Préparation, administration et évaluation de l’absorption cellulaire in vivo de liposomes marqués par un colorant fluorescent

Notre protocole associe une méthode accessible de préparation de liposomes chargés de tesaglitazar à une approche approfondie pour évaluer l’absorption des liposomes au niveau cellulaire. Cette technique fournit une méthode impartiale pour évaluer l’absorption de liposomes marqués par fluorescence qui sont préparés à l’aide d’un équipement à basse température et facile à acquérir. Pour préparer des liposomes marqués par fluorescence chargés d’acétate de calcium et de tesaglitazar, utilisez d’abord une sonde d’un demi-pouce pour émulsionner une solution d’éther chloroforme de lipides par sonication pendant 30 secondes à température ambiante, 20 kilohertz et 50 % de puissance.

Transférez immédiatement la solution d’émulsion d’eau et d’huile homogénéisée dans un évaporateur rotatif doté d’un adaptateur spécial, d’un manomètre nanométrique et d’une soupape régulatrice de pression et connectez l’évaporateur à une conduite de vide. Pour éliminer les solvants organiques, réglez la vitesse de rotation sur 100 tours par minute et le vide sur 0,5 atmosphère. Une fois qu’un gel s’est formé et a disparu, augmentez le vide à 0,9 atmosphère et filtrez la dispersion aqueuse des liposomes d’avant en arrière à travers un filtre en polycarbonate de 200 nanomètres dans une extrudeuse de liposomes équipée de deux seringues étanches aux gaz à plusieurs reprises.

Après avoir vérifié la distribution granulométrique par diffusion dynamique de la lumière, utilisez une colonne de spin de deux millilitres pour éliminer tout tesaglitazar non piégé des liposomes et utilisez un spectrophotomètre pour déterminer la concentration de médicament piégée. Ensuite, n’ajoutez pas plus de 500 microlitres d’échantillon de liposomes dans le lit de gel de la colonne sèche. Pour administrer les liposomes par injection rétro-orbitaire, appuyez doucement sur la peau au-dessus et en dessous de l’œil exposé pour soulever l’œil au-dessus du plan du visage.

Ensuite, insérez soigneusement la pointe de l’aiguille dans le coin avant de l’œil, en vous assurant que l’aiguille se trouve sous l’orbe sans le toucher, et injectez lentement les liposomes dans l’espace rétro-orbitaire. Pour prélever l’échantillon de sang, au point final expérimental approprié, faites soigneusement une incision dans la peau au bord de l’extrémité caudale de la cage thoracique de la souris et coupez une ligne droite d’un centimètre vers la tête de l’animal jusqu’à ce que les muscles pectoraux soient exposés. Au site d’incision initial, faites deux petites incisions perpendiculaires à la ligne vers la tête et coupez soigneusement le muscle pectoral d’un côté de la cage thoracique dans la zone exposée pour permettre un meilleur accès et une meilleure visualisation du site d’insertion de l’aiguille.

Insérez l’aiguille entre la troisième et la quatrième côte en la maintenant aussi près que possible de la ligne médiane de la cage thoracique, et tirez doucement sur la seringue pour commencer à recueillir le sang. Lorsque le plus grand volume possible a été collecté, transférez le sang dans un microtube de centrifugation contenant 10 microlitres d’EDTA de 0,5 molaire sur glace. Pour extraire le coussinet post-tissulaire inguinal de chaque côté de la souris, utilisez une paire de pinces pour maintenir la membrane péritonéale sur le côté droit et la deuxième paire de pinces pour maintenir le bord de la peau au-dessus de la membrane péritonéale sur l’autre.

Retirez doucement la peau de la membrane pour séparer les couches les unes des autres. Épinglez le bord externe de la peau pour mieux accéder au dépôt adipeux et localisez le dépôt de tissu adipeux inguinal le long de la peau. Et localisez le ganglion lymphatique inguinal au centre du dépôt adipeux à l’aide de pinces et de ciseaux pour retirer le ganglion lymphatique au besoin.

Une fois le ganglion lymphatique retiré, utilisez la pince pour saisir soigneusement l’extrémité du dépôt adipeux la plus proche du point épinglé et commencez à faire de petites incisions au niveau de la membrane conjonctive entre le tissu adipeux et la peau. Soulevez le tissu adipeux de la peau tout en faisant des incisions pour un meilleur accès à la membrane, et placez le dépôt dans un flacon en polyéthylène contenant un tampon HEPES sur de la glace. Pour extraire les dépôts adipeux épididymaux de l’extrémité caudale de la cavité péritonéale, utilisez une pince pour tirer doucement le premier dépôt adipeux épididymaire de l’extrémité dorsale de la souris et localisez l’épididyme et le canal déférent attachés à ce dépôt.

Ensuite, coupez soigneusement entre le dépôt adipeux et l’épididyme et le canal déférent pour séparer le tissu adipeux des autres tissus et placez le dépôt dans un flacon en polyéthylène avec un tampon HEPES sur de la glace. Lorsque tous les tissus ont été prélevés, utilisez une à deux paires de ciseaux pour hacher les échantillons de tissu adipeux en fragments de tissu de 0,5 millimètre. Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de tampon de collagénase de deux milligrammes par millilitre dans les flacons de morceaux de tissu adipeux et placez les flacons dans un incubateur à agitation à 37 degrés Celsius et 150 tours par minute pendant 30 à 45 minutes.

Après 30 minutes, utilisez une pipette d’un millilitre pour triturer les échantillons plusieurs fois. Si les morceaux de tissu sont encore trop gros pour faciliter le pipetage, remettez les échantillons dans l’incubateur pendant 15 minutes supplémentaires. Une fois que les échantillons sont complètement digérés, triturez les fragments 10 fois de plus pour assurer la création d’une suspension à cellule unique et filtrez chaque échantillon à travers des filtres individuels de 70 micromètres dans un tube de 50 millilitres par échantillon.

Rincez chaque lime avec cinq millilitres de tampon FACS pour recueillir toutes les cellules restantes et filtrez chaque lavage dans la fiole appropriée d’échantillon de cellule sur de la glace. Lorsque tous les échantillons ont été filtrés, prélever les cellules par centrifugation et aspirer le surnageant adipocytaire des échantillons. Ensuite, aspirez soigneusement les surnageants en laissant les pastilles de fraction vasculaire stromale intactes et remettez les pastilles en suspension dans un millilitre de tampon FACS par tube.

Transférez ensuite les suspensions dans de nouveaux tubes de 1,5 ou 1,7 millilitre sur de la glace jusqu’à l’analyse cytométrique en flux selon les protocoles standard. La diffusion dynamique de la lumière révèle un diamètre moyen de liposomes de 163,2 nanomètres et un potentiel zêta de moins 19,2 millivolts. L’imagerie cryogénique en microscopie électronique révèle des liposomes circulaires avec un écart-type relativement faible obtenu à partir du diamètre moyen mesuré par diffusion dynamique de la lumière.

L’analyse par cytométrie en flux d’échantillons de souris traitées au PBS peut être utilisée comme un contrôle de fluorescence DiD moins un contrôle avec lequel créer des portes positives au DiD. Comme l’illustre cette analyse représentative, une concentration de 10 milligrammes par millilitre de DiD dans les liposomes est trop élevée, dépassant la plage quantifiable du cytomètre dans les trois tissus testés. Une concentration de 0,1 milligramme par millilitre démontre un certain signal, mais une population claire au-delà des cellules traitées au PBS n’est pas observée.

Par conséquent, la concentration d’un milligramme par millilitre, qui démontre une nette distinction avec le contrôle PBS tout en étant lisible par l’analyseur, est recommandée pour la préparation des liposomes. Des stratégies de contrôle légèrement différentes sont nécessaires pour chaque type de tissu, mais la plupart des mêmes types de cellules peuvent être identifiés dans chacun d’eux. Une fois que des populations d’intérêt spécifiques sont identifiées, la taille totale de chaque population cellulaire et la fréquence à laquelle elles sont positives pour le DiD peuvent être quantifiées.

Il est essentiel de préparer les réactifs et les équipements et d’anticiper les résultats de chaque étape. Des résultats inattendus dès le début peuvent ruiner les résultats futurs. Les méthodes histologiques peuvent être utilisées pour évaluer la localisation des liposomes dans le tissu entier, tandis que la cytométrie en flux d’imagerie peut être utilisée pour vérifier l’internalisation des liposomes sur une base par cellule.