Name: Isolement des noyaux à partir de tumeurs cérébrales fraîchement congelées pour l’ARN-seq à noyau unique et ATAC-seq (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Apprenez à isoler des noyaux à partir de tumeurs cérébrales fraîchement congelées pour les études transcriptomiques et épigénétiques. Cette méthode simple réduit le temps de traitement et préserve la qualité des noyaux.

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Nous remercions le Single Cell Open Lab (scOpenLab) du Centre allemand de cancérologie (DKFZ) pour ses discussions utiles. Cette recherche a été soutenue par le programme allemand d’aide contre le cancer, le programme Max-Eder numéro 70111964 (S.T.).

Des échantillons de gliome frais congelés ont été obtenus à partir de la banque de tissus du Centre national des maladies tumorales (NCT) à Heidelberg, en Allemagne. L’utilisation de matériel patient a été approuvée par le Comité d’examen institutionnel de la Faculté de médecine de Heidelberg, et le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients inclus dans l’étude.
1. Préparation expérimentale
<ol><li>Effectuez toutes les étapes sur de la glace ou à 4 °C.</li>
	<li>Pré-refroidir les tubes, la vaisselle, les lames de rasoir, les douncers et les pilons à 4 °C.</li>
	<li>Préparez tous les tampons à l’avance. Ces tampons sont stables à température ambiante. Une filtration stérile est recommandée, en particulier pour le saccharose. Les préparations de stock sont modifiées à partir de Corces et al.19. Voir tableaux 1 à 7.</li>
	<li>Prélever les échantillons de l’azote liquide ou du congélateur à -80 °C et les conserver sur de la glace carbonique jusqu’à l’étape 2.1.</li>
</ol>2. Dissection et dissociation tissulaires
<ol><li>Transférer l’échantillon de tissu frais congelé (10-60 mg) dans une boîte de Petri pré-réfrigérée. Hacher / hacher les tissus frais congelés avec une lame de rasoir en petits morceaux sur de la glace.</li>
	<li>Ajouter 500 μL de tampon de lyse des noyaux réfrigérés dans un tube pré-réfrigéré de 1,5 mL. Placez les morceaux de tissu dans le tube de 1,5 mL contenant le tampon de lyse des noyaux et transférez-les dans un Douncer(Table des matériaux). REMARQUE: Il existe deux pilons homogénéisateurs Dounce: pilon « lâche » ou « A » pour la réduction initiale de l’échantillon et pilon « serré » ou « B » pour l’homogénéisation complète de l’échantillon.</li>
	<li>Dounce les morceaux de tissu avec le pilon « lâche » pendant environ 20 coups, jusqu’à ce que la friction soit réduite. Si des débris sont présents, l’échantillon peut être pré-nettoyé par filtration avec une passoire de 100 mm.</li>
	<li>Dounce avec le pilon « serré » pendant 20 coups pour obtenir une homogénéisation complète des tissus.</li>
	<li>Transférer l’homogénat (environ 500 μL) dans un tube pré-réfrigéré de 2 mL. Ajouter 1 mL de tampon de lyse réfrigéré. Mélanger doucement et incuber sur de la glace pendant 5 min. Mélanger doucement avec une pointe de pipette à large alésage et répéter 1 à 2 fois pendant l’incubation.</li>
	<li>Filtrer l’ensemble de l’homogénat à l’aide d’un maillage de crépine de 30 μm, recueillir dans un tube Falcon de 15 mL et transférer dans un nouveau tube pré-refroidi de 2 mL. Une seule passoire est généralement suffisante pour l’ensemble de l’homogénat.</li>
	<li>Vérifiez au microscope optique l’élimination des gros débris et l’intégrité de la membrane nucléaire. Les noyaux doivent être ronds et la membrane nucléaire ne doit pas être déformée. Si des débris sont présents, les noyaux peuvent être refiltrés.</li>
	<li>Centrifuger les noyaux à 500 x g pendant 5 min à 4 °C sur une centrifugeuse de paillasse. Retirez le surnageant, en laissant derrière lui ~50 μL avec la pastille contenant les noyaux. Remettez doucement la pastille dans un autre tampon de lyse des noyaux de 1 mL et incubez pendant 5 min sur de la glace.</li>
	<li>Centrifuger les noyaux à 500 x g pendant 5 min à 4°C. Retirer le surnageant sans déranger la pastille, ajouter 500 mL de 1x tampon d’homogénéisation (HB)(Tableau 4)et incuber pendant 5 min sans ressusser. Ensuite, ressuspendez les noyaux dans un autre 1,0 mL de 1x HB.</li>
	<li>Centrifuger les noyaux à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant et remettez doucement les noyaux en 200 μL de 1x HB dans un nouveau tube de 2,0 mL.</li>
</ol>3. Centrifugation par gradient
<ol><li>Ajouter 200 μL de solution d’iodixanol à 50 % (Tableau 5) pour donner une concentration finale de 25 % d’iodixanol. Bien mélanger 10 fois avec une pipette réglée sur 300 mL.</li>
	<li>Ajouter 300 μL de solution d’iodixanol à 29 % (tableau 6) sous le mélange à 25 %. Utilisez une pointe fine P1000 pour éviter le mélange des couches.</li>
	<li>Ajouter 300 μl de solution d’iodixanol à 35 % (tableau 7) sous le mélange à 29 %. Utilisez une pointe fine P1000 pour éviter le mélange des couches. Attention : Cette étape nécessite le retrait progressif de l’embout de la pipette pendant le pipetage pour éviter un déplacement de volume excessif.</li>
	<li>Placez les échantillons dans une centrifugeuse à godet oscillant, faites tourner pendant 20 min à 3 500 x g à 4 °C avec le frein éteint.</li>
	<li>Retirez doucement les échantillons sans secouer et observez sous la lumière. Une bande blanche claire de noyaux purs à 95 % doit être visible entre la deuxième et la troisième couche(Figure 1).</li>
</ol>4. Isolement des noyaux
<ol><li>Aspirer les couches supérieures jusqu’à ce que les noyaux blancs bandent à l’interphase de 29% à 35%.</li>
	<li>Recueillir la bande nucléique dans un volume de 200 mL, transférer dans un tube frais et filtrer avec un filtre de 20 μm (Table des matériaux). REMARQUE: Les noyaux n’ont pas besoin d’être ressuspendés avant la filtration.</li>
	<li>Vérifiez au microscope optique l’élimination des gros débris et l’intégrité de la membrane nucléaire. Les noyaux doivent être ronds et la membrane nucléaire ne doit pas être déformée.</li>
	<li>Compter les noyaux à l’aide de la coloration bleue de Trypan sur un hémocytomètre et les noyaux aliquotes pour snRNA-seq/snATAC-seq.</li>
</ol>5. ARN à noyau unique et ATAC seq
<ol><li>Traiter immédiatement les noyaux à l’aide de l’expression génique unicellulaire et des kits de réactifs ATAC unicellulaires (Table des matériaux). REMARQUE: Les concentrations d’échantillons de noyaux pour le système 10x Genomics sont de 1500-3000 noyaux par μL pour snRNA-seq, et de 3500-7000 noyaux par m μL pour snATAC-seq. Les noyaux peuvent être dilués à l’aide de 1x PBS.</li>
	<li>Séquencer les bibliothèques résultantes à l’installation centrale de génomique.</li>
	<li>Effectuer une analyse de contrôle de la qualité des données. Les noyaux sont inclus pour une analyse plus approfondie s’ils contiennent un identificateur moléculaire unique (UMI) >1000, le nombre de gènes >500 et le pourcentage de gènes mitochondriaux <5%, et sont dans la moyenne + trois écarts-types des UMI et des gènes.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le domaine de l’hétérogénéité intra-tumorale est à un stade passionnant, avec de nouveaux tests et plates-formes en cours de développement pour remettre en question et élargir les connaissances existantes. L’hétérogénéité intratumorale est un facteur crucial qui contribue à la progression de la maladie et à la résistance aux modalités de traitement actuelles dans les gliomes28. Des études récentes sur les tumeurs cérébrales se sont concentrées sur cet aspect important en utilisant des tests transc...

Les gliomes diffus de bas grade (LGG), la tumeur cérébrale primaire la plus courante chez l’adulte, sont des néoplasmes infiltrants qui surviennent souvent dans l’hémisphère cérébral. Les LG présentent à la fois une hétérogénéité inter- et intra-tumorale, qui n’est pas seulement entraînée par la population tumorale, mais aussi par les cellules non malignes impliquées de manière complexe dans le développement et la progression de la tumeur1,2,3,4,5.
Au cours de la dernière décennie, il y a eu une avalanche de données génomiques recueillies dans le domaine des gliomes. Ces données proviennent principalement d’études de séquençage de tumeurs en vrac et ont énormément contribué à la caractérisation moléculaire et à la classification actuelle des tumeurs cérébrales5,6,7,8,9,10,11. Cependant, même si ces études ont révélé le vaste paysage moléculaire associé aux gliomes, il y a encore un manque décevant de progrès en matière d’intervention thérapeutique. L’un des obstacles à la résistance au traitement dans les tumeurs cérébrales est l’hétérogénéité intra-tumorale. Pour résoudre ce problème, diverses études se sont concentrées sur l’hétérogénéité génomique, transcriptomique, protéomique et épigénétique présente dans une tumeur au niveau d’une seule cellule12,13,14,15,16,17.
Bien qu’il y ait eu des progrès technologiques remarquables dans le domaine des cellules uniques au cours des deux dernières années, l’un des principaux facteurs limitants est la disponibilité de nouveaux spécimens nécessaires pour isoler les cellules et effectuer ces expériences. Pour surmonter cette limitation, il y a eu plusieurs tentatives réussies d’effectuer des tests, tels que snRNA-seq et snATAC-seq à partir de tissus congelés, en utilisant des noyaux plutôt que des cellules18,19. La majorité de ces méthodes reposent sur le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ou sur des stratégies de filtration. Les approches à cellule unique et à noyau unique ont leurs forces et leurs inconvénients. Les approches unicellulaires maintiennent les transcriptions mitochondriales, qui, bien qu’elles puissent être informatives, peuvent également réduire la couverture du transcriptome en raison de leur grande abondance. Les approches d’isolement des noyaux simples éliminent un pourcentage élevé de la fraction mitochondriale, permettant ainsi une couverture plus approfondie des transcriptions nucléaires20.
Il existe diverses plates-formes disponibles dans le commerce qui ont été utilisées au cours des dernières années pour analyser les données génomiques unicellulaires, y compris RNA-seq et ATAC-seq. L’une des plates-formes les plus importantes est la plate-forme 10x Genomics Chromium pour l’expression de gènes unicellulaires et le profilage ATAC unicellulaire. Comme la plate-forme fonctionne à l’aide de chambres microfluidiques, tout débris ou agrégats peut obstruer le système, entraînant une perte de données, de réactifs et d’échantillons cliniques précieux. Par conséquent, le succès des études sur une seule cellule dépend en grande partie de l’isolement précis des cellules / noyaux individuels.
Le protocole que nous allons démontrer ici est une combinaison légèrement modifiée des protocoles DroNc-seq et Omni-ATAC-seq, et utilise une approche similaire aux études récentes qui utilisent snRNA-seq pour comprendre les troubles neurologiques et les types de cellules neuronales dans le cerveau humain18,19,21,22,23,24. Le protocole utilise une combinaison de dissociation enzymatique/mécanique des échantillons congelés suivie d’une filtration et d’une centrifugation par gradient et permet une isolation rapide et précise des noyaux simples des tissus de gliome frais congelés. Nous avons utilisé avec succès ce protocole pour générer des données snRNA-seq et snATAC-seq à partir de la même préparation de noyaux à partir d’échantillons de tumeurs cérébrales.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>21115-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Homogénéisateur</td><td>Motif actif</td><td>40401</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R1021</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Tubes à centrifuger coniques</td><td>Fisher Scientific</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Iodixanol (aka Optiprep)</td><td>Stem cell technologies</td><td>07820</td><td></td></tr><tr><td>MACs Smart Strainers (30 &micro ; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (100 &micro ; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>Mg(Ac)2</td><td>Sigma</td><td>63052-100ML</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Abcam</td><td>ab142227</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’isolation des noyaux : Nuclei EZ Prep</td><td>Sigma</td><td>NUC101-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Filtres de pré-séparation (20 &micro ; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-812</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de sécurité 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de sécurité 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Single Cell ATAC</td><td>10x Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Cell Gene Expression</td><td>10x Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette à alésage large (1000 & micro ; L)</td><td>Themo Fisher Scientific</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette à large calibre (200 &micro ; L)</td><td>Themo Fisher Scientific</td><td>2069GPK</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des noyaux à partir de tumeurs cérébrales fraîchement congelées pour l’arn-seq à noyau unique et atac-seq

Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq

Les gliomes diffus adultes présentent une hétérogénéité inter- et intra-tumorale. Jusqu’à récemment, la majorité des efforts de profilage moléculaire à grande échelle se concentraient sur des approches en vrac qui ont conduit à la classification moléculaire des tumeurs cérébrales. Au cours des cinq dernières années, les approches de séquençage unicellulaire ont mis en évidence plusieurs caractéristiques importantes des gliomes. La majorité de ces études ont utilisé des échantillons de tumeurs cérébrales fraîches pour isoler des cellules individuelles en utilisant la cytométrie en flux ou des méthodes de séparation à base d’anticorps. À l’avenir, l’utilisation d’échantillons de tissus fraîchement congelés provenant de biobanques offrira une plus grande flexibilité aux applications unicellulaires. De plus, à mesure que le champ unicellulaire progresse, le prochain défi consistera à générer des données multi-omiques à partir d’une seule cellule ou de la même préparation d’échantillon pour mieux démêler la complexité tumorale. Par conséquent, des protocoles simples et flexibles qui permettent la génération de données pour diverses méthodes telles que le séquençage de l’ARN à noyau unique (snRNA-seq) et le test à noyau unique pour la chromatine accessible par transposase avec séquençage à haut débit (snATAC-seq) seront importants pour le domaine.
Les progrès récents dans le domaine des cellules uniques, associés à des instruments microfluidiques accessibles tels que la plate-forme génomique 10x, ont facilité les applications unicellulaires dans les laboratoires de recherche. Pour étudier l’hétérogénéité des tumeurs cérébrales, nous avons développé un protocole amélioré pour l’isolement des noyaux simples des gliomes fraîchement congelés. Ce protocole fusionne les protocoles existants à cellule unique et combine une étape d’homogénéisation suivie d’une filtration et d’une centrifugation de gradient médiée par tampon. Les échantillons résultants sont des suspensions pures à noyau unique qui peuvent être utilisées pour générer des données sur l’expression génique d’un seul noyau et l’accessibilité de la chromatine à partir de la même préparation de noyaux.

La génomique à noyau unique est un domaine en évolution avec des données et des protocoles limités. Un facteur critique qui influence le résultat des tests à noyau unique est l’isolement des noyaux purs et intacts. Nous avons combiné deux protocoles publiés (protocoles DroNc-seq et Omni-ATAC-seq) pour isoler des noyaux purs et de haute qualité à partir de blocs de tissus de gliome frais congelés dans un temps relativement court, maintenant ainsi la stabilité des transcriptions(Figure 1)....

L’hétérogénéité intratumorale est une caractéristique inhérente aux tumeurs, y compris les gliomes. Nous avons développé un protocole simple et efficace qui utilise une combinaison de tampons et de centrifugation par gradient pour isoler des noyaux uniques à partir de tissus de gliome frais congelés pour des études de séquençage de l’ARN à noyau unique et de l’ATAC.

Isolement des noyaux à partir de tumeurs cérébrales fraîchement congelées pour l’ARN-seq à noyau unique et ATAC-seq

Adult diffuse gliomas exhibit inter- and intra-tumor heterogeneity. Until recently, the majority of large-scale molecular profiling efforts have focused ...

L’objectif de notre méthode est d’isoler des noyaux de tumeurs fraîchement congelées et la même préparation de noyaux peut être utilisée pour des études transcriptionnelles et épigénétiques. Par conséquent, nous pouvons poser plusieurs questions clés telles que : comment les tumeurs évoluent-elles au cours de la progression et comment les thérapies affectent-elles la composition tumorale ? Le plus grand avantage de cette méthode est qu’elle est simple, qu’elle réduit le temps de traitement et, surtout, qu’elle permet d’obtenir des noyaux de haute qualité.L’absence d’étape de tri réduit le stress sur les noyaux. Et l’autre avantage est sa capacité à être utilisé sur des tumeurs congelées d’archives. Ashwin Narayanan, un boursier postdoctoral de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Commencez par transférer 10 à 60 milligrammes d’échantillon de tissu frais congelé dans une boîte de Pétri pré-réfrigérée. Émincez ou hachez le tissu frais congelé avec une lame de rasoir en petits morceaux sur de la glace. Ajoutez 500 microlitres de tampon de lyse des noyaux réfrigéré sur le tissu dans la boîte de Pétri.Transférez ensuite le mélange dans un annonceur. Étalez les morceaux de tissu avec le pilon lâche pendant environ 20 coups jusqu’à ce que la friction soit réduite. Ensuite, plongez-le avec le pilon serré pendant 20 coups pour obtenir une homogénéisation complète des tissus.Transférez l’homogénat dans un tube de deux millilitres pré-refroidi et ajoutez un millilitre de tampon de lyse réfrigéré dans le détonateur, rincez-le et ajoutez-le dans le tube. Mélangez-le doucement et incubez-le sur de la glace pendant cinq minutes, en mélangeant avec une pointe de pipette de gros calibre une à deux fois pendant l’incubation. Filtrez l’ensemble de l’homogénat à l’aide d’une maille de crépine de 30 microlitres et collectez-le dans un tube Falcon de 15 millilitres.Ensuite, transférez-le dans un nouveau tube de deux millilitres pré-refroidi. Une seule passoire suffit généralement pour l’ensemble de l’homogénat. Examinez l’échantillon au microscope optique pour vérifier l’élimination des gros débris et l’intégrité de la membrane nucléaire.Il n’est pas nécessaire que les noyaux soient ronds et que la membrane nucléaire ne soit pas déformée. S’il y a des débris, répétez la filtration. Ensuite, centrifugez les noyaux sur une centrifugeuse de paillasse pendant cinq minutes.Retirez le surnageant, en laissant derrière vous environ 50 microlitres de pastille contenant des noyaux. Remettez doucement la pastille en suspension dans un autre millilitre de tampon de lyse des noyaux et incubez-la pendant cinq minutes sur de la glace. Répétez la centrifugation, puis retirez le surnageant sans perturber la pastille.Ajoutez 500 millilitres de HB et incubez l’échantillon pendant cinq minutes sans le remettre en suspension. Ensuite, remettez les noyaux en suspension dans un autre millilitre de HB. Centrifugez encore cinq minutes, puis retirez le surnageant. Remettez les noyaux en suspension dans 200 microlitres de HB et transférez la suspension dans un nouveau tube de deux millilitres.Ajouter 200 microlitres de solution d’iodixanol à 50 % dans les noyaux pour une concentration finale de 25 % d’iodixanol et mélanger 10 fois avec la pipette réglée à 300 microlitres. Ajoutez ensuite 300 microlitres de solution d’iodixanol à 29 % sous le mélange à 25 % à l’aide d’une pointe fine P1000 pour éviter de mélanger les couches. Ajoutez 300 microlitres de solution d’iodixanol à 35 % sous le mélange à 29 % avec une pointe fine P1000, puis retirez-le lentement.Placez les échantillons dans une centrifugeuse à godets oscillants et faites-les tourner pendant 20 minutes à 3 500 G à quatre degrés Celsius avec la pause. Retirez délicatement les échantillons sans les secouer et observez-les à la lumière. Une bande blanche claire de noyaux purs à 95 % doit être visible entre la deuxième et la troisième couche.Pour isoler les noyaux, aspirez les couches supérieures pour exposer la bande blanche des noyaux à l’interface. Recueillez la bande de noyaux dans un volume de 200 millilitres et transférez-la dans un tube frais. Filtrez-le ensuite avec un filtre de 20 micromètres.Vérifier les noyaux au microscope optique pour vérifier l’élimination des gros débris et l’intégrité de la membrane nucléaire. Ils doivent être ronds et la membrane nucléaire ne doit pas être déformée. Comptez les noyaux à l’aide de la coloration au bleu trypan sur un hémocytomètre et aliquotez-les pour le snRNA-seq ou le snATAC-seq.Diverses étapes de filtration, ainsi que la centrifugation à gradient, permettent d’isoler les noyaux purs, la majorité des débris étant jetés. La même préparation de noyaux isolés peut être utilisée à la fois pour le RNA-seq à noyau unique et l’ATAC-seq à noyau unique. Étant donné que les noyaux isolés proviennent du même échantillon, les données générées peuvent être co-intégrées à l’aide de packages R tels que le Seurat pour générer des clusters et fournir une perspective multiomique.Pour déterminer si le protocole est comparable aux ensembles de données publiés, les données obtenues ont été comparées à quatre études de séquençage de l’ARN à noyau unique accessibles au public et liées au système nerveux central. Tous les ensembles de données ont été fusionnés et la distribution du nombre d’UMI et de gènes a été visualisée à l’aide d’un graphique à violon. Le résultat a indiqué que la méthode est comparable au dernier protocole snRNA-seq.Lors de la tentative de ce protocole, il est important d’être très prudent et de ne pas mélanger les couches, lors de la centrifugation par gradient et de l’isolation des noyaux.

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Recherche

JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

Cette vidéo décrit le protocole permettant d’isoler des noyaux uniques à partir de tissus de gliome fraîchement congelés. Les noyaux uniques isolés peuvent être utilisés comme échantillons pour des techniques de séquençage telles que le séquençage de l’ARN à noyaux uniques (snRNA) et le dosage des noyaux uniques pour le séquençage de la chromatine accessible à la transposase (snATAC) afin d’obtenir des informations plus approfondies sur l’hétérogénéité inter- et intra-tumorale observée dans le...

Isolement de noyaux à partir de tissus de gliome frais congelés : une méthode pour obtenir des noyaux intacts à partir d’échantillons de tumeurs de gliome

Nous présentons ici un protocole afin d’isoler rapidement les noyaux de la haute qualité des tissus frais ou congelés pour aval séquençage massivement parallèle de RNA. Nous incluons détergent-mécanique et hypotonique-mécanique des tissus désorganisation cellulaire lyse options et, qui peuvent être utilisés pour l’isolement des noyaux.

Isolement des noyaux d’adultes de la moelle épinière pour séquençage massivement parallèle ARN simple-noyau

L’isolement des noyaux uniques repose sur la dissociation et la perméabilisation à base de détergent de la membrane cellulaire, étapes qui nécessitent une optimisation et sont sujettes à l’introduction d’artefacts techniques. Nous démontrons un protocole sans détergent et sans enzymes pour l’isolement rapide des noyaux intacts directement à partir de tissus entiers, donnant des noyaux appropriés pour l’ARN-seq mono-noyau (snRNA-Seq) ou ATAC-seq.

Isolation des noyaux par tissu entier à l’aide d’une méthode sans détergent et sans enzymes

Nous avons développé une méthode qui enrichit et isole les populations d’astrocytes humains à partir de tissus fraîchement congelés pour une utilisation dans les analyses moléculaires en aval.

Isolement de populations d’astrocytes humains adultes à partir de cortex fraîchement congelés à l’aide du tri des noyaux activés par fluorescence

Ici, nous présentons un protocole pour isoler des noyaux de haute qualité à partir de reins de souris congelés qui améliorent la représentation des types de cellules rénales médullaires et évitent les artefacts d’expression génique de la dissociation des tissus enzymatiques.

Isolement de noyaux à partir de reins de souris adultes pour le séquençage de l’ARN mononucléaire

Ici, nous présentons un protocole pour isoler les noyaux des tissus hépatiques archivés surgelés pour le séquençage de l’ARN mononoyau, le séquençage ATAC et la multiomique articulaire (RNA-seq et ATAC-seq).

Isolement de noyaux de tissu hépatique surgelé pour la multiomique unicellulaire

Nous présentons ici un protocole décrivant la préparation des noyaux cellulaires. Après la microdissection et la dissociation enzymatique du tissu cardiaque en cellules individuelles, les cellules progénitrices ont été congelées, suivies de l’isolement de cellules viables pures, qui ont été utilisées pour le séquençage de l’ARN mononucléaire et le test mononucléique pour la chromatine accessible à la transposase avec des analyses de séquençage à haut débit.

Isolement de noyaux à partir de cellules progénitrices cardiaques de souris pour le profilage de l’épigénome et de l’expression génique à une résolution unicellulaire

L’étude décrit un protocole simple, rapide et partiellement automatisé pour isoler des noyaux de haute qualité à partir de tissus de mammifères congelés pour le séquençage de l’ARN de noyaux uniques en aval.

Un protocole simple, rapide et partiellement automatisé pour l’isolement de noyaux uniques à partir de tissus de mammifères congelés pour le séquençage d’un seul noyau

Le succès de la transcriptomique unicellulaire/mononoyau et de la multi-omique dépend en grande partie de la qualité des cellules/noyaux. Par conséquent, l’isolement des cellules/noyaux des tissus et leur purification doivent être hautement standardisés. Ce protocole décrit la préparation des noyaux du cerveau et de la moelle osseuse pour l’essai multiome à noyau unique en aval.

Préparation de noyaux de cerveau et de moelle osseuse de haute qualité pour les dosages multiomes à noyau unique

Le protocole fournit une approche fiable et optimisée de l’isolement des noyaux à partir d’échantillons de tumeurs solides pour le séquençage multiome à l’aide de la plate-forme 10x Genomics, y compris des recommandations pour les conditions de dissociation des tissus, la cryoconservation des suspensions unicellulaires et l’évaluation des noyaux isolés.

Optimisation de l’isolement des noyaux à partir d’échantillons de tumeurs solides fraîches et congelées pour le séquençage multiome

Ici, nous présentons un protocole complet pour la génération et l’analyse en aval d’organoïdes cérébraux humains à l’aide du séquençage de l’ARN unicellulaire et mononucléique.

Génération et analyse en aval de transcriptomes unicellulaires et mononucléiaux dans des organoïdes cérébraux

Apprenez à isoler des noyaux à partir de tumeurs cérébrales fraîchement congelées pour les études transcriptomiques et épigénétiques. Cette méthode simple réduit le temps de traitement et préserve la qualité des noyaux.

Isolement des noyaux à partir de tumeurs cérébrales fraîchement congelées pour l’ARN-seq à noyau unique et ATAC-seq

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