Quantification de l’ADN spécifique du porc circulant dans le sang d’un modèle de xénotransplantation

Xenotransplantation est une méthode réalisable pour traiter Cependant, une surveillance efficace du rejet immunitaire de la xénotransplantation est un problème pour les médecins et les chercheurs. Ce protocole est une méthode simple, pratique, peu coûteux et moins invasive pour surveiller le rejet immunitaire de la xénotransmutation. Cette technique peut être utilisée dans le domaine de la xénotransplantation, y compris la transplantation d’îlots de porc à l’homme, la transplantation rénale, la transplantation hépatique et la transplantation cardiaque.

Commencez par transférer 500 microlitres d’échantillons de sang dans différents tubes de micro centrifugeuse. Ajouter 20 microlitres de protéase K et 500 microlitres de tampon de lyse dans les tubes. Ensuite, secouez-les soigneusement pour mélanger.

Mettez les tubes dans un bain d’eau à 56 degrés Celsius pendant 10 minutes, en les secouant deux à trois fois pendant l’incubation jusqu’à ce que la solution devienne une centrifugeuse claire brièvement pour enlever les perles liquides de la paroi intérieure des couvercles du tube. Ajouter ensuite 500 microlitres d’alcool anhydre et éthylique et bien agiter. Transférer le mélange dans la colonne d’adsorption.

Ensuite, centrifugez la colonne pendant deux minutes et jetez le liquide de rebut. Ajoutez 800 microlitres de solution de rinçage à chaque colonne d’adsorption et centrifugeuse pendant une minute. laisser les colonnes à température ambiante pendant quelques minutes pour sécher le reste de la solution de rinçage.

Transférer les colonnes d’absorption dans un tube centrifuge propre. Ajouter 50 microlitres de tampon d’élitution au milieu des films d’adsorption et les placer à température ambiante pendant deux à cinq minutes, puis les centrifuger pendant une minute. Préparer le mélange principal PCR selon les instructions manuscrites, puis ajouter 23 microlitres du mélange dans chaque tube de centrifugeuse micro de 0,6 millilitre.

Ajouter deux microlitres d’ADN génomique à chaque tube et soigneusement Cabot. Mélanger et centrifugeuse brièvement. Placez les tubes dans un cycleur PCR et démarrez l’amplification.

Lorsque la réaction est terminée effectuer électrophoresis Agarose. Ajouter 1,2 gramme d’Agarose dans un flacon contenant cent millimètres de TAE et le faire bouillir pendant cinq minutes au micro-ondes. Une fois que l’Agarose a refroidi à environ 70 degrés Celsius, ajouter cinq microlitres de colorant acide nucléique dans le flacon, lentement, le verser dans la plaque et le laisser à température ambiante jusqu’à ce qu’il se solidifie en gel.

Ajouter cinq microlitres de chaque échantillon et 2-Log ÉCHELLE d’ADN ou marqueur d’ADN 1, dans les puits du gel Agarose et l’électrophoresis à 120 millions de pilier jusqu’à ce que les bandes sont séparées. Visualisez le gel à l’aide d’un imageur ultraviolet. Après avoir effectué la transformation telle que décrite dans le manuscrit de texte, vérifiez les plasmides par digestion d’enzyme de double restriction avec EcoR I et Bam HI. Séparez les produits digérés avec 1% d’électrophorèse agarose et exposez le gel à la lumière UV.

Diluer le plasmide concentré avec le fragment d’ADN porcin à deux fois 10 à 11e copies par millilitre pour la solution standard de départ, en utilisant de l’eau distillée double. Pour établir une courbe standard, préparez un mélange de maîtres qPCR, tel que décrit dans le manuscrit du texte et ajoutez 40 microlitres du mélange dans chaque tube d’une bande de huit tubes. Ajouter 10 microlitres d’ADN standard de différentes concentrations, plafonner les tubes puis les mélanger brièvement et les centrifuger.

Placez les tubes dans la machine qPCR et effectuez l’amplification. Utilisez des tubes EDTA pour recueillir des échantillons de sang d’environ 400 microlitres des modèles de patch d’artère de porc à singe, ou 100 microlitres des modèles de transplantation de cellules de porc à souris. Transférer ensuite les échantillons dans des tubes de centrifugeuse de 1,5 millilitre.

Retirer les cellules sanguines des échantillons de sang par centrifugation à basse température et à grande vitesse. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de centrifugeuse de 1,5 millilitres et enlever les débris cellulaires par centrifugation à 16 000 fois G pendant 10 minutes. Transférer le supernatant dans un nouveau tube centrifugeuse de 1,5 millilitre et extraire l’ADN circulant à l’aide d’un sérum commercial tout en faisant circuler le kit d’extraction d’ADN.

Condensez le volume d’ADN circulant à 40 microlitres et stockez-le à 20 degrés Celsius négatifs. Effectuer qPCR pour quantifier l’ADN circulant spécifique au porc. Les amorces spécifiques aux porcins ont été conçues et utilisées pour quantifier l’ADN circulant spécifique aux porcs par qPCR, dans des modèles de transplantation de cellules de porc à souris et de patch d’artère de porc à singe, modèles de transplantation.

L’électrophoresis d’Agarose a été employé pour isoler des fragments amplifiés d’ADN. À l’aide de PCR, les amorces spécifiques à l’ADN génomique porcin amplifié ont été identifiées. Ensuite, les spécificités des espèces de ces amorce dans la cohorte de l’ADN génomique du singe ou de l’homme ou dans la cohorte de l’ADN génomique de souris, ont été confirmées.

Enfin, deux amorces spécifiques à chaque espèce, ont été utilisées pour amplifier l’ADN de porc dans le patch de l’artère porc-singe et de porc à souris, modèles de transplantation cellulaire. La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de ce protocole, c’est que la contamination de toutes sortes devrait être évitée. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour explorer de nouvelles questions au sein de la xénotransplantation parce qu’il s’agit d’une méthode simple à faible coût et non invasive pour surveiller le rejet immunitaire de la xénotransplantation.