Génération organoïde tridimensionnelle de nerf moteur

Ce protocole facilite l’étude des mécanismes sous-jacents au développement et à la maladie des faisceaux axonaux à l’aide d’organoïdes nerveux moteurs dérivés des cellules iPS humaines à l’extérieur du corps. En cultivant simplement des sphéroïdes neuronaux et des puces de microculture sur mesure, des faisceaux axonaux unidirectionnels peuvent être générés spontanément et utilisés pour diverses expériences en aval. L’organoïde du nerf moteur peut faciliter le dépistage et l’essai des médicaments pour les maladies du motoneurone, y compris le LS, en fournissant un modèle plus physiologique que les systèmes in vitro précédents.

Dans une hotte, et en portant l’EPI approprié, versez trois millilitres de SU-8 2100 sur une plaquette de silicium nettoyée à l’acétone et placez la plaquette au centre d’une machine de revêtement. Fixez la plaquette sous vide et faites-la tourner à 500 tours par minute pendant 10 secondes pour enduire uniformément le SU-8 sur toute la surface de la plaquette, puis faites tourner la plaquette à 1 500 tours par minute pendant 30 secondes avec une accélération de 300 tours par seconde pour obtenir une couche de résine photosensible de 150 microns d’épaisseur sur la plaquette. Après la cuisson douce, réglez le photomasque sur l’aligneur du masque et exposez la plaquette à la lumière ultraviolette pendant 60 secondes.

Après la cuisson sur une plaque chauffante, développer la plaquette pendant 10 à 20 minutes dans un révélateur photosensible avec agitation sur un agitateur orbital, en changeant la solution de développement une fois au cours du processus. Pour préparer la couche inférieure de la puce pour la culture tissulaire, versez le PDMS fraîchement préparé sur la plaquette à l’épaisseur souhaitée et dégazez le mélange dans une chambre à vide. Faites durcir le PDMS dans un four pendant au moins trois heures à 60 degrés Celsius.

Après refroidissement, utilisez une lame pour couper le PDMS durci de la plaquette, puis utilisez du PDMS non durci avec cuisson pour lier un réservoir moyen à la couche inférieure du PDMS afin d’obtenir la puce de culture tissulaire PDMS assemblée. Pour préparer la puce PDMS à la formation d’organoïdes nerveux moteurs, stérilisez la puce et un verre de microscope de 76 x 52 millimètres dans une boîte de Pétri contenant 70 % d’éthanol pendant au moins une heure. À la fin de l’incubation, placez la puce sur la vitre humide du microscope

Après une nuit de séchage, la puce doit adhérer au verre. Placez une gouttelette de 30 microlitres de matrice de membrane basale diluée dans du DMEM/F12 d’un côté de l’entrée du canal et aspirez la solution de l’autre côté de l’entrée pour recouvrir la surface du microcanal avec la matrice. Ensuite, incubez la puce PDMS avec la solution de revêtement dans une boîte de Pétri pendant une heure à température ambiante.

Pour induire la différenciation des cellules iPS 3D en motoneurones, ensemencez quatre fois 10 à quatre cellules iPS par puits dans le nombre approprié de puits d’une plaque à fond en U de 96 puits dans 100 microlitres de milieu de culture cellulaire nourricier et sans sérum complété par 10 micromolaires Y-27632. Le lendemain, remplacez le surnageant dans chaque puits par 100 microlitres de milieu KSR complété par 10 SB431542 micromolaires et 100 nanomolaires de LDN-193189. Les deuxième et troisième jours, remplacez les surnageants par 100 microlitres de milieu KSR complété par 10 SB431542 micromolaires, 100 nanomolaires LDN-193189, cinq micromolaires DAPT, cinq micromolaires SU5402, un acide rétinoïque micromolaire et un agoniste micromolaire lissé.

Les quatrième et cinquième jours, remplacez les surnageants par un mélange de 75 % de milieu KSR et de 25 % de milieu N2 complété par 10 SB431542 micromolaires, 100 LDN193189 nanomolaires, cinq micromolaires DAPT, cinq micromolaires SU5402, un acide rétinoïque micromolaire et un agoniste lissé micromolaire. Les sixième et septième jours, remplacer les surnageants par un mélange de 50 % de milieu KSR et de 50 % de milieu N2 complété par cinq micromolaires DAPT, cinq micromolaires SU5402, un acide rétinoïque micromolaire et un agoniste micromolaire lissé. Les huitième et neuvième jours, remplacer les surnageants par un mélange de 25 % de milieu KSR et de 75 % de milieu N2 complété par cinq micromolaires DAPT, cinq micromolaires SU5402, une micromolaire d’acide rétinoïque et un agoniste micromolaire lissé.

Les jours 10 et 11, remplacer les surnageants par un milieu N2 complété par cinq DAPT micromolaires, cinq micromolaires SU5402, un acide rétinoïque micromolaire et un agoniste lissé micromolaire. Le 12e jour, remplacez les surnageants dans chaque puits par 100 microlitres de milieu de maturation complété par 20 nanogrammes par millilitre de facteur neurotrophique dérivé du cerveau par puits. Pour induire la formation d’organoïdes du nerf moteur, remplacez la solution d’enrobage dans la puce PDMS par 150 microlitres de milieu de maturation complété par 20 nanogrammes par millilitre de facteur neurotrophique dérivé du cerveau et utilisez une pointe de micropipette à large alésage pour ajouter doucement des sphéroïdes de motoneurones d’un puits de la plaque de 96 puits dans l’entrée du microcanal de la puce.

Placez un petit réservoir d’eau stérile près de la puce de culture tissulaire dans la boîte pour éviter l’évaporation du milieu et placez la boîte dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Tous les deux à trois jours, remplacez la moitié du milieu de culture épuisé du centre du réservoir de milieu par un milieu de maturation frais complété par 20 nanogrammes par millilitre de facteur neurotrophique dérivé du cerveau. Les axones se développeront à partir du sphéroïde du motoneurone dans le canal, s’assemblant spontanément en un seul faisceau sur une période de deux à trois semaines pour former un organoïde de nerf moteur.

Les motoneurones se différencient en 12 à 14 jours dans des procédures de différenciation 3D. Il est important de noter que plus de 60 % des cellules expriment le marqueur du motoneurone HB9 au cours de la différenciation et qu’environ 80 % des cellules du sphéroïde du motoneurone sont SMI32 positives. Avec le microcanal servant de guides physiques, les axones s’allongent à partir du sphéroïde du motoneurone pour former un faisceau par interaction axo-axonale dans les 24 heures suivant l’introduction du sphéroïde.

Les axones ont atteint le centre du microcanal dans les trois à quatre jours suivants, s’étendant à l’autre extrémité du microcanal après 10 jours supplémentaires. Les organoïdes des nerfs moteurs peuvent être prélevés sur la puce pour une analyse biologique en détachant le PDMS de la vitre du microscope. Les faisceaux axonaux et les corps cellulaires peuvent ensuite être disséqués et isolés au microscope à l’aide d’un couteau chirurgical ou d’une pince à épiler.

Dans les faisceaux axonaux des organoïdes des nerfs moteurs, les protéines marqueurs dendritiques ne sont pas détectées par Western blot. Il est important de s’assurer que les sphéroïdes sont complètement déposés au fond de la puce de culture. Nous avons montré que l’examen des sites et du fond peut aider à déterminer l’emplacement du sphéroïde dans la puce.

Les faisceaux axonaux isolés peuvent être examinés pour diverses méthodes supplémentaires. Une grande quantité d’axones peut être obtenue et utilisée pour des tests biochimiques nécessitant des matériaux substantiels.