Isolement et culture de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse mandibulaire chez le rat

Des études ont montré que les BMSC dérivées de l’os facial crânien présentent des capacités supérieures à celles des os axiaux et appendiculaires. Par conséquent, les BMSC mandibulaires sont considérées comme la ressource privilégiée pour le développement de futurs traitements des maladies craniofaciales. Ce protocole combine les avantages de l’adhérence de la moelle osseuse entière et du tri cellulaire fluorescent pour obtenir un nombre significatif de BMSC mandibulaires purifiées en peu de temps.

Si vous essayez ce protocole pour la première fois, je pense qu’il est très important de comprendre la structure anatomique et le mouvement fonctionnel de la mandibule du rat, ce qui peut être réalisé en regardant cette vidéo ou en lisant la littérature connexe. Après avoir euthanasié le rat, placez-le dans une hotte propre en position couchée. Incisez la peau et les muscles buccinateurs de l’angulus oris bilatéral à la région postérieure de la mandibule.

Ouvrez la bouche du rat en poussant les incisives maxillaires et mandibulaires vers la direction opposée avec les deux pouces, pour exposer les dents mandibulaires, qui sont attachées à la mandibule. Déconnecter complètement les muscles buccaux et les tendons attachés aux coracoïdes et le bord inférieur de la mandibule. Appuyez ensuite sur les dents postérieures mandibulaires et faites-les pivoter vers l’arrière et vers le bas jusqu’à ce que les condyles des deux côtés soient clairement exposés.

Séparez le corps de la mandibule du crâne et nettoyez les tissus mous adhérents à la surface de l’os à l’aide d’une gaze humide. Placez l’os dans un plat en verre stérile de 10 centimètres rempli de milieu alpha essentiel minimum prérefroidi, ou PBS sur glace, pour préserver la viabilité. Coupez l’os antérieur le long du bord mésial de la première molaire du corps mandibulaire, puis retirez la branche mandibulaire, y compris la coracoïde et le condyle, le long du bord distal de la troisième molaire pour exposer la cavité de la moelle.

Remplissez un plat en verre stérile de 10 centimètres avec 10 millilitres d’alpha-MEM avec 10 % FBS. Aspirez le milieu avec une seringue de 10 millilitres, puis insérez l’aiguille dans la cavité de la moelle osseuse et rincez à plusieurs reprises la moelle osseuse dans le plat. Rincer la cavité osseuse au moins trois fois des côtés mésial et distal de l’os respectivement, jusqu’à ce que l’os devienne blanc.

Transférez le milieu contenant les cellules rincées dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et centrifugez-le à 800 tr/min et pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et remettez en suspension les cellules avec trois millilitres d’alpha-MEM avec 10 % FBS. Placez les cellules dans une nouvelle boîte de culture de 10 centimètres et incuberez-les à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone.

Aspirez le milieu de culture et lavez le plat avec du PBS. Ajoutez deux millilitres de trypsine à 0,25 % avec 0,02 % d’EDTA dans la boîte et digérez les cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite quatre millilitres d’alpha-MEM avec 10 % FBS pour arrêter la réaction.

Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et centrifugez-la à 800 tr/min pendant cinq minutes. Remettre les cellules en suspension dans 120 microlitres de PBS avec 10 % FBS après centrifugation. Transférez 100 microlitres de suspension cellulaire dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse.

Bloquez les suspensions cellulaires avec un microlitre d’anticorps contre CD16 à CD32 à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes, et colorez les cellules avec un anticorps conjugué PE contre CD45, un anticorps conjugué FITC contre CD90 et un anticorps APC contre CD29, à quatre degrés Celsius pendant une heure dans l’obscurité. Utilisez les 20 microlitres restants de suspension cellulaire comme contrôle négatif non coloré. Centrifugez les tubes à 800 tr/min pendant cinq minutes.

Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 0,5 millilitre de PBS avec 10 % FBS. Ajouter 10 microlitres de 0,01 milligramme par millilitre de DAPI 10 minutes avant l’analyse. Utilisez des filtres de 40 nanomètres placés sur des tubes à centrifuger pour filtrer les cellules, puis analysez les cellules sur un trieur de cellules activé par fluorescence.

Tout d’abord, éliminez les cellules mortes du nombre total de cellules en bloquant les cellules DAPI négatives, puis les cellules CD29 positives, CD90 positives et CD45 négatives dans les cellules sélectionnées en tant que mBMSC ciblées. Collectez les mBMSC triés dans un tube à centrifuger de 15 millilitres avec cinq millilitres d’alpha-MEM avec 10 % FBS. Centrifugez les tubes à 800 tr/min pendant cinq minutes et retirez le tampon de collecte.

Ajoutez un millilitre de milieu frais pour remettre les cellules en suspension, puis placez-les dans une boîte de culture de six centimètres. En utilisant ce protocole, une grande proportion de cellules ont adhéré à la plaque le troisième jour après la culture initiale. Après trois à quatre jours supplémentaires de culture, la confluence cellulaire a atteint 70 à 80 %.

Après avoir cultivé des mBMSC P2 dans une plaque à six puits pendant une semaine, une quantité importante d’unités formant des colonies a été observée. Pour évaluer la capacité de différenciation multi-lignées des mBMSC, ils ont été induits en lignées ostéo-chondro-et adipo-liées. L’augmentation de l’activité de l’ALP, des nodules calcifiants rouges sous coloration rouge d’alizarine et l’expression accrue des gènes spécifiques ostéogéniques Runx2, Alp, Bsp et Ocn, ont indiqué l’induction ostéogénique.

La coloration rouge-huile O a été utilisée pour identifier l’adipogenèse. De nombreuses vacuoles riches en lipides étaient évidentes après neuf jours d’induction. De plus, l’expression des gènes spécifiques adipogéniques Ppar-gamma-1 et Cebpa a été augmentée.

Les échantillons ont montré une coloration positive pour le bleu d’Alcian lors de l’observation microscopique de la différenciation chondrogénique. De plus, l’immunomarquage avec des anticorps anti-collagène de type II a montré une accumulation accrue de la matrice cartilagineuse. Il est très important d’assurer la viabilité des mBMSC dans ce protocole.

Cet objectif peut être atteint en choisissant un animal de laboratoire approprié, en opérant sur de la glace et en raccourcissant la durée de l’expérience. En utilisant ce modèle in vitro, on peut obtenir un grand nombre de BMSC mandibulaires prolifératives, ce qui peut faciliter l’étude des caractéristiques biologiques, la réaction ultérieure au microenvironnement et d’autres applications des BMSC mandibulaires.