Caractérisation cytométrique en flux du développement des lymphocytes B murins

Les données générées à l’aide de cette technique permettent de mieux comprendre les modèles murins sujets auto-immuns, ainsi que les souris humanisées, qui peuvent être utilisés pour des thérapies générales à base d’anticorps ou d’anticorps. La disponibilité de réactifs avec une gamme toujours croissante de fluorophores permet l’analyse simultanée de plusieurs paramètres sur des cellules individuelles et permet l’évaluation de l’hétérogénéité des cellules B. Ce protocole a été développé dans le but de phénotyper des souris génétiquement modifiées.

déterminer si la manipulation génétique modifierait le développement des lymphocytes B. Bonjour, je m’appelle Faith Harris. Je vais faire une démonstration de la procédure aujourd’hui.

Commencez par aliquoter un million de chaque type de cellule de chaque animal dans une plaque de fond en U de 96 puits. Assurez-vous que suffisamment de puits sont disponibles pour tous les échantillons et témoins, y compris les échantillons de coloration complète, les échantillons de fluorescence moins un et les échantillons non colorés pour chaque fluorophore. Pour le panneau de maturation de la moelle osseuse et le panneau de maturation de la rate, les cellules aliquotes en deux puits, 1 million de cellules par puits pour chaque échantillon complet de coloration.

Pour les contrôles de viabilité de la compensation de couleur unique, ajoutez deux millions de cellules de chaque type de cellule à des puits individuels. Centrifuger la plaque à 845 x g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Décantez le surnageant en inversant et en faisant glisser rapidement la plaque sur un évier, en prenant soin de ne pas contaminer les puits.

Lavez les cellules deux fois dans 200 microlitres de DPBS. Centrifuger et décanter le surnageant après chaque lavage. Remettre les cellules en suspension dans 100 microlitres de colorant de viabilité dilué dans du DPBS au rapport de un à 1000, en évitant les cellules utilisées pour la compensation d’une seule couleur.

Pour chaque ensemble de taches, laissez plusieurs puits non colorés pour un échantillon complètement non coloré et d’autres contrôles dont vous pourriez avoir besoin, ainsi qu’un puits supplémentaire non coloré pour le contrôle FMO de viabilité. Ajoutez PBS à ces puits. Remettre en suspension les cellules des contrôles de viabilité de compensation de couleur unique dans 200 microlitres de colorant de viabilité dilué.

Transférer 100 microlitres de ces cellules dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et le chauffer pendant cinq minutes à 65 degrés Celsius, puis transférer les cellules chauffées dans le puits d’origine avec les cellules vivantes restantes. Incuber les cellules à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes à l’abri de la lumière. Après l’incubation, centrifuger les cellules et décanter le surnageant en agitant ou en inversant la plaque sans contaminer les autres puits.

Lavez les cellules en les remettant en suspension dans 200 microlitres de DPBS, puis centrifugez et décantez le surnageant comme auparavant. Répétez le lavage DPBS à nouveau. Ajouter des microlitres de bloc FC dilué avec un tampon de coloration à un rapport de un à 50 pour obtenir une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre.

Pour les cellules péritonéales, ajoutez cinq microlitres de bloqueur de monocytes pour réduire la coloration non spécifique. Ensuite, incubez les cellules à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes, à l’abri de la lumière. Préparez des mélanges maîtres de coloration complets et des AMFO dans le tampon de coloration pour un volume final de 100 microlitres par million de cellules en utilisant les tableaux d’anticorps dans le manuscrit textuel.

Sans enlever le bloc FC, ajoutez 100 microlitres de mélanges de taches complètes et de FMO aux puits sélectionnés. Préparez des contrôles de compensation de couleur unique pour chaque anticorps et un ensemble de taches. Suivez les instructions du fabricant si vous utilisez des perles de compensation.

Incuber les cellules et les perles à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes, à l’abri de la lumière. Ensuite, centrifugez et décantez le surnageant en inversant et en agitant la plaque. Lavez les cellules et les perles dans 200 microlitres de tampon de coloration trois fois, en centrifugant et en décant le surnageant à chaque fois.

Remettre en suspension les cellules et les billes dans 200 microlitres de 2% de paraformaldéhyde dans le DPBS pour fixer les échantillons pour analyse. Incuber la cellule et les billes à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes, à l’abri de la lumière, puis centrifuger et décanter le surnageant en inversant ou en agitant la plaque. Resuspendez les cellules et les perles dans 200 microlitres de tampon de coloration.

Placez une plaque filtrante sur une plaque en U propre de 96 puits et transférez chaque échantillon dans un puits de la plaque filtrante à l’aide d’une multi-pipette. Centrifugez la plaque filtrante et décantez le surnageant. Pour les panneaux de maturation de la moelle osseuse et de la rate, remettez en suspension les cellules entièrement colorées dans 100 microlitres de tampon de coloration.

Combinez les deux puits pour chaque animal en un seul puits. Remettez en suspension les panneaux, les AMFO et les contrôles restants dans 200 microlitres de tampon de tache. Incuber des cellules fixes et des perles à quatre degrés Celsius pendant la nuit, à l’abri de la lumière.

Enregistrez les contrôles de compensation pour chaque panneau de coloration à l’aide des compensations de taches uniques préparées et définissez des portes positives et négatives pour chaque échantillon. Calculez la matrice de compensation à l’aide du logiciel. Commencez à acquérir le premier échantillon, en vous assurant que les portes sont bien définies.

Configurez la machine pour qu’elle s’exécute et enregistre les différents événements de cellule pour chaque échantillon, comme mentionné dans le manuscrit textuel. Procéder à l’analyse des données à l’aide d’un logiciel d’analyse par cytométrie en flux, en suivant les stratégies de contrôle dans le manuscrit textuel. L’analyse cytométrique en flux pour la caractérisation des cellules B péritonéales dans le péritoine montre les fréquences des cellules péritonéales viables, des cellules B totales, des sous-ensembles B-1 et B-2, ainsi que des cellules B-1a et B-1b chez la souris.

Lorsque les cellules B de la moelle osseuse ont été analysées, les fréquences des cellules viables, des cellules B totales, de la fraction A, des cellules pré-pro-B, de la fraction B, de la fraction C, de la fraction C’D, de la fraction E immature, de la fraction E transitionnelle et de la fraction F B chez la souris ont été déterminées. L’analyse des cellules B spléniques montre les fréquences des cellules de la rate viables, des cellules B totales, des cellules B transitionnelles, des cellules T1, T2, T3, des cellules B matures, des cellules Folliculaires I, des cellules folliculaires II, des cellules précurseurs et de la zone marginale mature et des cellules B-1 chez la souris. Les fréquences des cellules B d’immunoglobuline kappa et d’immunoglobuline lambda chez la souris ont été déterminées par une analyse cytométrique en flux de la rate.

Lors de l’exécution de ce protocole, vous devez résoudre le signal d’un détecteur qui saigne dans le suivant à l’aide de contrôles de compensation. Ces témoins pourraient être colorés individuellement ou avec des perles de compensation disponibles dans le commerce. Des tests supplémentaires peuvent être utilisés en conjonction avec la cytométrie en flux, comme l’immunohistochimie pour visualiser la localisation cellulaire dans les organes lymphoïdes, ainsi que la microscopie à deux photons pour analyser les réponses des cellules B dans l’espace et le temps réels.

L’analyse par cytométrie en flux des compartiments des cellules B permet de caractériser les phénotypes associés à la BCR et aux déficiences connexes, aux perturbations des molécules de signalisation BCR ou à la perturbation des cytokines qui modulent la survie des cellules B.