Différenciation des monocytes en macrophages phénotypiquement distincts après traitement par des exosomes dérivés de cellules souches de sang de cordon humain (CB-SC)-Dérivés

La thérapie d’éducateur de cellules souches a été développée pour traiter le diabète de type I et l’autre maladie auto-immune. Cette méthode a été développée pour explorer le mécanisme de molécule sous-jacent à la modération immunitaire de la thérapie d’éducateur de cellules souches par des exosomes libérés de CB-SC. Ce protocole fournit des conseils sur la façon de purifier les exosomes à partir d’une culture de cellules souches du sang de cordon humain et de déterminer leur modulation immunitaire des monocytes.

Wei Hu, doctorant, de mon labo, démontrera la procédure. Pour commencer, centrifugez le milieu conditionné dérivé du CB-SC trois fois tel que décrit dans le manuscrit du texte, recueillant le supernatant dans un nouveau tube conique de 50 millilitres après chaque centrifugation. Après la troisième centrifugation, filtrer le supernatant obtenu à l’aide d’un filtre de 0,22 microlitre et transférer 15 millilitres de médias à chaque unité de filtre centrifuge de 10 kilodaltons.

Centrifugeuses à 4000 x g pendant 30 minutes pour isoler les médias exosome concentrés. Transférer les exosomes concentrés dans un tube d’ultracentrifugeuse. Puis pelleter les exosomes à 100 000 x g pendant 80 minutes à quatre degrés Celsius.

Puis jetez le supernatant et resuspendez les exosomes granulés dans 10 millilitres de PBS. Effectuez une ultracentrifugation finale pour collecter la pastille d’exome et la résuspendre dans 200 microlitres de PBS. Ajouter 30 millions de PBMCs humains à un tube de 15 millilitres et une centrifugeuse à 300 x g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Resuspendez les cellules en 300 microlitres de PBS froid et ajoutez 60 microlitres de microlitres de microbilles CD14. Bien mélanger et incuber les cellules sur la glace pendant 15 minutes. Ajouter six millilitres de PBS froid et centrifugeuse à 300 x g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Puis résuspendez les cellules granulées dans 500 microlitres de tampon de fonctionnement à froid. Placez la colonne de séparation dans le séparateur d’aimant et lavez-la trois fois avec deux millilitres de tampon de fonctionnement à froid. Transférez les cellules résuspendées dans la colonne de séparation et laissez-les passer.

Encore une fois, lavez la colonne trois fois avec deux millilitres de tampon en cours d’exécution par lavage. Soulevez ensuite la colonne du séparateur d’aimant et placez-la sur un tube de centrifugeuse de 15 millilitres sur la glace. Elute les cellules positives CD14 avec deux millilitres de tampon de fonctionnement à froid et centrifugés à 300 x g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour pelleter les cellules.

Resuspendez la pastille en deux millilitres de sérum chimique froid défini moyen et transférer 50 microlitres de celui-ci dans un tube de 1,5 millilitre. Tacher les cellules obtenues avec 10 microlitres d’anticorps monoclonaux CD14 anti-humains conjugués à l’orange pendant 20 minutes. Ajouter un millilitre de PBS et centrifugeuse à 300 x g pendant 10 minutes pour pelleter les cellules.

Resuspendez la pastille cellulaire dans 200 microlitres de PBS et transférez-la dans un tube de cinq millilitres. Déterminer la pureté des monocytes CD14+par cytométrie d’écoulement. Graines un million des monocytes purifiés obtenus dans une culture tissulaire traité plaque de six puits et incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone.

Après l’incubation jeter le supernatant et ajouter doucement deux millilitres de 37 degrés de produit chimique préchauffé défini milieu de culture sans sérum, puis ajouter 80 microgrammes des exosomes CB-SC dérivés à la culture monocyte dans la plaque de six puits avec un volume total de deux millilitres. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone pendant trois à quatre jours. Puis l’image de la morphologie cellulaire à l’aide d’un microscope inversé à 200X grossissement.

Ajouter un millilitre de tampon de dissociation cellulaire à base de PBS pour détacher les cellules en pipetting de haut en bas et de récolter les cellules restantes avec un grattoir cellulaire. Recueillir les cellules en centrifugant à 1690 x g pendant cinq minutes et les résuspendre dans 200 microlitres de PBS. Ajouter cinq microlitres de bloqueur FC pour bloquer la liaison non spécifique, puis ajouter les anticorps.

Incuber les cellules à température ambiante pendant 30 minutes. Ajouter un millilitre de PBS aux cellules incubées et les centrifuger à 300 x g pendant 10 minutes. Resuspendez la pastille dans 200 microlitres de PBS et ajoutez cinq microlitres d’iodure de propidium par échantillon.

Transférez les cellules dans un nouveau tube d’écoulement de cinq millilitres et effectuez la cytométrie d’écoulement pour évaluer les niveaux d’expression CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 et CD209. Le phénotype et la pureté des CB-SCs ont été examinés par cytométrie de flux avec des marqueurs associés à CB-SC. L’analyse a montré des niveaux élevés d’expression CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 et galectin 9, mais aucune expression de CD34 n’a été observée.

L’analyse de cytométrie de flux confirme également l’expression des marqueurs spécifiques d’exome, CD9, CD 81, et CD63 sur des exosomes CB-SC-dérivés. La morphologie de taille des exosomes a été caractérisée par TEM et la distribution de taille a été déterminée par DLS. La tache occidentale prouve encore l’expression du marqueur associé d’exome Alix sans expression du marqueur associé d’ER, calnexin.

L’interaction directe du CB-SC-Exo étiqueté Dio avec PBMC a été observée à l’aide de microscopie de fluorescence. Afin de mieux définir la population cellulaire qui interagissait avec le cadran étiqueté CB-SC-Exo, différents compartiments cellulaires ont été fermés avec des marqueurs spécifiques aux cellules, tels que le CD3 pour les lymphocytes T, le CD11C pour les cellules dendritiques myéloïdes, le CD14 pour les monocytes, le CD19 pour les cellules B et le CD56 pour les cellules NK. Les monocytes ont été principalement visés par les exosomes CB-SC-dérivés car ils ont exhibé des intensités médianes plus élevées de fluorescence que ceux d’autres cellules immunisées.

Les monocytes traités exosome se sont différenciés avec succès en morphologies spindle-like. Il y avait une augmentation du niveau des marqueurs associés à M2, tels que CD163, CD206, et CD209 après le traitement avec des exosomes CB-SC-dérivés. La comparaison phénotypique entre les macrophages M2 conventionnels et les macrophages M2 induits par l’exome CB-SC n’a montré aucune différence significative.

L’étape clé de ce protocole est l’ajout d’exosomes dérivés du CB-SC au monocyte de culture dans une plaque de six puits et l’incuber pendant trois à quatre jours, ce qui a eu besoin de la différenciation de la cellule à d’autres macrophages de type 2 avec morphologie spindle-like. Ensuite, nous allons explorer les composants des molécules à l’intérieur des exosomes dérivés du CB-SC qui ont contribué à l’induction de la différenciation des monocytes en macrophages de type 2.