les colonies avant de triturer les cellules avec cinq cycles de pipetting pour briser les colonies en 50 à 80 touffes de microns.

Les cellules seront ensuite transférées dans un tube de 50 millilitres sur le pont avant de les ensemencer dans un rapport de fractionnement d’un à sept. Pour l’imagerie cellulaire automatisée à haute teneur et à haut débit, exécutez la méthode d’imagerie et sélectionnez un lot qui contient au moins une plaque d’analyse et aucune plaque de culture. Le système transférera ensuite une plaque d’analyse au microscope confocal automatisé pour l’imagerie.

Assurez-vous de sélectionner les iD de lots et de plaques corrects tout en effectuant les étapes de processus requises. Les cultures hiPSC devraient être surveillées quotidiennement pour la croissance et analysées pour leur pourcentage de confluence dans le cytomètre d’imagerie Brightfield. Après avoir réussi et la culture manuelle ou automatisée du système, les cellules présentent une expression typique de marqueur de cellules souches et de pluripotence.

Les neurones différenciés dans le système de culture automatisé démontrent une morphologie similaire et une organisation neuronale du réseau aux neurones cultivés manuellement. Après six jours de différenciation, les neurones corticals automatiquement différenciés sont positifs pour la bêta-tubuline de classe III spécifique au neurone et l’expression du marqueur de la couche corticale supérieure. Après huit jours, les cellules ont également exprimé la protéine 2 microtubule-associée, la molécule d’adhérence de cellules neurales, et la synapsine I, aussi bien que les marqueurs corticals de neurone.

L’expression très faible ou aucune de ces marqueurs est observée dans hiPSC. Ce système peut également être utilisé pour établir un essai automatisé de neurite de neurite vivant qui permet de mesurer les longueurs de neurite sur 11 jours de différenciation sans intervention manuelle. L’utilisation du système de culture automatisé pour effectuer des changements moyens sur une période de culture de 65 jours facilite la différenciation hiPSC en neurones dopaminergiques midbrain avec l’organisation cellulaire attendue et la morphologie.

En plus de l’excroissance neurite, d’autres analyses phénotypiques automatisées pertinentes pour étudier la neurodégénérescence, par exemple, les foyers d’ARN translocation TDP-43 et l’absorption fibril alpha-synucléine, peuvent être explorées à l’aide de ce format à haut débit et à contenu élevé.