Name: Mesure dynamique et imagerie des capillaires, artérioles et péricytes dans le cœur de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Découvrez la mesure dynamique de la microcirculation coronaire ex vivo dans le cœur de souris. Cette méthode permet d'étudier les capillaires, les artérioles et les péricytes par imagerie de haute résolution.

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Ces travaux ont été soutenus en partie par le Center for Biomedical Engineering and Technology (BioMET); NIH (1U01HL116321) et (1R01HL142290) et l’American Heart Association 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).

Tous les soins aux animaux étaient conformes aux lignes directrices de l’Université du Maryland à Baltimore et le Comité institutionnelles de soins et d’utilisation des animaux a approuvé des protocoles.
1. Préparation des solutions
REMARQUE : Préparez des solutions à l’avance. Deux types de solutions de base sont utilisés dans les expériences : (1) les solutions salines physiologiques (PSS) pour le superfusate de bain et (2) les solutions tyrode pour le lumen perfusate. Un bouillonnement continu de CO2 est nécessaire pour maintenir le pH du PSS. La solution tyrode tamponnée par HEPES est utilisée dans le lumen au lieu de PSS pour éviter que des bulles n’entrent dans les vaisseaux, puisque les bulles endommageraient les cellules endothéliales7 et occlusent le flux.
<ol><li>Solution PSS : Voir la formule et la composition de la solution PSS dans le tableau 1. Faire 10 L de Ca2+sans glucose et sans glucose PSS solution de stock et stocker à température ambiante. 1 h avant toute procédure, sortir 1 L de la solution stock et bulle avec 5% de CO2 (74% N2 et 21% O2) pour garder le pH de solution à ~ 7,4. Ajouter 1,8 g de glucose et 1,8 mL de CaCl2 (1 M de bouillon)8. REMARQUE : Ajoutez Ca2+ seulement après avoir bouillonné lorsque le pH est ~7.4, sinon, Ca2+ sera précipité.</li>
	<li>La solution de Tyrode : Voir la formule et la composition de la solution tyrode dans le tableau 1. Filtrer la solution (0,22 μm) et la stocker à 4 °C pour une utilisation future9.</li>
	<li>Solution de Tyrode avec BDM (monoxime 2,3-Butanedione): Ajouter BDM comme inhibiteur réversible de myofilament pour empêcher la contraction des myocytes10. Pesez 600 mg BDM et ajoutez à 200 mL la solution de Tyrode. Remuer la solution avec BDM jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute. Aucune autre filtration n’est requise.</li>
	<li>Conservez la solution tyrode contenant du BDM à 4 °C pour une utilisation future.</li>
</ol>2. Préparation de chambre
<ol><li>Enduire à l’avance la chambre de dissectation et la chambre expérimentale de polydimethylsiloxane (PDMS) selon les instructions fournies par le fabricant.</li>
	<li>Remplissez la chambre de dissecting avec la solution tyrode contenant BDM.</li>
	<li>Allumez le refroidisseur 1 h avant l’intervention. Réglez la température à 4 °C.</li>
</ol>3. Préparation à la canule
<ol><li>Allumez le puller micropipette. Sélectionnez les paramètres selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Prenez un tube de verre borosilicate propre (le diamètre extérieur et intérieur des tubes de verre utilisés était de 1,2 mm et 0,69 mm respectivement).</li>
	<li>Insérez un tube de verre dans les pinces rainurées d’un puller pipette Sutter avec un filament chauffant en forme de U.</li>
	<li>Activez le tireur pour produire deux canules, chacune avec une longue pointe mince.</li>
	<li>Couper la pointe de chaque canule à l’aide d’une fine paire de ciseaux sous un microscope disséquant pour faire le diamètre final de la pointe autour de 100 à 150 μm.</li>
	<li>Le feu polit la pointe de la canule coupée pour arrondir légèrement les bords tranchants.</li>
	<li>Plier la canule le long de l’arbre à l’aide d’un fil de platine (chauffé avec un contrôle fin) placé sur le côté de l’arbre à environ 2 mm de la pointe. L’angle de la courbure dans la canule doit être d’environ 45°.</li>
	<li>Insérez l’extrémité ouverte de la canule dans le support de la chambre myographique sous pression et serrez le raccord. Connectez une seringue de 5 mL remplie de la solution tyrode de l’autre côté du raccord. Connectez la canule à un micromanipulateur monté sur la chambre (voir figure 1 et figure 2).</li>
	<li>Remplissez la canule de la solution tyrode à l’aide de la seringue (5 mL), en la rinçant, le tube et le connecteur des bulles d’air.</li>
	<li>Avant la procédure de cannulation, mesurer la pression de perfusion à l’intérieur de la canule sur une plage donnée de débit (50 à 300 μL/min, figure 3). Ne le faites que lorsqu’une nouvelle canule est utilisée. REMARQUE : La pression de perfusion à l’intérieur de la canule est proportionnelle au débit et est linéaire (Figure 3).</li>
</ol>4. Extraction du coeur de souris
<ol><li>Mettez une souris C57BL/6 (sexe, 8-16 semaines) dans la boîte d’anesthésie qui est reliée aux réservoirs d’isoflurane et d’oxygène.</li>
	<li>Allumez le réservoir d’oxygène et commencez le flux d’isoflurane. Attendez ~5 min jusqu’à ce que la souris soit entièrement anesthésiée.</li>
	<li>Une fois l’anesthésie établie, sortez la souris de la boîte d’anesthésie et injectez de l’héparine IP (dans la cavité péritonéale, 360 unités, 0,5 mL/souris) pour éviter la formation de caillots sanguins dans la vascularisation. Ensuite, remettre la souris dans la boîte d’anesthésie.</li>
	<li>10 min après l’injection de l’héparine, déplacez la souris vers le lit chauffé en position supinée et stabilisez ses pattes à l’aide de ruban adhésif. Gardez la souris sous anesthésie complète avec de l’isoflurane à l’aide d’un cône nasal.</li>
	<li>Soulevez la peau abdominale de la souris au-dessus du diaphragme avec des forceps et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper et exposer le diaphragme.</li>
	<li>Couper le diaphragme et le sternum. Ouvrez la poitrine.</li>
	<li>Disséquer le cœur de la cavité thoracique, en coupant le plus près possible de la paroi thoracique dorsale.</li>
	<li>Placez le cœur dans la solution glacée tyrode contenant 30 mM BDM.</li>
	<li>Nettoyez le cœur pour enlever les tissus conjonctifs tels que les poumons.</li>
	<li>Transférer le cœur dans la chambre de dissecting pré-refroidie remplie de la solution de Tyrode contenant 30 mM BDM.</li>
</ol>5. Préparation et cannulation de l’artère septale
<ol><li>Allumez la pompe servo. Réglez la pompe servo en mode « flow ». Laissez-le fonctionner à grande vitesse jusqu’à ce que le tube soit rempli de la solution tyrode qui sera utilisée pour imprèder le lumen vasculaire. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans le tube. Ensuite, baissez la vitesse.</li>
	<li>Épinglez le cœur sur le PDMS, en évitant tout dommage à la zone centrale du cœur.</li>
	<li>Retirez les airs droit et gauche. Coupez le ventricule droit et retirez le mur libre ventriculaire droit à l’aide d’un microscope disséquant.</li>
	<li>Exposer et identifier l’artère septale. Placez un fil de nylon (30 μm de diamètre) sous l’artère septale et attachez un nœud lâche pour une utilisation future. REMARQUE : L’artère septale peut être facilement identifiée à l’aide d’un microscope disséquant. L’artère septale est une artère principale sur le septum provenant de l’artère coronaire droite dans la plupart des cas.</li>
	<li>Retirer le mur libre ventriculaire gauche à l’aide de ciseaux fins.</li>
	<li>Transférer la préparation musculaire papillaire dans la chambre expérimentale dans laquelle la canule a été positionnée. La chambre est remplie de la solution de Tyrode contenant BDM. Le fond de cette chambre est recouvert d’une fine couche (~2 mm) de PDMS.</li>
	<li>Ajuster la position de la canule (à l’aide du micromanipulateur) pour permettre la cannulation de l’artère septale. Serrez le nœud.</li>
	<li>Fixez le muscle papillaire à l’aide de petites broches au plancher de la chambre afin que l’objectif du microscope ait une vue claire de la vascularisation. Faites attention à l’angle et à la position de la canule et assurez-vous que la pointe de la canule est parallèle à la paroi artérielle.</li>
	<li>Testez la cannulation en expulsant progressivement la solution de la seringue à travers la canule. Si tous les éléments fonctionnent correctement, le sang résiduel dans le muscle papillaire quittera le tissu au début de ce processus et seule la solution de Tyrode sera vue plus tard.</li>
</ol>6. Stabilisation de la préparation
<ol><li>Allumez la pompe périssaliste qui fournira la solution de superfusion. Puis constamment surfucer la préparation dans le bain avec PSS pré-gazé à la vitesse de 3-4 mL/min.</li>
	<li>Allumez le contrôleur de température pour la solution de superfusion. Réglez la température du superfusate de bain à ~35-37 °C.</li>
	<li>Connectez la canule à la pompe servo. Lisez la pression affichée sur le contrôleur servo de pression.</li>
	<li>Surveillez le débit et la pression. Le débit (μL/min) et la pression artérielle de perfusion (mm Hg) sont numérisés à l’aide d’un numériseur et enregistrés à l’aide d’un logiciel associé (figure 2).</li>
	<li>Réglez le flux pour régler la pression ~ 10 mmHg et laissez-le fonctionner pendant ~ 10 min.</li>
	<li>Augmenter le débit de la solution luminaire pour faire la pression de l’artère ~ 60 mmHg. Obtenez la pression finale de perfusion de l’artériole elle-même en soustrayant la baisse de pression de la canule (Figure 3). REMARQUE : Si le mode « pression » sur le contrôleur servo de pression est sélectionné, la pression luminale est réglée ~60 mmHg pour ces expériences. Ensuite, surveillez le changement du flux.</li>
	<li>Laissez l’échantillon se stabiliser pendant ~30-60 min en surveillant le débit et/ou les niveaux de pression. Une augmentation progressive de la pression artérielle est normalement observée au début de la perfusion après cannulation. Un nouvel état stable sera établi par lui-même en environ 30 min (Figure 4).</li>
	<li>Lancez une expérience après la stabilisation de la pression de perfusion (à débit constant).</li>
</ol>7. Chargement de la préparation avec de l’agglutinine de blé-germe étiquetée fluorescente (WGA)
<ol><li>Préparez la solution de Tyrode contenant alexa-fluor-488 conjugué WGA en ajoutant 100 μg de WGA conjugué dans 5 mL de la solution de Tyrode.</li>
	<li>Passez soigneusement du perfusate de la solution normale de Tyrode à une solution contenant wga étiquetée fluorescente. Il est important de changer soigneusement le perfusate afin qu’aucune bulle ne soit introduite.</li>
	<li>Après ~30 min de perfusion WGA ou lorsque la solution WGA est sur le point de s’épuiser, changez le perfusate pour revenir à la solution normale de Tyrode.</li>
</ol>8. Imagerie confocale d’artérioles et capillaires
<ol><li>Allumez le système de microscope confocal à disque Nipkow.</li>
	<li>Utilisez le microscope pour localiser l’artère septale à l’aide d’un objectif de faible puissance (4x) en mode lumière transmise. REMARQUE : L’artère septale peut être située en suivant la position de la canule.</li>
	<li>Commencez l’imagerie confocale avec le disque rotatif confocal et choisissez 488 nm excitation laser, grossissement objectif 40x et ajuster l’intensité laser et le taux d’échantillonnage (10 - 500 ms par image).</li>
	<li>Configurez des positions d’imagerie de haut en bas pour le microscope confocal afin de définir la plage d’imagerie et d’entrer les paramètres de l’imagerie z-stack.</li>
	<li>Définissez la taille de l’étape comme recommandé pour le système qui est utilisé ou définissez la taille de l’étape comme vous le souhaitez.</li>
	<li>Choisissez le paramètre z-stack et/ou les paramètres des séries de temps.</li>
	<li>Sélectionnez ou définissez un nouveau dossier pour stocker la nouvelle image.</li>
	<li>Cliquez sur "Exécuter" pour commencer à enregistrer l’imagerie pour une analyse future( Figure 5).</li>
</ol>9. Exemple d’expérience vasodilatateur : vasodilatation induite par le pinacidil (Vidéo 1).
<ol><li>Préparer la solution de stock de pinacidil (100 mM en DMSO) et stockée à 4 °C.</li>
	<li>Préparez 10 mL de solution tyrode. Ajouter 10 μL de solution de stock de pinacidil pour faire la concentration finale de pinacidil 100 μM.</li>
	<li>Image du muscle papillaire à faible grossissement (objectif 4x) pour inclure l’artère septale et les artérioles de branche.</li>
	<li>Passez de la solution luminaire à la solution contenant du pinacidil.</li>
</ol>10. Exemple d’expériences de contrôle du flux sanguin : augmentation de la pression artérielle induite par vasoconstricteur à débit constant (Figure 6)
<ol><li>Préparer la solution de stock endothéline-1 (ET-1) (10 μM) et stockée à -20 °C.</li>
	<li>Préparez 10 mL de solution tyrode. Ajouter 10 μL de solution de stock ET-1 (10 μM) pour faire la concentration finale d’ET-1 10 nM.</li>
	<li>Enregistrez la pression luminaire avec un débit constant et imagez le muscle papillaire.</li>
	<li>Passez de la solution luminaire à la solution contenant et-1.</li>
</ol>11. Exemples d’images capillaires avec péricytes (Figure 7)
<ol><li>Sacrifier une souris transgénique NG2DsRedBAC telle que décrite dans la section 4 de ce protocole.</li>
	<li>Extraire le cœur, cannuler l’artère septale et charger l’échantillon avec Alexa-Fluor-488 conjugué WGA suivant les protocoles 5-7.</li>
	<li>Image du muscle papillaire à 488 nm et 560 nm excitation, et 510-525 nm, émission de 575-625 nm en utilisant confocal. La pression artériole sera d’environ 40 mmHg.</li>
</ol>

<ol><li>Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-+and+voltage-dependent+electro-metabolic+signaling+regulates+blood+flow+in+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).</li>
<li>Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+perfusion+pressure+on+force+of+contraction+in+thin+papillary+muscles+and+trabeculae+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart.</a> Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).</li>
<li>Tillmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcirculation+in+the+ventricle+of+the+dog+and+turtle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle.</a> Circulation Research. 34, 561-569 (1974).</li>
<li>Martini, J., Honig, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+intercapillary+distance+in+beating+rat+heart+in+situ+under+various+conditions+of+O2+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply.</a> Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).</li>
<li>Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+coronary+vessel+pressure+and+diameter+in+an+intact+beating+rabbit+heart+using+fixed-position+and+free-motion+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques.</a> Circulation Research. 49, 342-353 (1981).</li>
<li>Marcus, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+coronary+circulation+through+studies+at+the+microvascular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level.</a> Circulation. 82, 1-7 (1990).</li>
<li>Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+protocol+for+removal+of+the+endothelium+from+the+perfused+rat+hind-limb+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation.</a> Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).</li>
<li>Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptors+mediate+UTP-induced+cation+currents%2C+Ca2%2B+signals%2C+and+vasoconstriction+in+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Amercian+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries.</a> Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).</li>
<li>Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1+enhances+SR+Ca2%2B+content+through+binding+phospholamban+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).</li>
<li>Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction+uncoupling+with+butanedione+monoxime+versus+low+calcium+or+high+potassium+solutions+on+flow+and+contractile+function+of+isolated+hearts+after+prolonged+hypothermic+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion.</a> Circulation. 89, 2412-2420 (1994).</li>
<li>Lawton, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Low-Cost+and+Open+Source+Pressure+Myograph+System+for+Vascular+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology.</a> Frontiers in Physiology. 10, 99(2019).</li>
<li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).</li>
</ol>

Dans le présent travail, nous avons introduit une méthode ex vivo remarquablement simple mais très pratique pour étudier la microcirculation coronaire dans le cœur dans des conditions physiologiques. Cette méthode a été modifiée à partir d’investigations mécaniques à l’aide de rats2. L’ajout stimulant a été la technologie d’imagerie à grande vitesse et haute résolution optique. Nous avons donc pu tirer parti des systèmes d’imagerie optique avancés qui sont maintenant disponibles sur le marché. Par...

Une régulation appropriée du débit de pression coronaire assure un approvisionnement suffisant en sang au cœur pour répondre à ses exigences métaboliques1. Cependant, il n’est devenu clair que récemment comment le flux de pression coronaire est dynamiquement régulé dans le cœur, malgré des études approfondies qui ont été effectuées in vivo et in vitro au cours des dernières décennies. L’une des raisons est la difficulté d’établir un modèle de travail physiologique pour de telles études en raison du battement constant du cœur. Quoi qu’il en soit, une variété de méthodes ont été établies pour l’observation des micro-vaisseaux coronaires dans les tissus vivants ou les animaux, mais aucune de ces méthodes n’a été en mesure d’atteindre une concentration constante / stable et les mesures de la pression, le débit et le diamètre microvasculaire enmême temps 2,3. La visualisation directe des micro-vaisseaux artériaux coronaires dans le cœur battant a été introduite ily a des décennies 4,3, mais les mesures de diamètre dans les petits vaisseaux étaient difficiles et les fonctions spécifiques des nombreux types de cellules spécialisées associées à la microcirculation étaient tout aussi vexante. Même la méthode stroboscopique et le système d’objectif flottant ne pouvaient pas fournir les informations ci-dessus simultanément5. Néanmoins, une quantité importante d’informations précieuses a été obtenue en utilisant les technologies susmentionnées, qui nous ont aidés à mieux comprendre la régulation du flux sanguin coronaire6. La méthode que nous décrivons dans cet article aidera à étudier et à comprendre en détail comment les composants des artères coronaires, les artérioles et la microvasculature réagissent différemment aux stimulations et aux demandes métaboliques.
Le modèle de travail que nous avons établi pour poursuivre ces études a été construit sur les travaux antérieurs de Westerhof et coll.2. Après cannulation de l’artère septale du coeur de souris, la solution saline physiologique a été employée pour parcourir cette artère pour maintenir les myocytes et d’autres composants du tissu cardiaque nourris. La pression artérielle de perfusion, le flux et le diamètre vasculaire ont été surveillés parmi d’autres fonctions physiologiques utilisant des indicateurs fluorescents appropriés. Cette méthode nous permet de visualiser le lit microvasculaire coronaire sous pression physiologique dans les tissus vivants et d’étudier pour la première fois les mécanismes cellulaires sous-jacents à la régulation de la microcirculation.

<table><tbody><tr><td>1 M CaCl2</td><td>solution MilliporeSigma, États-Unis</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2 solution</td><td>MilliporeSigma, États-Unis</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>AxoScope software</td><td>Molecular Devices, San Jose, CA, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refroidisseur/incubateur d’eau</td><td>FisherScientific, États-Unis</td><td>Isotemp 3016S</td><td></td></tr><tr><td>Confocal</td><td>Nikon Instruments, États-Unis</td><td>A1R</td><td></td></tr><tr><td>Tube en verre sur mesure</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>9-000-3301</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1322A</td><td>Molecular Devices, San Jose, CA, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Olympus, Japon</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Endothelin-1</td><td>MilliporeSigma, États-Unis</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Héparine sodique Salt</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Solution en ligne Chauffage</td><td>Warner Istruments, Hamden, CT, États-Unis</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>VETone, Idaho, États-Unis</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA, États-Unis</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Porte-micropipettes/canules</td><td>Warner Istruments, Hamden, CT, USA</td><td>64-0981</td><td></td></tr><tr><td>Souris transgénique NG2DsRedBAC</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#008241</td><td></td></tr><tr><td>Fil de nylon pour attacher les vaisseaux sanguins</td><td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>PDMS (polydimethylsiloxane)</td><td>SYLGARD, Germantown, WI, USA</td><td>184 SIL ELAST KIT</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Gilson, Middleton, WI, USA</td><td>minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>Servo de pression Contrôleur</td><td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, États-Unis</td><td>PS-200-S</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA, États-Unis</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Servopompe Living</td><td>Systems Instrumentation, Burlington, Vt, États-Unis</td><td>PS-200-P</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de température</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, États-Unis TC-324B</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agglutinine de germe de blé, Alexa Fluor 488 Conjugué</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA États-Unis</td><td>W11261</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure dynamique et imagerie des capillaires, artérioles et péricytes dans le cœur de souris

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Le tonus coronaire avec l’ouverture ou la fermeture des capillaires déterminent en grande partie le flux sanguin vers les cardiomyocytes à la pression constante de perfusion. Cependant, il est difficile de surveiller les changements dynamiques des artérioles coronaires et des capillaires dans tout le cœur, principalement en raison de son mouvement et de ses battements non-stop. Ici, nous décrivons une méthode qui permet de surveiller le taux de perfusion artérielle, la pression et les changements de diamètre des artérioles et capillaires dans les muscles papillaires ventriculaires droit de la souris. L’artère septale de la souris est cannulée et perfusée à un débit ou une pression constant avec l’autre mesurée dynamiquement. Après perfusion avec une lectine étiquetée fluorescente (p. ex., Alexa Fluor-488 ou -633 étiquetée Wheat-Germ Agglutinin, WGA), les artérioles et capillaires (et autres vaisseaux) du muscle papillaire et du septum du ventricule droit pouvaient être facilement imités. Les changements de diamètre du vaisseau pourraient alors être mesurés en présence ou en absence de contractions cardiaques. Lorsque des protéines fluorescentes génétiquement codées ont été exprimées, des caractéristiques spécifiques ont pu être surveillées. Par exemple, les péricytes ont été visualisés dans des cœurs de souris qui exprimaient NG2-DsRed. Cette méthode a fourni une plate-forme utile pour étudier les fonctions physiologiques des péricytes capillaires dans le cœur. Il convient également à l’étude de l’effet des réhésifs sur le flux sanguin dans le cœur en mesurant simultanément le diamètre vasculaire/capillaire et la pression luminaire artérielle. Cette préparation, combinée à un système d’imagerie optique à la fine pointe de la technologie, permet d’étudier le flux sanguin et son contrôle au niveau cellulaire et moléculaire dans le cœur dans des conditions quasi physiologiques.

Lorsqu’un marqueur vasculaire de fluorescence est perfusé dans le lumen vasculaire (ici WGA conjugué à Alexa Fluor-488), il est possible de visualiser des arbres vasculaires entiers comme le montre la figure 5 (panneau gauche) à l’aide d’un microscope confocal à grande vitesse. Un grossissement plus important permet l’imagerie capillaire en détail(figure 5, panneau droit). Puisque le système pressurisé prend en charge une surveillance constante de la pression lu...

Présenté ici est un protocole pour étudier la microcirculation coronaire dans le tissu cardiaque murin vivant par la surveillance ex vivo de la pression artérielle de perfusion et le flux qui maintient la pression, ainsi que les composants vasculaires de l’arbre, y compris les lits capillaires et péricytes, que l’artère septale est cannulée et pressurisée.

Mesure dynamique et imagerie des capillaires, artérioles et péricytes dans le cœur de souris

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

Cette méthode peut être utilisée pour étudier la microcirculation coronaire dans le tissu cardiaque murin vivant et les composants de l’arbre vasculaire par surveillance ex vivo de la pression et du débit de perfusion artérielle. Cette méthode fournit une plate-forme utile pour étudier la fonction de la microcirculation des péricytes et des réactifs dans le cœur, c’est-à-dire que nous avons tendance à mesurer le diamètre vasculaire et la pression luminale de l’artériole. Pour préparer une canule pour l’expérience, utilisez un extracteur de micropipette pour produire deux canules à pointes longues et minces, à partir d’un seul tube en verre borosilicaté propre.Utilisez une paire de ciseaux fins et un microscope à dissection pour couper l’extrémité de chaque canule jusqu’à un diamètre final de 100 à 150 micromètres, et polissez au feu les pointes pour arrondir légèrement les arêtes vives. Utilisez un fil de platine positionné sur le côté de la tige, à environ deux millimètres de la pointe, pour plier la canule le long de la tige à un angle d’environ 45 degrés, et insérez l’extrémité ouverte de la canule dans le support de canule. Ensuite, serrez le raccord et utilisez une seringue de cinq millilitres pour rincer la canule et le tube avec la solution de Tyrode.Montez le support de canule sur la micro-manipulation d’une chambre de myographe de pression. Pour collecter un cœur de souris pour l’expérience, entrez d’abord une paire dans celle-ci injectez 500 microlitres d’héparine dans une souris anesthésiée de huit à 16 semaines C 57 black six. Après 10 minutes, placez la souris sur un lit chauffant en position couchée et stabilisez les pattes avec du ruban adhésif.À l’aide d’une pince et de ciseaux chirurgicaux, faites une incision dans la peau abdominale, au-dessus du diaphragme et coupez le diaphragme et le sternum pour permettre la dissection du cœur à partir de la cavité thoracique. Placez le cœur dans la solution glacée de Tyrode contenant 30 millimolaires de BDM et retirez tous les tissus conjonctifs du cœur si nécessaire. Placez ensuite le cœur dans une chambre de dissection pré-refroidie, remplie d’une solution fraîche de Tyrode complétée par 30 millimolaires de BDM.Pour préparer l’artère septale à la canulation, allumez la pompe d’asservissement et réglez la pression du servocontrôleur sur le mode d’écoulement. Dans le cœur sur le PDMS, en prenant soin d’éviter d’endommager la zone médiane du tissu et placez le tissu sous un microscope à dissection. Retirez un ou les deux oreillettes et ouvrez le ventricule droit.Retirez la paroi libre du ventricule droit et exposez l’artère septale. Utilisez un fil de nylon de 30 micromètres de diamètre pour faire un nœud lâche autour de l’artère septale. À l’aide de ciseaux fins, on retire la paroi libre du ventricule gauche et on transfère la préparation du muscle papillaire dans la chambre expérimentale.À l’aide d’un micromanipulateur, insérez une canule dans l’artère septale et fixez la canule avec la suture. Ensuite, utilisez des broches pour fixer le muscle papillaire au sol de la chambre avec l’extrémité de la canule parallèle à la paroi artérielle, afin d’obtenir une vue claire du système vasculaire, et utilisez la seringue pour rincer progressivement la solution à travers la canule. Pour stabiliser la préparation tissulaire, allumez une pompe péristaltique et fusionnez continuellement la préparation avec une solution saline physiologique pré-gazée à un débit de trois à quatre millilitres par minute, allumez le régulateur de température pour la solution de superfusion et ajustez la température du superfusat du bain à 35 à 37 degrés Celsius.Connectez la canule à la servopompe et ajustez le débit pour régler la pression à environ 10 millimètres de mercure. Laissez la superfusion fonctionner pendant environ 10 minutes, puis augmentez le débit de la solution luminale pour régler la pression artérielle à environ 60 millimètres de mercure et permettre à l’échantillon de se stabiliser pendant 30 à 60 minutes avec surveillance. Pour charger l’échantillon avec de l’agglutinine de germe de blé, perfuser la préparation avec cinq millilitres de solution de Tyrode, complétés par 100 microgrammes d’agglutinine de germe de blé conjuguée Alexa Fluor-488.Après 30 minutes, remplacez l’aide à la perfusion par la solution normale de Tyrode et allumez le système de microscope confocal. Utilisez le microscope à une puissance de grossissement plus faible, pour localiser l’artère septale en mode lumière transmise, et commencez l’imagerie avec ce disque confocal en rotation. Sélectionnez un grossissement d’objectif 40X et le laser d’excitation de 488 nanomètres, puis ajustez l’intensité du laser et la fréquence d’échantillonnage.Pour définir la plage d’imagerie, définissez les positions d’imagerie supérieure et inférieure du microscope et définissez la taille du pas et les paramètres d’imagerie Z-stack. Ensuite, sélectionnez un dossier pour stocker l’image et cliquez sur Exécuter pour commencer à enregistrer les images. Lorsqu’un marqueur vasculaire de fluorescence est perfusé dans la lumière vasculaire, il est possible de visualiser des arbres vasculaires entiers, à l’aide de la microscopie confocale à grande vitesse.Un grossissement supplémentaire permet d’imager le capillaire en détail. Lorsque le pinacidil et l’agoniste des canaux potassiques sensibles à l’ATP sont servis à partir de la lumière, le diamètre des artères augmente. Lorsque l’endothéline vasoconstrictrice est appliquée à partir de la lumière.Le diamètre de l’artère diminue. Lorsque le débit défini est constant, la pression luminale augmente. Dans ces images du tissu papillaire d’une souris transgénique exprimant NG deux DS rouge, le capillaire et les péricytes peuvent être visualisés dans le tissu musculaire papillaire, dans des conditions qui imitent mieux la physiologie des animaux vivants.Il est important qu’aucune bulle ne soit présente à l’intérieur du tube à aucun moment de la procédure. En combinant cette méthode avec des techniques d’imagerie optique, la préparation peut être utilisée pour étudier la microcirculation dans le cœur et les communications intercellulaires entre différents types de cellules, en utilisant des souris transgéniques à fluorescence.

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