Name: Préparation, administration et évaluation de l’absorption cellulaire in vivo de liposomes marqués par un colorant fluorescent (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Découvrez la préparation de liposomes marqués par fluorescence et leur analyse par cytométrie en flux pour évaluer l'absorption cellulaire in vivo. Cette méthode reproduisible facilite les études en biologie cellulaire et pharmacologie.

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Les auteurs tiennent à remercier Michael Solga et le reste du personnel de base de cytométrie en flux pour avoir fourni une formation et des services en cytométrie en flux. Les auteurs aimeraient également remercier Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye et Prasad Srikakulapu pour leur aide à la préparation des liposomes (SSKD, DKB), aux prélèvements de tissus (MAM, JCG), à la coloration par cytométrie en flux et à l’acquisition d’échantillons (AU, PS, CM). Ce travail a été soutenu par des subventions AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 et R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 et T32 HL007284.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici un protocole en trois parties pour (i) préparer des liposomes marqués avec un colorant lipidique fluorescent et chargés d’un composé antidiabétique, le tesaglitazar, (ii) administrer des liposomes à une souris par injection rétro-orbitale, et (iii) récolter, traiter et colorer les tissus pour détecter l’absorption des liposomes au niveau cellulaire par cytométrie en flux. Ce protocole examine la préparation de liposomes d’environ 150 μm et l’évaluation de l’absorption dans le tissu adipeux, le sang et la rate. La préparation des liposomes est évolutive, réalisée principalement à température ambiante et utilise l’évaporation en phase inverse pour maximiser la charge médicamenteuse et l’élimination des solvants organiques. En utilisant ce protocole, une concentration de tésaglitazar allant jusqu’à 2 mg/mL peut être atteinte dans l’échantillon de liposomes purifiés. Les liposomes préparés peuvent être conservés dans un tampon HEPES à 4 °C pendant plus d’un an. D’après notre expérience, ils ont démontré une variation minimale de la taille moyenne des particules. Moins de 10% de la perte de contenu du médicament a été démontrée par spectrophotométrique, après séparation par ultrafiltration des liposomes du médicament externe avec un filtre centrifuge de 10 kDa.
Lors de la préparation des liposomes, il y a quelques étapes et facteurs critiques à considérer. Tout d’abord, l’ordre des étapes du protocole est important et doit être respecté. Deuxièmement, le pH de la solution utilisée lors du chargement du tésaglitazar doit être maintenu à 7,4 afin de maximiser la solubilité et la charge efficace. Troisièmement, l’assemblage approprié de l’équipement et des filtres garantit que le rendement de chaque étape est de la taille et de la pureté appropriées. Par exemple, si les filtres de 100 et 200 nm ne sont pas assemblés correctement, un lot de liposomes plus hétérogène et mal dimensionné peut en résulter. Quatrièmement, l’élimination complète de l’acétate de Ca-acétate avant la charge médicamenteuse est nécessaire pour maximiser le transfert du tésaglitazar dans les liposomes. Pour tester l’élimination complète de l’acétate de Ca, utilisez la sédimentation à grande vitesse pour éliminer les liposomes, puis mesurez les niveaux d’acétate de Ca-dans la solution non liposomale. Cinquièmement, il est important de peser et d’enregistrer la masse de tous les matériaux ajoutés à la préparation des liposomes à chaque étape. Cela garantit que les concentrations appropriées peuvent être calculées et que les ratios de matériaux nécessaires sont maintenus. Enfin, si la technique n’est pas correctement exécutée, il peut y avoir un niveau indésirable d’hétérogénéité. Il est important de vérifier soigneusement ce paramètre à l’aide de DLS et d’autres approches telles que la microscopie électronique. Pour améliorer l’homogénéité, envisagez d’ajuster la taille du filtre sélectionné ou d’empiler deux filtres.
De plus, il est essentiel que les témoins et un panel d’anticorps pour la cytométrie en flux soient planifiés et optimisés avant d’exécuter ce protocole dans son intégralité (Tableau 1, Tableau 3). Les anticorps doivent être testés pour s’assurer que les concentrations appropriées sont utilisées pour la coloration et que le chevauchement entre les fluorophores est minime. L’excitation et l’émission du colorant utilisé lors de la préparation des liposomes doivent également être prises en compte dans la planification du panel. Dans nos résultats, nous avons utilisé DiD, qui a une excitation et une émission similaires aux fluorophores tels que l’allophycocyanine (APC) et l’AlexaFluor 647. Ainsi, nous n’avons pas sélectionné d’anticorps conjugués à ces fluorophores dans notre panel d’anticorps. De plus, les contrôles d’isotypes ne sont pas inclus dans ce protocole. En effet, les anticorps sélectionnés pour ce protocole sont des anticorps bien validés et disponibles dans le commerce. Cependant, si vous souhaitez utiliser un anticorps qui n’a pas été optimisé auparavant, veuillez envisager de tester l’anticorps contre un témoin d’isotype sur les tissus d’intérêt avant de mener l’expérience complète.
Bien que ce protocole démontre comment extraire et traiter le sang, la rate, le tissu adipeux inguinal et les tissus adipeux épididymaires de la souris après le traitement, cette approche générale peut être appliquée à d’autres tissus. Selon le tissu d’intérêt, les protocoles de traitement et de digestion peuvent devoir être modifiés comme cela est publié pour les tissus suivants: poumon21, foie 22, cavité péritonéale 3, moelle osseuse3,23, cerveau 24.
Une limite importante de cette méthode à considérer est que l’absorption ne peut être évaluée qu’à un seul moment par animal. Ainsi, il peut être avantageux de coupler ce protocole avec d’autres techniques d’imagerie non invasives ou de planifier en conséquence pour assurer des ressources suffisantes pour effectuer l’évaluation. Le moment de l’absorption cellulaire et le renouvellement cellulaire sont des facteurs importants à prendre en compte : les liposomes circuleront dans tout le corps au cours des premières 24 heures et, en fonction de la durée de vie des cellules qui absorbent les liposomes ou de la façon dont elles réagissent à l’absorption, la mort cellulaire ou une phagocytose supplémentaire peut survenir. Notre étude précédente a démontré des changements dans les caractéristiques de la population des populations DiD+ à différents moments3. Pour cette raison, il est important d’évaluer l’adoption à des moments antérieurs ou aux points temporels les plus pertinents pour la biologie du mécanisme d’intérêt. De plus, alors que la quantification de l’absorption cellulaire dans l’ensemble du tissu peut être effectuée avec ce protocole, la cytométrie en flux ne peut pas révéler la localisation tissulaire. Le couplage de cette approche avec des méthodes histologiques peut aider à remédier à cette limitation.
En général, ce protocole complète les méthodologies existantes telles que l’histologie et l’imagerie par fluorescence du corps entier. Avec les progrès continus des outils et des méthodes de cytométrie en flux, le développement de panels plus grands pour des populations cellulaires de plus en plus spécifiques deviendra possible. Nous suggérons que ce protocole soit utilisé en plus des méthodes susmentionnées, car cela améliorera l’évaluation de l’absorption cellulaire et fournira également la possibilité de valider les résultats observés par cytométrie en flux. Par exemple, faut-il constater que la majorité des particules dans le tissu adipeux ont été absorbées par les macrophages par cytométrie en flux. L’immunofluorescence d’une partie aliquote supplémentaire du même tissu adipeux pourrait être sauvegardée, fixée, sectionnée et colorée pour les marqueurs de macrophages afin de vérifier que le type de cellule absorbe bien les liposomes. Cette approche devrait ajouter de la rigueur aux essais de biodistribution des nanoparticules menés : validation du ciblage spécifique des cellules, quantification de l’absorption cellulaire, identification de l’absorption hors cible et, espérons-le, fourniture d’informations pour générer des hypothèses mécanistes pour les résultats thérapeutiques observés. Ce protocole peut également être adapté pour de futures études utilisant différents liposomes, étudiant l’absorption dans d’autres tissus et testant de nouveaux composés dans le contexte de l’obésité et du dysmétabolisme ou de toute autre maladie dans laquelle l’administration de nanoparticules est une option thérapeutique réalisable.

À mesure que l’intérêt pour le développement de thérapies utilisant l’administration de médicaments par nanoparticules augmente, les méthodes de préparation et d’évaluation de la distribution et de l’absorption des particules doivent continuer à progresser, à se développer et à être accessibles au milieu de la recherche 1,2. Ce protocole a été développé pour évaluer les types de cellules exactes qui ont absorbé les liposomes in vivo après un traitement avec des liposomes marqués DiD chargés de tésaglitazar, unagoniste 3,4 du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPAR)-α/γ. Dans ces études, nous avons pu évaluer quels types de cellules étaient directement touchés par le traitement par tésaglitazar liposomal, l’efficacité du ciblage des fractions et générer des hypothèses pour expliquer les résultats du traitement que nous avons observés. De plus, les fonctions biologiques établies dans une variété de types cellulaires suggèrent que les cellules phagocytaires telles que les macrophages, les cellules dendritiques et les cellules de Kupffer spécifiques au foie absorbent la plupart des liposomes 5,6,7. En utilisant ce protocole, nous avons démontré que les phagocytes non classiques pouvaient également absorber les liposomes 3,4.
Ce protocole présente une méthode optimisée pour solubiliser le tesaglitazar, préparer les liposomes par évaporation en phase inverse et utiliser l’acétate de calcium comme attractif pour la charge de médicaments à distance. Les méthodes présentées sont accessibles à de nombreux laboratoires et manquent de matériaux difficiles à acquérir et d’étapes nécessitant des températures élevées. Le protocole produit des liposomes de tailles optimales pour une circulation accrue in vivo8. En outre, comme l’ont résumé Su et coll., à ce jour, des méthodes d’évaluation de la distribution in vivo des liposomes et de l’absorption tissulaire ont été étudiées et testées en profondeur9. Les méthodes de tomographie par émission de positons (TEP), d’imagerie par résonance magnétique (IRM) et de tomographie moléculaire par fluorescence (FMT) sont appliquées pour quantifier la biodistribution et l’absorption spécifiques aux tissus 9,10,11. Bien que ces méthodes aient été optimisées pour maximiser la détection in vivo, elles n’ont toujours pas la capacité de quantifier l’absorption des liposomes in vivo à la résolution cellulaire. Le protocole présenté ici vise à répondre à ce besoin grâce à l’utilisation de la cytométrie en flux. Enfin, pour ce protocole, l’absorption cellulaire a été réduite à quelques tissus, y compris le tissu adipeux. Il existe de plus en plus de littérature sur le potentiel d’utilisation des nanoparticules pour administrer des thérapies dans le contexte de l’obésité, du dysmétabolisme et de l’inflammation 12,13,14,15,16,17. À ce titre, nous avons jugé important de partager un protocole avec des méthodes efficaces de traitement et d’analyse du tissu adipeux, l’un des tissus qui joue un rôle important dans ces pathologies.

<table><tbody><tr><td>Seringue de 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 10 mL</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>aiguille de calibre 25, stérile pour injection rétro-orbitaire</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>aiguille de calibre 27, stérile pour injection rétro-orbitaire</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris B220 BV421</td><td>Biolegend</td><td>103251</td><td>Clone RA3-6B2</td></tr><tr><td>Anti-souris CD115 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1152-82</td><td>Clone AFS98</td></tr><tr><td>Anti-souris CD11b PerCP Cy5.5</td> anticorps <td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>Anti-souris CD11c APC ef780 Anticorps</td><td>eBioscience</td><td>47-0114-82</td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>Anti-souris CD19 PE CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562291</td><td>Clone 1D3</td></tr><tr><td>Anti-souris CD3 FITC</td><td>anticorps BD Biosciences</td><td>553061</td><td>Clone 145-2C11</td></tr><tr><td>Anti-souris CD31 BV605</td><td>Biolegend</td><td>102427</td><td>Clone 390</td></tr><tr><td>Anti-souris CD45 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Anti-souris F4/80 PE Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123114</td><td>Clone BM8</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Gemini Bio-products</td><td>700-107P</td><td></td></tr><tr><td>Desaling spin-column</td><td>ThermoFisher</td><td>89889, 89890</td><td>Colonne de spin Zeba</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Diffusion dynamique de la lumière, Nicomp 370</td><td>Système de granulométrie, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIX & Kit de perméabilisation cellulaire PERM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>GAS004</td><td></td></tr><tr><td>Éponges de gaze</td><td>Dermacea</td><td>441211</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma</td><td>3393-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Extrudeuse de liposomes</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z373400</td><td>LiposoFast</td></tr><tr><td>Live/Dead Aqua</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Lubrifiant ophtalmique</td><td>Optixcare</td><td></td><td>20g/70 oz</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde stérile, 16 % p/v aq. soln., sans méthanol</td><td>Alfa Aesar</td><td>433689L</td><td></td></tr><tr><td>Flacon en polyéthylène pour hacher</td><td>Wheaton</td><td>986701</td><td></td></tr><tr><td>Évaporateur rotatif</td><td>Buchi</td><td>Re111</td><td></td></tr><tr><td>Sonicateur</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>T/Pump Pompe et tampon de thermothérapie</td><td>Gaymer Industries</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesaglitazar</td><td>Tocris</td><td>3965</td><td></td></tr><tr><td>Membranes en polycarbonate gravées sur chenilles</td><td>Thomas Scientific</td><td>1141Z**</td><td>Whatman, Nuclepore Membranes hydrophiles en polycarbonate</td></tr><tr><td>ZetaSizer/DLS-ELS système</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

préparation, administration et évaluation de l’absorption cellulaire in vivo de liposomes marqués par un colorant fluorescent

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Il existe un intérêt croissant pour l’utilisation des liposomes pour délivrer des composés in vivo, en particulier pour les approches de traitement ciblées. Selon la formulation des liposomes, les liposomes peuvent être absorbés préférentiellement par différents types de cellules dans le corps. Cela peut influencer l’efficacité de la particule thérapeutique car la progression de différentes maladies est spécifique au tissu et au type cellulaire. Dans ce protocole, nous présentons une méthode de synthèse et de marquage fluorescent des liposomes à l’aide de DSPC, de cholestérol et de PEG-2000 DSPE et du colorant lipidique DiD en tant que marqueur fluorescent. Ce protocole présente également une approche pour administrer des liposomes in vivo et évaluer l’absorption spécifique des liposomes par cytométrie en flux. Cette approche peut être utilisée pour déterminer les types de cellules qui absorbent les liposomes et quantifier la distribution et la proportion de l’absorption des liposomes entre les types de cellules et les tissus. Bien que cela ne soit pas mentionné dans ce protocole, des tests supplémentaires tels que l’immunofluorescence et l’imagerie par fluorescence unicellulaire sur un cytomètre renforceront les résultats ou les conclusions formulés car ils permettent d’évaluer la coloration intracellulaire. Les protocoles peuvent également devoir être adaptés en fonction du ou des tissus d’intérêt.

Production de liposomes
Les résultats publiés ici sont similaires à ceux de nos travaux précédemment publiés 3,4,20. En utilisant le protocole présenté ici, nous prévoyons de produire des liposomes d’une taille d’environ 150 à 150 nm. Le DLS révèle un diamètre moyen de liposomes de 163,2 nm et un potentiel zêta de -19,2 mV (Figure 1A). L’imagerie par microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) révèle des liposomes circulaires (Figure 1B) et le diagramme DLS révèle un écart type relativement faible par rapport au diamètre moyen (Figure 1C).
La liaison positive aux liposomes nécessite un contrôle traité par PBS
Des études antérieures de notre groupe utilisant ce protocole ont examiné quels sous-ensembles cellulaires dans la SVF adipeuse, la rate et le sang liés aux liposomes après une semaine d’administration in vivo 3,4. À l’aide d’une souris traitée au PBS, les cellules de la cavité péritonéale et de la rate ont été colorées avec le même panel d’anticorps utilisé sur des échantillons de souris traitées par liposomes. Les tissus ont été prélevés après une semaine de traitement (figure 2A). Les échantillons de la souris traitée au PBS ont servi de FMO DiD avec lequel créer des portes DiD positives (Figure 2B,C). Une porte positive peut être créée à l’aide d’un signal DiD-positif, mais les échantillons dépourvus de signal DiD doivent également être utilisés pour vérifier que la porte positive ne comprend pas d’échantillons DiD négatifs.
Des titrages sont nécessaires pour optimiser les signaux de fluorescence
Avant d’exécuter une expérience complète, diverses conditions, y compris la concentration d’anticorps conjugués par fluorescence utilisés lors de la coloration cellulaire et de colorant lipidique utilisé pendant la préparation des liposomes, doivent être optimisées. Les cytomètres de flux ont une limite supérieure de détection pour l’intensité de fluorescence, de sorte que trop de colorant incorporé dans les liposomes conduira à des niveaux non quantifiables de signal DiD dans les échantillons traversant le cytomètre. De plus, trop de DiD dans les liposomes peut entraîner des niveaux élevés de transfert de colorant non spécifique, ce qui pourrait fausser les résultats de l’absorption cellulaire. La figure 3 présente les résultats d’une expérience dans laquelle les concentrations de colorant lipidique ont été titrées pour identifier la concentration qui produirait un signal optimal dans la plage de détection du cytomètre en flux utilisé. Cela a été réalisé sur les tissus d’intérêt pour l’expérience finale: sang (Figure 3A), SVF adipeux inguinal (Figure 3B) et SVF adipeux épididymaire (Figure 3C). Les concentrations sélectionnées pour les tests étaient de 10 mg de DiD (élevé, rouge), 1 mg de DiD (moyen, bleu) ou 0,1 mg de DiD (faible, gris) par 1 mL de liposomes. La concentration la plus élevée utilisée dans les liposomes était trop élevée et dépassait la plage quantifiable du cytomètre dans les trois tissus (Figure 3A\u2012C, rouge). La concentration la plus faible de DiD a montré un certain signal (Figure 3 A\u2012C, gris), mais une population claire au-delà des cellules traitées par PBS (Figure 3 A\u2012C, noir) n’a pas été observée. Lorsqu’elle a été quantifiée, la moyenne arithmétique de l’IFM DiD pour chaque tissu et concentration a démontré une distinction claire entre les témoins PBS et la concentration moyenne de DiD (Figure 3D). Ainsi, comme indiqué dans le protocole, nous avons sélectionné la concentration moyenne (Figure 3, bleu) à utiliser dans notre préparation de liposomes.
L’utilisation d’un panel multi-anticorps permet d’identifier l’absorption des liposomes par différents sous-ensembles cellulaires
À l’aide du panel décrit dans le tableau 3, les cellules ont été colorées avec des anticorps contre les marqueurs des macrophages A, des cellules B, des cellules T, des cellules dendritiques, des monocytes et des cellules endothéliales (Figure 4). Des stratégies de déclenchement légèrement différentes sont nécessaires pour chaque type de tissu, mais la plupart des mêmes types de cellules peuvent être identifiés dans chacun. Certaines exceptions comprennent les cellules endothéliales, qui ne se trouvent normalement pas dans le sang, et les monocytes, qui sont généralement à une fréquence plus élevée dans le sang que les autres tissus. Une fois les populations identifiées, la taille totale de chaque population cellulaire et la fréquence à laquelle elles sont DiD+ peuvent être quantifiées. D’autres calculs peuvent être effectués pour caractériser la population DiD+ : quel pourcentage de cellules DiD+ sont des macrophages, des cellules endothéliales, etc. Veuillez noter qu’il s’agit d’exemples de stratégies de contrôle, mais ce n’est pas la seule façon d’analyser les échantillons. L’analyse sera dictée par le panel sélectionné et le(s) cytomètre(s) de flux disponible(s).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> Figure 1 : Exemples de caractéristiques des liposomes préparés. (A) La taille et le potentiel zêta ont été mesurés comme décrit ci-dessus et ont été présentés sous forme de tableau. Chaque paramètre est présenté comme la moyenne ± l’écart-type. (B) Cryo-EM a été utilisé pour imager les liposomes préparés. La barre d’échelle blanche mesure 50 nm de longueur. (C) DLS a été utilisé pour générer un histogramme du diamètre des liposomes dans cette préparation. Cette figure est adaptée d’Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> Figure 2 : Coloration DiD représentative de souris traitées au PBS ou aux liposomes. (A) Schéma expérimental pour les traitements PBS et liposomes. PBS ou liposomes ont été injectés trois fois au cours d’une semaine. Les tissus ont été prélevés le jour 8 du traitement. (B, C) Des diagrammes de flux représentatifs révèlent une coloration positive au DiD chez les souris traitées par liposomes (C), mais pas par PBS (B). FSC, diffusion vers l’avant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> Figure 3 : Titrage de DiD dans les liposomes. Les liposomes ont été préparés avec trois concentrations différentes de DiD et injectés à des souris. Le gris indique la faible concentration à 0,1 mg DiD par 1 mL de liposomes, le bleu indique la concentration moyenne à 1 mg DiD/mL de liposomes et le rouge indique la concentration élevée à 10 mg DiD/mL de liposomes. Une souris traitée par PBS a été utilisée comme témoin négatif (noire). Le sang (A, cercle), l’adipeux inguinal (B, triange) et l’adipeux épididymaire (C, carré) ont été prélevés 24 heures après l’injection et traités pour isoler une suspension unicellulaire. Ces échantillons ont été exécutés sur un cytomètre en flux au niveau de DiD détectable. Des histogrammes spécifiques aux tissus avec des superpositions de chaque groupe de traitement sont présentés pour démontrer l’intensité de fluorescence par concentration (A\u2012C). La moyenne arithmétique de DiD a également été quantifiée pour chaque tissu et concentration et tracée (D). SSC = dispersion latérale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> Figure 4 : Analyse par cytométrie en flux représentative de sous-ensembles cellulaires dans la SVF adipeuse, le sang et la rate. (A\u2012C) Schéma représentatif de la stratégie de déclenchement pour identifier les sous-ensembles cellulaires et les cellules DiD+ dans le SVF adipeux (A), la rate (B) et le sang (C). Abréviations : FSC = diffusion vers l’avant; LD = vivant/mort; L-DCs = cellules dendritiques lymphoïdes; M-DCs = cellules dendritiques myéloïdes; SSC = dispersion latérale. Cette figure est adaptée d’Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Contrôle</td>
			<td>But</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Souris traitée avec PBS ou solution saline</td>
			<td>Utilisez les cellules de cette souris pour les contrôles de cytométrie en flux suivants :</td>
		</tr><tr><td>1. Cellules non colorées</td>
		</tr><tr><td>2. Tache unique vivante / morte</td>
		</tr><tr><td>3. Cellules colorées avec le panneau complet, mais dépourvues de fluorescence liposomique pour déterminer le signal liposomique positif pendant l’analyse</td>
		</tr><tr><td>Cette / ces souris / souris seront également utilisées pour déterminer si les liposomes ont des effets in vivo, car vous aurez un contrôle non liposomique dans votre expérience.</td>
		</tr><tr><td>Liposomes déchargés</td>
			<td>Si vous chargez un composé dans vos liposomes, une partie de votre lot de liposomes doit être synthétisée sans le composé. Cela explique tous les effets in vivo des liposomes seuls.</td>
		</tr><tr><td>DiD seul</td>
			<td>Étant donné que le DiD peut également être absorbé par les membranes cellulaires, l’allocation de certaines souris pour recevoir un colorant libre à une quantité égale à celle trouvée dans les liposomes aidera à tenir compte de toute coloration de la membrane de fond.</td>
		</tr><tr><td>Contrôles de fluorescence moins un (FMO)</td>
			<td>Ce sont des cellules colorées avec tous les anticorps de votre panel sauf un. Comme #3 dans l’encadré ci-dessus, cela aide à déterminer le véritable signal positif pour cet anticorps pendant l’analyse</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Contrôles à utiliser dans ce protocole.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Solution</td>
			<td>Composants</td>
			<td>Volume approximatif nécessaire par lot/souris</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Préparation des liposomes</td>
		</tr><tr><td>Acétate de calcium</td>
			<td>1 M acétate de calcium dansH2O</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampon HEPES</td>
			<td>10 mM HEPES enH2O, pH 7,4</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>Tesaglitazar dans HEPES</td>
			<td>en 10 mM HEPES</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Récolte, traitement et coloration des tissus</td>
		</tr><tr><td>Solution tamponnée au phosphate (PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mMNa2HPO4, 1,8 mM KH 2PO4 dansH2Odistillé</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr><tr><td>PBS-Héparine</td>
			<td>0,1 mM d’héparine dans PBS</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampon HEPES</td>
			<td>20 mM HEPES dans PBS</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampon de digestion</td>
			<td>2 mg/mL de collagénase de type I dans le tampon HEPES</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampon de lyse AKC</td>
			<td>0,158 MNH3Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mMNa2 EDTA dansddH2O, pH 7,2</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampon FACS</td>
			<td>1% BSA, 0,05% NaN3 dans PBS</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr><tr><td>Bloc Fc (dilué)</td>
			<td>Bloc 1:50 Fc dans le tampon FACS</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>Tampon de fixation</td>
			<td>2% de paraformaldéhyde dans le PBS</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Solutions à préparer.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Un</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Coloration extracellulaire (2x mélange d’anticorps)</td>
		</tr><tr><td>Antigène</td>
			<td>Fluorophore</td>
			<td>Volume Ab par test de 100 μL</td>
			<td>Volume total nécessaire :</td>
		</tr><tr><td>CD45</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>Colonne C x 1,2 x # total d’échantillons</td>
		</tr><tr><td>CD11b</td>
			<td>PerCP Cy5.5</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,5 μL/essai) x (1,2) x (# échantillons)</td>
		</tr><tr><td>F4/80</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,25 μL/essai) x (1,2) x (# échantillons)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0,25 μL/essai) x (1,2) x (# échantillons)</td>
		</tr><tr><td>CD3</td>
			<td>FITC</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1,0 μL/essai) x (1,2) x (# échantillons)</td>
		</tr><tr><td>DC31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>etc...</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>DC115</td>
			<td>PE</td>
			<td>1,5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Pour créer votre mélange d’anticorps, combinez les anticorps calculés dans la colonne D avec le tampon FACS ou le tampon de coloration violet brillant* jusqu’à un volume final de (50 μL x 1,2 x # échantillons totaux)</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Taches vivantes/mortes (1x)</td>
		</tr><tr><td>Vivant/Mort</td>
			<td>Fluorophore</td>
			<td>Volume L/D par essai de 200 uL</td>
			<td>Volume total nécessaire :</td>
		</tr><tr><td>Vivant/Mort</td>
			<td>Aqua</td>
			<td>0,67 μL</td>
			<td>Colonne C x 1,2 x # total d’échantillons</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Coloration intracellulaire (1x)</td>
		</tr><tr><td>Antigène</td>
			<td>Fluorophore</td>
			<td>Volume Ab par test de 50 μL</td>
			<td>Volume total nécessaire :</td>
		</tr><tr><td>αSMA</td>
			<td>FITC</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Colonne C x 1,2 x # total d’échantillons</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*Un tampon de coloration violette brillante doit être utilisé si plus d’un anticorps conjugué à un fluorophore violet brillant est utilisé dans votre panel.</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 3 : Exemple de panel d’anticorps et calculs des mélanges de coloration à utiliser pour la coloration en flux.

L’objectif de ce protocole est de synthétiser des liposomes marqués par fluorescence et d’utiliser la cytométrie en flux pour identifier la localisation in vivo des liposomes au niveau cellulaire.

Préparation, administration et évaluation de l’absorption cellulaire in vivo de liposomes marqués par un colorant fluorescent

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

Notre protocole associe une méthode accessible de préparation de liposomes chargés de tesaglitazar à une approche approfondie pour évaluer l’absorption des liposomes au niveau cellulaire. Cette technique fournit une méthode impartiale pour évaluer l’absorption de liposomes marqués par fluorescence qui sont préparés à l’aide d’un équipement à basse température et facile à acquérir. Pour préparer des liposomes marqués par fluorescence chargés d’acétate de calcium et de tesaglitazar, utilisez d’abord une sonde d’un demi-pouce pour émulsionner une solution d’éther chloroforme de lipides par sonication pendant 30 secondes à température ambiante, 20 kilohertz et 50 % de puissance.Transférez immédiatement la solution d’émulsion d’eau et d’huile homogénéisée dans un évaporateur rotatif doté d’un adaptateur spécial, d’un manomètre nanométrique et d’une soupape régulatrice de pression et connectez l’évaporateur à une conduite de vide. Pour éliminer les solvants organiques, réglez la vitesse de rotation sur 100 tours par minute et le vide sur 0,5 atmosphère. Une fois qu’un gel s’est formé et a disparu, augmentez le vide à 0,9 atmosphère et filtrez la dispersion aqueuse des liposomes d’avant en arrière à travers un filtre en polycarbonate de 200 nanomètres dans une extrudeuse de liposomes équipée de deux seringues étanches aux gaz à plusieurs reprises.Après avoir vérifié la distribution granulométrique par diffusion dynamique de la lumière, utilisez une colonne de spin de deux millilitres pour éliminer tout tesaglitazar non piégé des liposomes et utilisez un spectrophotomètre pour déterminer la concentration de médicament piégée. Ensuite, n’ajoutez pas plus de 500 microlitres d’échantillon de liposomes dans le lit de gel de la colonne sèche. Pour administrer les liposomes par injection rétro-orbitaire, appuyez doucement sur la peau au-dessus et en dessous de l’œil exposé pour soulever l’œil au-dessus du plan du visage.Ensuite, insérez soigneusement la pointe de l’aiguille dans le coin avant de l’œil, en vous assurant que l’aiguille se trouve sous l’orbe sans le toucher, et injectez lentement les liposomes dans l’espace rétro-orbitaire. Pour prélever l’échantillon de sang, au point final expérimental approprié, faites soigneusement une incision dans la peau au bord de l’extrémité caudale de la cage thoracique de la souris et coupez une ligne droite d’un centimètre vers la tête de l’animal jusqu’à ce que les muscles pectoraux soient exposés. Au site d’incision initial, faites deux petites incisions perpendiculaires à la ligne vers la tête et coupez soigneusement le muscle pectoral d’un côté de la cage thoracique dans la zone exposée pour permettre un meilleur accès et une meilleure visualisation du site d’insertion de l’aiguille.Insérez l’aiguille entre la troisième et la quatrième côte en la maintenant aussi près que possible de la ligne médiane de la cage thoracique, et tirez doucement sur la seringue pour commencer à recueillir le sang. Lorsque le plus grand volume possible a été collecté, transférez le sang dans un microtube de centrifugation contenant 10 microlitres d’EDTA de 0,5 molaire sur glace. Pour extraire le coussinet post-tissulaire inguinal de chaque côté de la souris, utilisez une paire de pinces pour maintenir la membrane péritonéale sur le côté droit et la deuxième paire de pinces pour maintenir le bord de la peau au-dessus de la membrane péritonéale sur l’autre.Retirez doucement la peau de la membrane pour séparer les couches les unes des autres. Épinglez le bord externe de la peau pour mieux accéder au dépôt adipeux et localisez le dépôt de tissu adipeux inguinal le long de la peau. Et localisez le ganglion lymphatique inguinal au centre du dépôt adipeux à l’aide de pinces et de ciseaux pour retirer le ganglion lymphatique au besoin.Une fois le ganglion lymphatique retiré, utilisez la pince pour saisir soigneusement l’extrémité du dépôt adipeux la plus proche du point épinglé et commencez à faire de petites incisions au niveau de la membrane conjonctive entre le tissu adipeux et la peau. Soulevez le tissu adipeux de la peau tout en faisant des incisions pour un meilleur accès à la membrane, et placez le dépôt dans un flacon en polyéthylène contenant un tampon HEPES sur de la glace. Pour extraire les dépôts adipeux épididymaux de l’extrémité caudale de la cavité péritonéale, utilisez une pince pour tirer doucement le premier dépôt adipeux épididymaire de l’extrémité dorsale de la souris et localisez l’épididyme et le canal déférent attachés à ce dépôt.Ensuite, coupez soigneusement entre le dépôt adipeux et l’épididyme et le canal déférent pour séparer le tissu adipeux des autres tissus et placez le dépôt dans un flacon en polyéthylène avec un tampon HEPES sur de la glace. Lorsque tous les tissus ont été prélevés, utilisez une à deux paires de ciseaux pour hacher les échantillons de tissu adipeux en fragments de tissu de 0,5 millimètre. Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de tampon de collagénase de deux milligrammes par millilitre dans les flacons de morceaux de tissu adipeux et placez les flacons dans un incubateur à agitation à 37 degrés Celsius et 150 tours par minute pendant 30 à 45 minutes.Après 30 minutes, utilisez une pipette d’un millilitre pour triturer les échantillons plusieurs fois. Si les morceaux de tissu sont encore trop gros pour faciliter le pipetage, remettez les échantillons dans l’incubateur pendant 15 minutes supplémentaires. Une fois que les échantillons sont complètement digérés, triturez les fragments 10 fois de plus pour assurer la création d’une suspension à cellule unique et filtrez chaque échantillon à travers des filtres individuels de 70 micromètres dans un tube de 50 millilitres par échantillon.Rincez chaque lime avec cinq millilitres de tampon FACS pour recueillir toutes les cellules restantes et filtrez chaque lavage dans la fiole appropriée d’échantillon de cellule sur de la glace. Lorsque tous les échantillons ont été filtrés, prélever les cellules par centrifugation et aspirer le surnageant adipocytaire des échantillons. Ensuite, aspirez soigneusement les surnageants en laissant les pastilles de fraction vasculaire stromale intactes et remettez les pastilles en suspension dans un millilitre de tampon FACS par tube.Transférez ensuite les suspensions dans de nouveaux tubes de 1,5 ou 1,7 millilitre sur de la glace jusqu’à l’analyse cytométrique en flux selon les protocoles standard. La diffusion dynamique de la lumière révèle un diamètre moyen de liposomes de 163,2 nanomètres et un potentiel zêta de moins 19,2 millivolts. L’imagerie cryogénique en microscopie électronique révèle des liposomes circulaires avec un écart-type relativement faible obtenu à partir du diamètre moyen mesuré par diffusion dynamique de la lumière.L’analyse par cytométrie en flux d’échantillons de souris traitées au PBS peut être utilisée comme un contrôle de fluorescence DiD moins un contrôle avec lequel créer des portes positives au DiD. Comme l’illustre cette analyse représentative, une concentration de 10 milligrammes par millilitre de DiD dans les liposomes est trop élevée, dépassant la plage quantifiable du cytomètre dans les trois tissus testés. Une concentration de 0,1 milligramme par millilitre démontre un certain signal, mais une population claire au-delà des cellules traitées au PBS n’est pas observée.Par conséquent, la concentration d’un milligramme par millilitre, qui démontre une nette distinction avec le contrôle PBS tout en étant lisible par l’analyseur, est recommandée pour la préparation des liposomes. Des stratégies de contrôle légèrement différentes sont nécessaires pour chaque type de tissu, mais la plupart des mêmes types de cellules peuvent être identifiés dans chacun d’eux. Une fois que des populations d’intérêt spécifiques sont identifiées, la taille totale de chaque population cellulaire et la fréquence à laquelle elles sont positives pour le DiD peuvent être quantifiées.Il est essentiel de préparer les réactifs et les équipements et d’anticiper les résultats de chaque étape. Des résultats inattendus dès le début peuvent ruiner les résultats futurs. Les méthodes histologiques peuvent être utilisées pour évaluer la localisation des liposomes dans le tissu entier, tandis que la cytométrie en flux d’imagerie peut être utilisée pour vérifier l’internalisation des liposomes sur une base par cellule.

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