Name: Isolement et culture de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse mandibulaire chez le rat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Apprenez l'isolement et la culture de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse mandibulaire chez le rat. Cette méthode combine l'adhérence de moelle osseuse entière et le tri par cytométrie en flux pour obtenir des cellules purifiées.

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Nous remercions le Laboratoire de stomatologie numérisée et le Centre de recherche sur les anomalies craniofaciales du neuvième hôpital populaire de Shanghai. Le travail de ce manuscrit est soutenu par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit &Plateau Disciplines, le fonds SHIPM-mu de Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], le projet d’incitation de l’équipe d’innovation de haut niveau pour Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Et L.J. est un chercheur du programme de développement des jeunes talents médicaux exceptionnels, du programme de développement des jeunes « Rising Stars of Medical Talent » de Shanghai et du projet « Chen Xing » de l’Université Jiaotong de Shanghai.

Toutes les procédures expérimentales animales dans ce document ont été approuvées par le Comité de soins aux animaux du neuvième hôpital populaire de Shanghai, École de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai.
1. Préparation
<ol><li>Utilisez deux rats Sprague Dawley mâles de 5 semaines pour l’expérience.</li>
	<li>Stérilisez tous les instruments, y compris les porte-aiguilles, les pinces et les ciseaux à haute température ou immergés dans de l’éthanol à 75% pendant 10 min. REMARQUE: L’immersion à l’éthanol ne doit pas être trop longue pour éviter les dommages aux cellules.</li>
	<li>Préparer au préalable les milieux de culture, dont la composition est fournie dans le tableau 1. Complétez chaque support comme décrit ci-dessous.<ol>
<li>Préparation du milieu de culture α-MEM (avec 10% FBS): Compléter l’alpha du milieu essentiel minimum (α-MEM) avec 10% de sérum fœtal bovin et 1% de pénicilline et de streptomycine.</li>
		<li>Préparation du milieu de différenciation ostéogénique: Compléter le milieu basal de différenciation ostéogénique avec 10% de sérum fœtal bovin, 1% de glutamine, 1% de pénicilline-streptomycine, 0,20% d’acide ascorbique, 1% de β-glycérophosphate et 0,01% dexaméthasone.</li>
		<li>Préparation du milieu d’induction ostéogénique: Mélanger 70% α-MEM milieu de culture (avec 10% FBS) et 30% milieu de différenciation ostéogénique.</li>
		<li>Préparation du milieu de différenciation adipogène A: Compléter le milieu basal de différenciation adipogène avec 10% de sérum fœtal bovin, 1% de glutamine, 1% de pénicilline-streptomycine, 0,20% d’insuline, 0,10% IBMX, 0,10% rosiglitazone et 0,01% de dexaméthasone.</li>
		<li>Préparation du milieu B de différenciation adipogène: supplément de milieu basal de différenciation adipogène avec 10% de sérum bovin fœtal, 1% de glutamine, 1% de pénicilline-streptomycine et 0,20% d’insuline.</li>
		<li>Préparation du milieu de différenciation chondrogène: Compléter le milieu basal de différenciation chondrogène avec 0,01% de dexaméthasone, 0,30% d’acide ascorbique, 1% ITS, 0,10% pyruvate de sodium, 0,10% proline et 1% TGF-β3. REMARQUE: Le milieu de différenciation ostéogénique doit être utilisé dans le mois suivant la configuration. La période effective du milieu de différenciation chondrogène configuré est de 12 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolement et culture des mBMSC de rat
NOTA : Toutes les opérations expérimentales devraient être effectuées sur la glace dans la mesure du possible pour maintenir la viabilité des cellules.
<ol><li>Récolte des mandibules de rat<ol>
<li>Euthanasier deux rats mâles de Sprague Dawley âgés de 5 semaines par asphyxie de CO2. Assurez-vous que la respiration de l’animal est arrêtée avant de poursuivre l’expérience.</li>
		<li>Rincez ces rats dans un bécher contenant 75% d’éthanol pendant 3 min.</li>
		<li>Placez le rat à l’intérieur d’une hotte propre pour récolter les mandibules. REMARQUE: Stériliser la hotte par rayonnement ultraviolet pendant 30 min avant utilisation.</li>
		<li>Placez le rat en décubitus dorsal. Incise les peaux et les muscles buccinateurs de l’oris bilatéral d’angulus à la région postérieure de la mâchoire inférieure, qui est le seul os mobile avec l’inciseur inférieure. REMARQUE: Il est recommandé de faire une incision de 2 cm de chaque côté de l’oris angulus pour obtenir un champ d’opération clair.</li>
		<li>Ouvrez la bouche du rat en poussant les incisives maxillaires et mandibulaires vers la direction opposée avec les deux pouces pour exposer les dents mandibulaires, qui sont attachées à la mandibule.</li>
		<li>Déconnectez complètement les muscles buccaux et les tendons attachés aux coracoïdes et à la bordure inférieure de la mandibule. REMARQUE: Une mobilité accrue de la mandibule est observée au cours de cette étape en raison de l’absence de tension musculaire.</li>
		<li>Appuyez sur les dents postérieures mandibulaires et tournez vers l’arrière et vers le bas jusqu’à ce que les condyles des deux côtés soient clairement exposés. REMARQUE: Cette étape est effectuée pour ouvrir artificiellement la bouche du rat dans toute la mesure du possible pour disloquer le condyle. La mandibule est reliée au crâne par des condyles bilatéraux, de sorte que l’exposition des condyles conduit à la déconnexion entre le crâne et la mandibule.</li>
		<li>Séparez le corps de la mandibule du crâne.</li>
		<li>Nettoyez les tissus mous adhérents sur la surface osseuse à l’aide d’une gaze humide.</li>
		<li>Placez l’os dans un plat en verre stérile de 10 cm rempli de α milieu essentiel minimum (α-MEM) ou de tampon phosphate salin (PBS) pré-frais pré-tampon sur la glace pour préserver la viabilité.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolement et culture des mBMSCs<ol>
<li>Couper l’os antérieur le long du bord mésial de la première molaire du corps mandibulaire. Enlever le ramus mandibulaire comprenant la coracoïde et le condyle le long du bord distal de la troisième molaire pour exposer la cavité de moelle /courgette.</li>
		<li>Remplissez un plat en verre stérile de 10 cm avec 10 mL de α-MEM (avec 10% fbs).</li>
		<li>Utilisez une seringue de 1 mL pour aspirer α-MEM. Avec l’aiguille de la seringue insérée dans la cavité de la moelle osseuse, rincer à plusieurs reprises la moelle osseuse dans le plat. Rincer la cavité osseuse au moins 3 fois des côtés mésial et distal de l’os, respectivement, jusqu’à ce que l’os soit devenu blanc. REMARQUE: Il s’agit de l’étape la plus critique, car la cavité de la moelle osseuse d’une mandibule de rat n’est pas aussi évidente que dans l’os long et le point approprié pour insérer l’aiguille doit être déterminé empiriquement. Tous les échantillons expérimentaux ci-dessus doivent être stockés sur de la glace pour maintenir la viabilité cellulaire et donc le temps de fonctionnement ne doit pas dépasser 2 h.</li>
		<li>Transférer le support contenant les cellules rincées dans un tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 800 x g dans 4 °C pendant 5 min. Jetez le surnageant.</li>
		<li>Ressuscitez les cellules avec 3 mL de α-MEM (avec 10% FBS). Plaquer les cellules dans un nouveau plat de culture de 10 cm et incuber à 37 °C dans un incubateur à 5 % deCO2.</li>
		<li>Vérifiez les changements morphologiques et la croissance de ces cellules le 3ème jour de culture. Retirer le milieu de culture avec des cellules non ahérientes et des fragments de tissu. Ajouter doucement 10 mL de α-MEM frais (avec 10% fbs).</li>
		<li>Après 7 jours de culture, les MBMSC P0 ont atteint 70% à 80% de confluence.</li>
	</ol></li>
	<li>Tri des cellules de flux REMARQUE: Les mBMSC P0 ont été identifiés phénotypiquement et principalement purifiés par tri des cellules d’écoulement.<ol>
<li>Aspirez et jetez le milieu de culture, puis lavez le plat avec du PBS. Jetez le système de fourchettes de prix.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de trypsine à 0,25 % avec 0,02 % d’EDTA dans le plat. Digérer les cellules à 37 °C pendant 5 min, puis ajouter 2 mL de α-MEM (avec 10 % de FBS) pour arrêter la réaction.</li>
		<li>Transférer la suspension des cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 800 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Ressusciter les cellules dans 120 μL de PBS (avec 10% fbs) après centrifugation.</li>
		<li>Bloquer ces suspensions cellulaires avec 1 μL d’anticorps contre CD16/CD32 à 4 °C pendant 15 min.</li>
		<li>Transférer 100 μL de la suspension cellulaire dans un nouveau tube microcentrifuge, colorer les cellules avec de l’anticorps conjugué à la phycoérythrine (PE) contre CD45, de l’anticorps conjugué à la fluorescéine-isothiocyanate (FITC) contre le CD90 et de l’anticorps allophycocyanique (APC)-contre le CD29 à 4 °C pendant 1 h dans l’obscurité13,15. La concentration d’anticorps utilisés dans cette expérience est indiquée dans le tableau 2. Utilisez les 20 μL de suspension cellulaire autres comme témoin négatif non coloré.</li>
		<li>Ensuite, centrifugez les tubes à 800 x g pendant 5 min, jetez la suspension et ressuscitez les cellules dans 0,5 mL de PBS (avec 10% fbs).</li>
		<li>Ajouter 10 μL de DAPI de 0,01 mg/mL pendant 10 min avant l’analyse.</li>
		<li>Utilisez des filtres de 40 nm placés sur des tubes à centrifuger pour filtrer les cellules.</li>
		<li>Analysez les cellules sur le trieur de cellules activé par fluorescence. Définissez les panneaux comme suit. Tout d’abord, retirez les cellules mortes du nombre total de cellules en gating DAPI- cellules, puis porte CD29+CD90+CD45- dans les cellules sélectionnées en tant que mBMSCs ciblés.</li>
		<li>Recueillir les cellules triées CD29+CD90+CD45dans un tube centrifuge de 15 mL avec 3 mL de α-MEM (avec 10% FBS) pré-préparé.</li>
		<li>Centrifuger les tubes à 800 x g pendant 5 min. Retirez le tampon de collecte et ajoutez 1 mL de α-MEM frais (avec 10% FBS) pour ressusciter les cellules. Ensuite, plaquez-les dans un plat de culture de 6 cm.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Capacité de formation des colonies
Remarque : Cette étape a été effectuée pour vérifier la capacité de division des mBMSCs. 15 ans
<ol><li>Sélectionnez les mBMSC de deuxième passage (P2) pour cette expérience. Lorsque la confluence cellulaire a atteint 80% à 90%, réenseménagé les cellules dans un gradient sériel dans une plaque de 6 puits pour évaluer leur capacité de prolifération clonale. NOTA: Il est recommandé de définir le gradient de 1 x 102 à 1 x 103 cellules par puits, mais les dilutions finales de différentes lignées cellulaires d’origine humaine ou animale ont été déterminées empiriquement.</li>
	<li>Culturez les cellules dans α-MEM (avec 10% FBS) pendant environ deux semaines jusqu’à ce qu’un bon nombre d’unités formant colonies puissent être vues au microscope optique. Actualisez le support de culture tous les 3 jours.</li>
	<li>Aspirer et jeter le milieu de culture, laver les puits avec du PBS deux fois pendant 5 min à la fois. Ensuite, ajoutez une solution de paraformaldéhyde à 4% à chaque puits et fixez pendant au moins 10 min.</li>
	<li>Retirer le paraformaldéhyde et rincer les puits deux fois avec du PBS.</li>
	<li>Colorer les cellules avec une solution de coloration cristalline violette et les incuber à 37 °C pendant environ 10 min. REMARQUE: Le temps de coloration ajusté de manière appropriée jusqu’à ce que l’ombre souhaitée soit atteinte.</li>
	<li>Retirez la solution de coloration et lavez les échantillons avec de l’eau distillée pour arrêter la réaction.</li>
	<li>Image sous stéréomicroscope et comptage des colonies de cellules dispersées qui se composaient d’au moins 50 cellules.</li>
</ol>4. Différenciation multilinéaire des MBMSC
NOTA : Les MBMSC P2 ont été utilisés pour des expériences subséquentes, sauf indication contraire.
<ol><li>Induction ostéogénique de mBMSCs<ol>
<li>Digérer les mBMSCs comme décrit ci-dessus. Cellules de semence à une densité de 2,5 x 105/cm2 dans une plaque de 12 puits complétée par 1 mL α-MEM (avec 10% FBS).</li>
		<li>Lorsque la confluence cellulaire a atteint 60-70%, changez le milieu en milieu d’induction ostéogénique à 30%. Culturez les cellules avec α-MEM (avec 10% FBS) comme contrôle négatif et changez le milieu tous les 2 jours. REMARQUE: Après l’apparition d’un grand nombre de nodules de calcium au cours de l’ostéogenèse, il est recommandé de changer le modèle d’échange moyen à un échange moyen à demi-volume tous les 2 jours, afin d’empêcher les ostéoblastes de flotter.</li>
		<li>Après culture pendant sept jours, évaluer la calcification de ces cellules par coloration phosphatase alcaline16,17.</li>
		<li>Retirer le milieu de culture et fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant 10 min. Rincer les cellules à l’aide de 1 mL de PBS par puits pendant 3 min deux fois.</li>
		<li>Ensuite, colorez les cellules avec une solution de coloration de phosphatase alcaline et incuber à 37 ° C pendant 10-30 min. REMARQUE: L’incubation peut être effectuée pendant la nuit à température ambiante pour obtenir la couleur requise.</li>
		<li>Lavez les puits avec de l’eau distillée pour arrêter la réaction. Prenez des photos au microscope optique. Les granules pigmentés rouges représentent l’activité de la phosphatase alcaline (ALP).</li>
		<li>Après avoir culture les cellules restantes pendant encore 7 jours, effectuez une coloration rouge à l’alizarine pour évaluer la capacité de minéralisation des cellules.</li>
		<li>Colorer les cellules avec une solution de coloration rouge à 0,5% d’alizarine après fixation cellulaire pendant 10 min16,18. Arrêtez la réaction chromogène avec de l’eau distillée après 3-5 min. REMARQUE: Le temps de réaction peut être prolongé en fonction de la couleur développée.</li>
		<li>Enfin, placez la plaque de culture sous le microscope optique pour observer l’effet de la coloration ostéogénique; les nodules rouges indiquent des dépôts de calcium de ces cellules.</li>
	</ol></li>
	<li>Induction adipogène de mBMSCs<ol>
<li>Semences P2 mBMSC dans une plaque de 12 puits comme décrit ci-dessus.</li>
		<li>Après le puits devenir 90% confluent, culturez les cellules avec le milieu de différenciation adipogène A. Utilisez des cellules cultivées dans α-MEM milieu de culture (avec 10% FBS) comme contrôle négatif.</li>
		<li>Après 2 jours d’induction, aspirer le milieu A du puits et ajouter 1 mL de milieu de différenciation adipogène B dans chaque puits.</li>
		<li>Après une journée, retirez le milieu B et recommencez le cycle avec le milieu A rajouté dans le puits. Culturer les cellules alternativement en utilisant le milieu A et B.</li>
		<li>Appliquer alternativement le milieu de différenciation A et B pendant trois cycles et détecter l’adipogenèse de ces cellules par coloration huile rouge O16,18. REMARQUE: Beaucoup de gouttelettes lipidiques rondes et grosses peuvent être observées en cultivant ces cellules avec le milieu de différenciation B pendant 2 à 3 jours supplémentaires.</li>
		<li>Retirez le milieu et fixez les cellules avec du paraformaldéhyde à 4% pendant 10 min. Laver les cellules avec du PBS.</li>
		<li>Colorer les cellules avec une solution de coloration au rouge O d’huile et incuber à 37 °C pendant environ 3 min.</li>
		<li>Retirez la solution de coloration et lavez les puits avec de l’eau distillée.</li>
		<li>Observer l’adipogenèse au microscope optique.</li>
	</ol></li>
	<li>Induction de chondrogenèse de mBMSCs<ol>
<li>Graines P2 mBMSC dans un tube à centrifuger de 15 mL à une densité de 5 x 105/cm2.</li>
		<li>Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 5 min. Jetez le surnageant.</li>
		<li>Ressuscitez les cellules avec 0,5 ml de milieu de différenciation chondrogenic. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Desserrez le capuchon du tube à centrifuger et incuber à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. Renouveler le support tous les 2 jours. REMARQUE: Les cellules commencent à enrober après 24 h. Il est recommandé de ne pas déplacer le tube de centrifugation pendant 48 h. Veillez à ne pas aspirer la pastille cellulaire lors du changement de milieu.</li>
		<li>Après 21 jours d’induction, fixer les pastilles cellulaires avec du paraformaldéhyde à 4%, suivi de déshydratation, d’encastrement de paraffine et de sectionnement.</li>
		<li>Après déparaffination et hydratation, colorer les lames dans une solution bleue d’Alcian pendant au moins 15 min18,19,20,21,puis laver à l’eau distillée pour arrêter la réaction. Capturez les photographies au microscope optique.</li>
		<li>Pour la coloration immunofluorescente du collagène de type II, effectuez les étapes ci-dessous.<ol>
<li>Incuber les lames avec 5 μg/mL de protéinase K pendant 15 min à 37 °C après l’étape de déparaffination et d’hydratation.</li>
			<li>Incuber les lames dans un tampon de blocage pendant 1 h à 37 °C.</li>
			<li>Appliquer 1 μL d’anticorps de collagène de type II dans 200 μL de tampon de blocage sur les lames et incuber pendant la nuit à 4 °C.</li>
			<li>Le lendemain, lavez deux fois les lames avec du PBS et incuber avec des anticorps secondaires à 37 °C pendant 1 h.</li>
			<li>Incuber les tranches avec 40,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pendant 10 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prenez des photos de chaque lame sous microscopie à fluorescence.</li>
	</ol></li>
</ol>5. PCR en temps réel
<ol><li>Extraire l’ARN total des mBMSCs à l’aide d’un réactif disponible dans le commerce à base d’isothiocyanate de guanidium.</li>
	<li>Effectuer la transcription inverse de l’ARN en ADN complémentaire à l’aide d’un kit disponible dans le commerce. Les conditions de réaction de la transcription inverse étaient les suivantes : 65 °C pendant 5 min, 37 °C pendant 15 min, 85 °C pendant 15 s.</li>
	<li>Effectuer une PCR en temps réel pour détecter des gènes spécifiques à l’ostéogenèse et à l’adipogenèse à l’aide d’amorces énumérées dans le tableau 3. La procédure d’amplification par PCR était la suivante : 95 °C pendant 5 min. 95 °C pendant 5 s, 60 °C pendant 30 s pendant 40 cycles.</li>
</ol>

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</ol>

Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflits d’intérêts.

Ce protocole décrit une méthode pour isoler bmscs des mâchoires de rat in vitro en combinant l’adhérence entière de moelle et le tri de cellules fluorescentes, qui est un moyen simple et fiable d’obtenir mBMSCs prolifératifs avec la capacité forte de différenciation. Cette méthode pourrait purifier à titre préliminaire les mBMSC par tri des cellules d’écoulement, mais s’il y a des exigences plus élevées en matière d’homogénéité cellulaire, des méthodes de purification plus précises peuvent être nécessaires.
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Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMSC) sont des cellules souches non hématopoïétiques dérivées de la moelle osseuse qui manifestent une forte capacité de prolifération et un potentiel de différenciation multi-lignée1,2,3,4. En effet, les BMSC ont été considérés comme un candidat idéal pour l’ingénierie et la régénération des tissus osseux depuis leur découverte. Pendant des années, la crête iliaque ou les longs os tels que le tibia et le fémur ont été la source la plus commune de BMSCs pour la régénération craniofacial. Cependant, les BMSC orofaciales, telles que les BMSCs mandibulaires (mBMSCs), montrent quelques différences par rapport aux BMSCs d’os long, telles que l’origine embryonnaire différente et le modèle de développement. Les mâchoires-nez résultent des cellules neurales de crête de la couche de germe de neuroectoderm et subissent l’ossification intramembranous, alors que les squelettes axiaux et appendiculaires sont du mesoderm et subissent l’ossification endochondral. De plus, les observations cliniques et les études expérimentales sur les animaux ont constamment indiqué qu’il existe des différences fonctionnelles entre les BMSC orofaciales et iliaques5,6,7,8. Les rapports ont prouvé que BMSCs dérivé de l’os craniofacial tel que la mâchoire inférieure, l’os maxillaire, et l’os alvéolaire ont montré la prolifération supérieure, la durée, et la capacité de différentiation que ceux des os axiaux et appendiculaires9. Les mBMSCs sont donc considérés comme les ressources privilégiées pour les futures applications thérapeutiques des maladies craniofaciales telles que le chérubinisme, la tumeur de la mâchoire, l’ostéoporose de l’os de la mâchoire et le défaut du tissu parodontal10,11,12. Pour comprendre le potentiel de traitement dans les expériences précliniques, il est essentiel d’établir une méthode pour isoler et cultiver rapidement les mBMSCs in vitro.
Dans cette étude, le but était d’obtenir des mBMSCs purifiés par l’adhérence entière de moelle et le tri cytométrique de flux. La morphologie anatomique de la mâchoire inférieure de rat, clairement observée par la micro tomographie calculée (Micro-CT) et les sections histologiques, a prouvé que l’os trabecular de la mâchoire inférieure était entre l’espace médullaire d’incisives et l’os alvéolaire. La moelle osseuse de l’os trabéculaire a été rincée pour obtenir des cellules mandibulaires de la moelle osseuse, mais les cellules ainsi cultivées n’étaient pas des mBMSCs purs et étaient susceptibles d’être constituées de multiples types de cellules aux puissances incertaines et aux lignées diverses telles que les cellules des cellules osseuses, adipeuses et endothéliales13,14. La prochaine étape de la purification cellulaire était particulièrement importante. La cytométrie en flux filtre les cellules en reconnaissant une combinaison de protéines cellule-surface et a été largement adoptée dans l’enrichissement des cellules souches mésenchymateuses. L’homogénéité cellulaire est le principal avantage de la cytométrie en flux, mais le processus ne détermine pas la viabilité cellulaire et peut entraîner un rendement cellulaire limité. Dans cette étude, les mBMSCs P0 obtenus à partir de l’adhérence entière de moelle ont été triés par cytométrie de flux pour obtenir des mBMSCs avec la haute pureté et la capacité forte de prolifération.
Cette étude introduit un protocole reproductible et fiable pour l’isolement, la culture, et la différenciation de BMSCs mandibulaire de rat utilisant une combinaison d’adhérence entière de moelle et de tri cytometry d’écoulement. C’est une méthode fiable et pratique à utiliser pour les chercheurs dans des domaines connexes.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA(1X)</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Plat de culture 10cm</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>acutenaculum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milieu de différenciation adipogénique</td><td>Cyagen biosciences inc.</td><td>MUBMX-90031</td><td></td></tr><tr><td>Bleu Alcian</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rouge Alizarine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Kit de développement de couleur phosphatase alcaline</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>alpha-Minimum essentiel</td><td>GE Healthcare HyClone Culture</td><td>cellulaire SH30265.01B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CollagèneII Lapin pAb</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps contre CD16/CD32</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milieu de montage anti-décoloration avec DAPI</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0131</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-souris/rat CD29 Anticorps</td><td>biolegend inc</td><td>102215</td><td></td></tr><tr><td>Enceinte de biosécurité</td><td>Esco</td><td>AC2-4S8-CN</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Anticorps monoclonal (OX1), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0461-82</td><td></td></tr><tr><td>CD90.1 (Thy-1.1) Anticorps monoclonal (HIS51), FITC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>11-0900-85</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>cence</td><td>L500</td><td></td></tr><tr><td>Chondrogenèse différenciation milieu</td><td>cyagen biosciences inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser</td><td>Zeiss</td><td>LSM880</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Compteur de cellules automatisé</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet Staining Solution</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C0121</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>GE Healthcare HyClone Culture</td><td>cellulaire SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre Anti-Lapin IgG H& L (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Esco</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Réactif Magzol(Réactif Trizol)</td><td>Micropipettor Magen</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milieu de différenciation ostéogénique</td><td>Cyagen Biosciences Inc.</td><td>MUBMX-90021</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (1X)</td><td>Gibco</td><td>20012027</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT Master Kit</td><td>TakaRa Bio Inc</td><td>RR036A</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de blocage QuickBlock</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0260</td><td></td></tr><tr><td>ciseaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR1 Premix</td><td>TakaRa Bio Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleu de toluidine</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4</td><td> %Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et culture de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse mandibulaire chez le rat

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Nous présentons ici une méthode efficace pour isoler et cultiver des cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse mandibulaire (mBMSCs) in vitro afin d’obtenir rapidement de nombreuses cellules de haute qualité pour des exigences expérimentales. MBMSCs pourrait être largement utilisé dans des applications thérapeutiques comme cellules d’ingénierie tissulaire en cas de maladies craniofaciales et de régénération cranio-maxillofaciale à l’avenir en raison de l’excellente capacité d’auto-renouvellement et du potentiel de différenciation multi-lignée. Par conséquent, il est important d’obtenir des mBMSCs en grand nombre.
Dans cette étude, la moelle a été rincée de la mâchoire inférieure et mBMSCs primaires ont été isolés par la culture adhérente entière de moelle. De plus, les CD29+CD90+CD45− mBMSCs ont été purifiés par tri des cellules fluorescentes. La deuxième génération de mBMSCs purifiés a été employée pour davantage d’étude et a montré le potentiel en différenciant en osteoblasts, adipocytes, et chondrocytes. En utilisant ce modèle in vitro, on peut obtenir un nombre élevé de mBMSCs prolifératifs, ce qui peut faciliter l’étude des caractéristiques biologiques, la réaction subséquente au microenvironnement, et d’autres applications des mBMSCs.

En utilisant ce protocole, une grande partie des cellules ont adhéré à la plaque le troisième jour après la culture initiale. Typiquement, après 3-4 jours supplémentaires de culture, la confluence cellulaire a atteint 70 à 80% (Figure 1B). Avec le tri des cellules fluorescentes, DAPI-CD29+CD90+CD45− mBMSCs ont été purifiés18,22,ce qui représentait environ 81,1% dans les cellules P0<strong c...

Cet article présente une méthode qui combine l’adhérence entière de moelle et le tri cytometry d’écoulement pour isoler, cultiver, trier, et identifier des cellules souches mésenchymateuses de moelle des mâchoires de rat.

Isolement et culture de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse mandibulaire chez le rat

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...

Des études ont montré que les BMSC dérivées de l’os facial crânien présentent des capacités supérieures à celles des os axiaux et appendiculaires. Par conséquent, les BMSC mandibulaires sont considérées comme la ressource privilégiée pour le développement de futurs traitements des maladies craniofaciales. Ce protocole combine les avantages de l’adhérence de la moelle osseuse entière et du tri cellulaire fluorescent pour obtenir un nombre significatif de BMSC mandibulaires purifiées en peu de temps.Si vous essayez ce protocole pour la première fois, je pense qu’il est très important de comprendre la structure anatomique et le mouvement fonctionnel de la mandibule du rat, ce qui peut être réalisé en regardant cette vidéo ou en lisant la littérature connexe. Après avoir euthanasié le rat, placez-le dans une hotte propre en position couchée. Incisez la peau et les muscles buccinateurs de l’angulus oris bilatéral à la région postérieure de la mandibule.Ouvrez la bouche du rat en poussant les incisives maxillaires et mandibulaires vers la direction opposée avec les deux pouces, pour exposer les dents mandibulaires, qui sont attachées à la mandibule. Déconnecter complètement les muscles buccaux et les tendons attachés aux coracoïdes et le bord inférieur de la mandibule. Appuyez ensuite sur les dents postérieures mandibulaires et faites-les pivoter vers l’arrière et vers le bas jusqu’à ce que les condyles des deux côtés soient clairement exposés.Séparez le corps de la mandibule du crâne et nettoyez les tissus mous adhérents à la surface de l’os à l’aide d’une gaze humide. Placez l’os dans un plat en verre stérile de 10 centimètres rempli de milieu alpha essentiel minimum prérefroidi, ou PBS sur glace, pour préserver la viabilité. Coupez l’os antérieur le long du bord mésial de la première molaire du corps mandibulaire, puis retirez la branche mandibulaire, y compris la coracoïde et le condyle, le long du bord distal de la troisième molaire pour exposer la cavité de la moelle.Remplissez un plat en verre stérile de 10 centimètres avec 10 millilitres d’alpha-MEM avec 10 % FBS. Aspirez le milieu avec une seringue de 10 millilitres, puis insérez l’aiguille dans la cavité de la moelle osseuse et rincez à plusieurs reprises la moelle osseuse dans le plat. Rincer la cavité osseuse au moins trois fois des côtés mésial et distal de l’os respectivement, jusqu’à ce que l’os devienne blanc.Transférez le milieu contenant les cellules rincées dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et centrifugez-le à 800 tr/min et pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et remettez en suspension les cellules avec trois millilitres d’alpha-MEM avec 10 % FBS. Placez les cellules dans une nouvelle boîte de culture de 10 centimètres et incuberez-les à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone.Aspirez le milieu de culture et lavez le plat avec du PBS. Ajoutez deux millilitres de trypsine à 0,25 % avec 0,02 % d’EDTA dans la boîte et digérez les cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite quatre millilitres d’alpha-MEM avec 10 % FBS pour arrêter la réaction.Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et centrifugez-la à 800 tr/min pendant cinq minutes. Remettre les cellules en suspension dans 120 microlitres de PBS avec 10 % FBS après centrifugation. Transférez 100 microlitres de suspension cellulaire dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse.Bloquez les suspensions cellulaires avec un microlitre d’anticorps contre CD16 à CD32 à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes, et colorez les cellules avec un anticorps conjugué PE contre CD45, un anticorps conjugué FITC contre CD90 et un anticorps APC contre CD29, à quatre degrés Celsius pendant une heure dans l’obscurité. Utilisez les 20 microlitres restants de suspension cellulaire comme contrôle négatif non coloré. Centrifugez les tubes à 800 tr/min pendant cinq minutes.Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 0,5 millilitre de PBS avec 10 % FBS. Ajouter 10 microlitres de 0,01 milligramme par millilitre de DAPI 10 minutes avant l’analyse. Utilisez des filtres de 40 nanomètres placés sur des tubes à centrifuger pour filtrer les cellules, puis analysez les cellules sur un trieur de cellules activé par fluorescence.Tout d’abord, éliminez les cellules mortes du nombre total de cellules en bloquant les cellules DAPI négatives, puis les cellules CD29 positives, CD90 positives et CD45 négatives dans les cellules sélectionnées en tant que mBMSC ciblées. Collectez les mBMSC triés dans un tube à centrifuger de 15 millilitres avec cinq millilitres d’alpha-MEM avec 10 % FBS. Centrifugez les tubes à 800 tr/min pendant cinq minutes et retirez le tampon de collecte.Ajoutez un millilitre de milieu frais pour remettre les cellules en suspension, puis placez-les dans une boîte de culture de six centimètres. En utilisant ce protocole, une grande proportion de cellules ont adhéré à la plaque le troisième jour après la culture initiale. Après trois à quatre jours supplémentaires de culture, la confluence cellulaire a atteint 70 à 80 %.Après avoir cultivé des mBMSC P2 dans une plaque à six puits pendant une semaine, une quantité importante d’unités formant des colonies a été observée. Pour évaluer la capacité de différenciation multi-lignées des mBMSC, ils ont été induits en lignées ostéo-chondro-et adipo-liées. L’augmentation de l’activité de l’ALP, des nodules calcifiants rouges sous coloration rouge d’alizarine et l’expression accrue des gènes spécifiques ostéogéniques Runx2, Alp, Bsp et Ocn, ont indiqué l’induction ostéogénique.La coloration rouge-huile O a été utilisée pour identifier l’adipogenèse. De nombreuses vacuoles riches en lipides étaient évidentes après neuf jours d’induction. De plus, l’expression des gènes spécifiques adipogéniques Ppar-gamma-1 et Cebpa a été augmentée.Les échantillons ont montré une coloration positive pour le bleu d’Alcian lors de l’observation microscopique de la différenciation chondrogénique. De plus, l’immunomarquage avec des anticorps anti-collagène de type II a montré une accumulation accrue de la matrice cartilagineuse. Il est très important d’assurer la viabilité des mBMSC dans ce protocole.Cet objectif peut être atteint en choisissant un animal de laboratoire approprié, en opérant sur de la glace et en raccourcissant la durée de l’expérience. En utilisant ce modèle in vitro, on peut obtenir un grand nombre de BMSC mandibulaires prolifératives, ce qui peut faciliter l’étude des caractéristiques biologiques, la réaction ultérieure au microenvironnement et d’autres applications des BMSC mandibulaires.

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