Permettre une compensation en temps réel dans les oxydations photochimiques rapides des protéines pour la détermination des changements de topographie des protéines

La méthode facilite la mesure de la confirmation des protéines et des interactions protéiques. Les exigences en matière de composition tampon, de pureté de l’échantillon et de concentration de protéines sont flexibles, ce qui permet à la méthode de résoudre des problèmes structurels difficiles. Cette technique permet une compression d’échantillons dans une grande variété de systèmes tampons différents.

À l’aide de notre méthode de dosimétrie, les chercheurs peuvent surveiller dans quelle mesure leurs réactions d’étiquetage fonctionnent en temps réel. Une application de cette technologie est dans le développement de médicaments, car elle permet aux chercheurs de tester des formulations de médicaments très différentes et comment elles affectent la structure des protéines. Pour préparer le banc optique FPOP.

Allumez d’abord le laser et réglez le laser sur la gâchette externe, l’énergie constante et aucun remplacement de gaz. Lorsque le laser s’est réchauffé, réglez l’énergie laser par impulsion entre 80 et 120 milligrammes par impulsion et utilisez une torche de butane pour brûler doucement le codage polyimide du capillaire à l’endroit où le dosimètre en ligne lira le signal absorbant à 265 nanomètres après l’exposition au laser. Utilisez un lingette sans peluche et du méthanol pour essuyer doucement les débris du capillaire et placer le capillaire nettoyé par le chemin de faisceau du laser et dans le dosimètre en ligne.

Appuyez sur le levier sur le dessus du dosimètre en ligne pour ouvrir la charnière et enlever les supports magnétiques. Placez le capillaire dans la rainure de la machine du dosimètre en ligne à l’aide des supports magnétiques pour maintenir le capillaire en place et fermer la charnière du dosimètre au-dessus du capillaire en appuyant sur la charnière jusqu’à ce que le levier se verrouille en place. Cliquez sur le bouton flash de démarrage dans le logiciel de dosimétrie pour commencer à tirer le laser excimère et définir le taux de répétition prédéfini entre 10 et 20 Hertz dans le logiciel de dosimétrie avec le tir au laser déplacer le stade motorisé à travers sa gamme de mouvement, en veillant à ce que le faisceau reste centré sur l’ouverture et que la silhouette du capillaire peut être observée partout.

Puis rincer le capillaire avec de l’eau à 20 microlitres par minute pendant au moins une minute et cliquez sur démarrer les données plus zéro automatique dans le logiciel de dosimètre pour zéro le dosimètre à l’eau avant de commencer la collecte de données. Pour effectuer une expérience FPOP ajouter deux microlitres de peroxyde d’hydrogène à 18 microlitres de solution FPOP et utiliser une pipette pour mélanger doucement la solution rapidement recueillir la solution au fond du tube par centrifugation et immédiatement utiliser une seringue étanche au gaz pour charger la solution dans une pompe à seringues. Cliquez sur démarrer la pompe et démarrer les données dans le logiciel de dosimètre pour démarrer le flux sur la pompe à seringues au débit approprié et utiliser le dosimètre en ligne pour surveiller la lecture en temps réel de l’adénone jusqu’à ce que le signal absorbant à 265 nanomètres stabilise la collecte de l’échantillon dans un conteneur à déchets.

Pour commencer à tirer le laser à l’énergie de fin de taux de répétition prédéfinie cliquez sur le bouton flash de démarrage dans le logiciel de dosimètre et utilisez le dosimètre en ligne pour surveiller la lecture en temps réel de l’adénone. La différence dans l’absorption à 265 nanomètres avec le laser éteint et le laser sur sera les absorbants delta à 265 nanomètres de lecture. S’assurer que des radicaux hydroxyles comparables sont disponibles pour réagir avec des protéines sur différents échantillons.

Comparez les absorbants delta à 265 nanomètres de lecture obtenus avec le dosimètre en ligne avec le désir delta absorbants à 265 nanomètres de lecture obtenus à partir d’expériences ou de contrôles antérieurs. Si la lecture est au niveau désiré recueillir l’échantillon immédiatement après le laser ou le rayonnement dans le tampon étanche. Pour compenser la dose radicale efficace pour égaliser les lectures d’absorption changer la concentration de peroxyde d’hydrogène, changer l’énergie laser par impulsion ou changer le plan focal de la lentille focale pour augmenter la fluidité laser.

Pour effectuer un changement d’unité d’absorption supérieur à 10 millimètres dans la lecture des absorbants delta, refaitz l’échantillon avec plus ou moins de peroxyde d’hydrogène et réexécuter l’échantillon tel que démontré. Pour effectuer un petit changement dans la lecture de l’absorption en temps réel, utilisez l’étape motorisée de 50 millimètres pour ajuster la position de la lentille focale pour ajuster le plan focal du faisceau incident. Pour mesurer la quantité effective de radical hydroxyle présent dans l’échantillon après le rayonnement laser surveiller les absorbants delta de l’adénine à 265 nanomètres en temps réel avec un détecteur capillaire UV en ligne en utilisant le stade motorisé pour ajuster la position de la lentille jusqu’à ce que les absorbants delta à 265 nanomètres de lecture est égale à la lecture désirée.

La comparaison de l’empreinte peptidique de la chaîne lourde de l’adilumumab biosimilaire dans le tampon de phosphate et après chauffage à 55 degrés Celsius pendant une heure révèle que les régions peptidiques indiquées démontrent une protection significative contre les solvants lorsque la protéine est chauffée pour former des agrégats. L’utilisation d’un dosimètre en ligne en temps réel pour surveiller la différence entre les absorbants d’adénoine avant et après le laser ou le rayonnement indique qu’un changement comparable du niveau absorbants de l’adénone est observé dans le tampon MES par rapport au tampon phosphaté. Alors que l’oxydation moyenne des peptides est plus faible en présence de tampon MES par rapport au tampon phosphate.

Cependant, comme la fluence laser est augmentée pour avoir une réponse égale de dosimétrie d’adénine les valeurs moyennes d’oxydation de peptide sont presque les mêmes après tampon de FPOP et de MES et tampon de phosphate. Comme la lecture de dosimétrie est affectée par la concentration de peroxyde de fluence laser ainsi que le charognard radical. Faites attention à ce que la réponse de dosimétrie entre l’échantillon se rapproche les uns des autres.

La mutagenèse dirigée par le site est souvent utilisée pour sonder les sites protégés par la FPOP. Cela permet aux chercheurs de déterminer si des changements sont dus à Alistair. Cette technique facilite la comparaison des protéines dans différents tampons ou formulations permettant aux chercheurs de déterminer l’effet de différents additifs sur la confirmation des protéines.