Name: Photoimmunothérapie proche infrarouge pour des modèles murins de dissémination pleurale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Découvrez la photoimmunothérapie proche infrarouge pour évaluer les effets antitumoraux sur des modèles murins de dissémination pleurale. Cette méthode utilise l'imagerie de bioluminescence pour surveiller les résultats thérapeutiques en temps réel.

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Toutes les expériences in vivo ont été réalisées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des ressources des animaux de laboratoire du Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Nagoya (approbation #2017-29438, #2018-30096, #2019-31234, #2020-20104). Des souris nues homozygotes homozygotes âgées de six semaines ont été achetées et entretenues au Centre animalier de l’Université de Nagoya. Lors de la réalisation de la procédure chez la souris, ils ont été anesthésiés avec de l’isoflurane (introduction: 4-5%, entretien 2-3%); la patte a été pressée avec une pince à épiler pour confirmer la profondeur de l’anesthésie.
1. Conjugaison de l’IR700 avec mAb
<ol><li>Incuber le mAb (1 mg, 6,8 nmol) avec l’ester IR700 NHS (66,8 mg, 34,2 nmol, 5 mmol/L dans le DMSO) dans 0,1 mol/L Na2HPO4 (pH 8,6) à 15-25 °C pendant 1 h.</li>
	<li>Purifier le mélange à l’aide d’une colonne (p. ex. Sephadex). Préparez et lavez la colonne avec PBS. Ensuite, appliquez le mélange sur la colonne et collectez la goutte, qui contient l’anticorps conjugué IR700 purifié. Cet anticorps conjugué IR700 est appelé conjugué photosensibilisateur d’anticorps (APC).</li>
	<li>Mesurez la concentration de protéines et d’IR700 dans l’APC.<ol>
<li>Préparez des courbes d’étalonnage pour les protéines et l’IR700 à l’aide d’un spectrophotomètre.</li>
		<li>Mélanger les concentrations standard d’albumine avec un kit de dosage des protéines en suivant le protocole du kit (voir Table des matériaux,coloration protéique Coomassie Brilliant Blue (CBB)). Mesurez l’absorbance de l’albumine à une longueur d’onde de 595 nm et tracez la courbe d’étalonnage (une formule d’approximation linéaire) de la protéine à l’aide de l’équation suivante : y = ax + b (x : concentration, y : absorbance).</li>
		<li>Obtenez des courbes d’étalonnage pour IR700 avec absorption à 690 nm en utilisant la même procédure. La concentration standard d’IR700 est recommandée à 0,1-5 μM (0,1954-9,77 μg/mL).</li>
		<li>Mesurer la concentration en protéines et la concentration en IR700 dans l’APC à l’aide d’une courbe d’étalonnage [x = (y-b)/a (x : concentration, y : absorbance)].</li>
		<li>Déterminer le nombre de colorants IR700 liés par mAb avec les résultats de la concentration molaire. REMARQUE: Il est important de déterminer le nombre optimal de conjugaison des molécules IR700 par molécule mAb. Généralement, environ trois molécules IR700 liées sur une seule molécule mAb seraient efficaces à la fois in vitro et in vivo. De nombreux IR700 liés par anticorps (par exemple, six) facilitent le piégeage dans le foie lors d’expériences in vivo. Le rapport entre les anticorps liés à l’IR700 était de l’ordre de 1:2-1:4. La proportion d’IR700 a été réduite, si nécessaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer une électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) comme confirmation de la formation d’un APC. Imagez le gel à 700 nm à l’aide d’un imageur fluorescent et colorez la protéine dans le gel à l’aide d’un kit de coloration protéique en suivant le protocole du kit (voir Table des matériaux,coloration des protéines CBB).</li>
</ol>2. Génération d’un modèle de dissémination pleurale
<ol><li>Préparer des cellules cibles exprimant la luciférase et suspendre 1,0 ×10 6 cellules cibles dans 100 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) REMARQUE: Les cellules cancéreuses intrathoraciques telles que le cancer du poumon et la MPM conviennent comme cellules cibles. Les cellules exprimant la luciférase ont été préparées par transfection du gène de la luciférase, et une expression élevée de la luciférase a été confirmée après > 10 passages cellulaires. Les cellules ont été cultivées dans un milieu supplémenté de sérum bovin fœtal à 10 % et de pénicilline (100 UI/mL) et de streptomycine (100 mg/mL). Le nombre de cellules a été ajusté en fonction du taux de croissance tumorale et du déroulement du traitement (1,0. × 105-6,0 × 106 cellules / poids corporel).</li>
	<li>Préparez des souris nues homozygotes femelles de 8 à 12 semaines, avec un poids corporel préférable de 19 à 21 g.</li>
	<li>Anesthésier les souris pendant la procédure avec de l’isoflurane (introduction: 4-5%, entretien 2-3%); appuyez sur la queue avec une pince à épiler pour confirmer qu’il n’y a pas de réaction.</li>
	<li>Faites un bouchon avec de la mousse de polystyrène et fixez le bouchon à l’aiguille de 30 G de sorte que la pointe reste à 5 mm pour éviter les lésions pulmonaires. Pliez l’extrémité de l’aiguille avec une pince propre ou en la pressant contre un objet dur nettoyé à 70% d’EtOH pour éviter le pneumothorax (Figure 1). ATTENTION : Attention à ne pas vous percer. Utilisez une pince pour plier l’aiguille. Ne tenez pas le bouchon lorsque vous l’attachez à l’aiguille. Il est plus sûr de coller le bouchon avant de remplir les cellules dans la seringue.</li>
	<li>Remplissez une seringue (1 mL) avec des cellules cibles et fixez une aiguille 30G avec un bouchon.</li>
	<li>Désinfectez la poitrine de l’animal avec 70% d’EtOH avant la procédure.</li>
	<li>Percez une aiguille dans la poitrine de la souris à travers l’espace intercostal. En raison de la résistance lors de la frappe contre les côtes à ce moment-là, la pointe de l’aiguille se déplaçait de haut en bas. Après avoir traversé l’espace intercostal, appuyez la seringue contre la souris et injectez 100 μL de cellules cibles (Figure 2). REMARQUE: La souris respire profondément lorsque l’aiguille pénètre correctement dans la cavité thoracique. Avec la flexion de la pointe de l’aiguille, le pneumothorax et l’injection inappropriée de cellules dans le poumon pourraient être évités. REMARQUE: La ponction de la paroi thoracique droite est recommandée pour éviter le risque de ponction de la paroi cardiaque.</li>
	<li>Roulez la souris 2-3 fois pour répartir les cellules dans toute la cavité thoracique.</li>
	<li>Rebez la souris dans une cage propre et chaude et surveillez jusqu’à ce qu’elle soit ambulatoire. Après la procédure, la souris se réveillera de l’anesthésie et se comportera normalement.</li>
</ol>3. Mesure de la bioluminescence
REMARQUE : Le logiciel utilisé pour l’acquisition de données est répertorié dans la Table des matériaux.
<ol><li>Pour confirmer la génération du modèle de dissémination pleurale, évaluez les images de bioluminescence tous les jours après l’injection des cellules dans la cavité thoracique.</li>
	<li>Anesthésier les souris (étape 2.3) et injecter par voie intrapéritonéale de la D-luciférine (15 mg/mL, 200 μL).</li>
	<li>Assurez-vous que la souris respire normalement avant et après l’imagerie. Utilisez un appareil de chauffage si nécessaire pour prévenir l’hypothermie pendant l’anesthésie.</li>
	<li>Dix minutes après l’injection, placez la souris dans l’équipement de mesure d’imagerie par bioluminescence (BLI). Pour l’acquisition d’images, ouvrez le Panneau de configuration d’acquisition du logiciel. Sélectionnez Luminescent, Photographieet Superposition (Figure 3).</li>
	<li>Définissez le temps d’exposition sur Auto. Définissez Binning comme petit.</li>
	<li>Réglez f/stop sur 1 pour luminescent et 8 pour la photographie; f/stop contrôle la quantité de lumière reçue par le détecteur de dispositif à couplage chargé.</li>
	<li>Définissez le champ de vision sur C.</li>
	<li>Une fois que l’échantillon de souris est prêt pour l’imagerie, cliquez sur Acquérir pour l’acquisition d’images. Des souris ayant une activité suffisante de la luciférase ont été sélectionnées pour d’autres études. REMARQUE: Un modèle de dissémination pleurale approprié montre une forte luminescence sur le site diffus dans la poitrine lorsqu’il est vu du côté ventral. Si les images BLI ne sont pas diffusées dans le thorax, et seulement au site d’injection, la tumeur peut être transplantée par voie sous-cutanée.</li>
	<li>Après avoir affiché l’image, définissez le format d’affichage sur Radiance. Ouvrez le panneau Palette d’outils (Figure 4A).</li>
	<li>Sélectionnez Outils de retour sur investissement. Nous vous recommandons d’utiliser le Cercle pour varier la zone bioluminescente sur les images.</li>
	<li>Cliquez sur Mesurer le retour sur investissement pour mesurer l’intensité bioluminescente de la surface ( Figure4B).</li>
	<li>Utilisez Configurer la mesure dans le coin gauche du panneau de mesure du retour sur investissement pour sélectionner les valeurs/informations nécessaires. Exportez cette table de données en tant que fichier .csv (Figure 4C).</li>
	<li>Utilisez les valeurs de Flux total (p/s) comme quantification de l’intensité bioluminescente dans le fichier .csv.</li>
</ol>4. Tomographie par imagerie par luminescence diffuse (DLIT)
REMARQUE : Le logiciel utilisé pour l’acquisition de données est répertorié dans la Table des matériaux.
<ol><li>Activez le bouton X-ray Armed ( Armed (Armée de rayons X).</li>
	<li>Anesthésier les souris (étape 2.3), puis injecter de la D-luciférine (15 mg/mL, 200 μL) par voie intrapéritonéale chez les souris. Pour filmer DLIT en continu de 3,2 à 3,7, ignorez cette étape.</li>
	<li>Dix minutes après l’injection, placez la souris dans l’équipement BLI.</li>
	<li>Ouvrez le Panneau de configuration d’acquisition du logiciel. Sélectionnez Luminescent, Photographie, CT, Souris Standard-Oneet Superposition. Les autres paramètres étaient les mêmes que dans les 3.4-3.6(Figure 5A).</li>
	<li>Sélectionnez l’Assistant Imagerie dans le Panneau de configuration d’acquisition.</li>
	<li>Sélectionnez Bioluminescence, puis DLIT (Figure 5B).</li>
	<li>Sélectionnez Firefly comme longueur d’onde à mesurer (Figure 5C).</li>
	<li>Définissez le sujet d’imagerie comme souris, les paramètres d’exposition comme paramètres automatiques, le champ de vision sur C-13,4 cmet la hauteur du sujet sur 1,5 cm ( Figure5D).</li>
	<li>Poussez les rayons X seront produits lorsqu’ils seront sous tension. Acquérir.</li>
	<li>Ouvrez les données d’image séquentielle CT.</li>
	<li>Ouvrez Topographie de surface dans la palette d’outils. Sélectionnez Afficher (Figure 6A).</li>
	<li>Ajustez le seuil car l’écran violet affiche uniquement la surface du corps (Figure 6B). Ensuite, sélectionnez la souris Nue de l’objet et cliquez sur générer la surface. Assurez-vous que le contour de la souris est dessiné avec précision (Figure 6C).</li>
	<li>Ouvrez l’onglet Palette d’outils, Propriétés de reconstruction 3D DLIT. Sélectionnez Propriétés tissulaires comme Tissu de souris et Spectre source comme Firefly (Figure 6D). Ensuite, ouvrez l’onglet Analyser et confirmez les données pour chaque donnée de longueur d’onde sélectionnée. Enfin, cliquez sur le bouton Reconstruire (Figure 6E).</li>
	<li>Confirmez la présence de BLI dans la cavité thoracique dans l’image DLIT configurée.</li>
</ol>5. NIR-PIT pour le modèle de dissémination pleurale in vivo
<ol><li>Mesurez la dose lumineuse du laser de longueur d’onde (NIR) de 690 nm avec un capteur de puissance et ajustez la sortie à 100 mW/cm2. REMARQUE: La lumière laser est cohérente avec une taille de bobine précise; ainsi, l’énergie lumineuse ne change guère quelle que soit la distance à moins de 50 cm. S’il y a beaucoup d’événements indésirables, tels que des brûlures, réduire la puissance dans la plage de 40 mW/cm2.</li>
	<li>Nettoyez la queue avec 70% d’EtOH et injectez par voie intraveineuse DE l’APC (100 μg) via la veine caudale 24 h avant l’irradiation NIR. Appliquer une pression sur le site d’injection pour contrôler les saignements. REMARQUE: Réglez le volume de l’APC à 50-200 μL pour l’injection.</li>
	<li>Anesthésiez les souris (étape 2.3) et posez-les sur le dos. Pour éviter l’irradiation NIR vers le site non cible, protégez les autres sites avec du papier d’aluminium(Figure 7A). Irradier à la lumière NIR avec un laserde 100 J/cm2 ; si la tumeur est disséminée vers le ventre, la dose d’irradiation NIR-lumière pourrait être divisée en plusieurs directions (Figure 7B). REMARQUE: Ajuster la dose à 30-150 J / cm2 en fonction des résultats in vitro et des événements indésirables tels que les brûlures.</li>
	<li>Lorsque l’irradiation NIR est terminée et que la souris est éveillée, retournez-la dans la cage.</li>
	<li>Observez le BLI et mesurez le retour sur investissement dans le temps (tous les jours) (voir 3.2-3.12).</li>
	<li>Pour l’imagerie ex vivo, euthanasier les souris avec du dioxyde de carbone 24 h après l’injection d’APC, immédiatement avant l’irradiation NIR.<ol>
<li>Pour observer l’intérieur de la poitrine de la souris, retirez le thorax et coupez les côtes et le sternum. Capturez l’image de fluorescence (700 nm) à côté du contrôle sans administration APC. Ensuite, appliquez la D-luciférine (150 μg/mL) sur le thorax exposé, et le BLI a été prélevé (voir 3.2-3.7).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Nagaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+using+a+fiber+optic+diffuser+for+treating+peritoneal+gastric+cancer+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Gastric+Cancer%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for treating peritoneal gastric cancer dissemination.</a> Gastric Cancer. 22, 463-472 (2019).</li>
<li>Nagaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+near+infrared+photoimmunotherapy+using+a+fiber+optic+diffuser+for+peritoneal+dissemination+of+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Endoscopic near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for peritoneal dissemination of gastric cancer.</a> Cancer Science. 109, 1902-1908 (2018).</li>
<li>Harada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+photoimmunotherapy+with+galactosyl+serum+albumin+in+a+model+of+diffuse+peritoneal+disseminated+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Near-infrared photoimmunotherapy with galactosyl serum albumin in a model of diffuse peritoneal disseminated ovarian cancer.</a> Oncotarget. 7, 79408-79416 (2016).</li>
<li>Journals, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNCI+Journal+of+the+National+Cancer+Institute+Way+to+Better+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">JNCI Journal of the National Cancer Institute Way to Better DNA.</a> Annals of Internal Medicine. 37, 1-9 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Dans cette étude, nous avons démontré une méthode pour mesurer l’effet thérapeutique du NIR-PIT sur le modèle de dissémination pleurale de la MPM. La destruction cellulaire hautement sélective a été réalisée avec NIR-PIT; ainsi, le tissu normal était à peine endommagé23,24,25. Avec ce type de destruction sélective des cellules, NIR-PIT s’est avéré sûr dans les modèles disséminés...

Le cancer reste l’une des principales causes de mortalité malgré des décennies de recherche. L’une des raisons est que la radiothérapie et la chimiothérapie sont des techniques hautement invasives, ce qui peut limiter leurs avantages thérapeutiques. Les thérapies cellulaires ou moléculaires ciblées, qui sont des techniques moins invasives, font l’objet d’une attention accrue. La photoimmunothérapie est une méthode de traitement qui améliore synergiquement l’effet thérapeutique en combinant immunothérapie et photothérapie. L’immunothérapie renforce l’immunité tumorale en augmentant l’immunogénicité du microenvironnement tumoral et en réduisant la suppression immunorégulatrice, entraînant la destruction des tumeurs dans le corps. La photothérapie détruit les tumeurs primaires avec une combinaison de photosensibilisateurs et de rayons lumineux, et les antigènes spécifiques de la tumeur libérés par les cellules tumorales renforcent l’immunité tumorale. Les tumeurs peuvent être traitées sélectivement à l’aide de photosensibilisants car elles sont spécifiques et sélectives pour les cellules cibles. La modalité de la photothérapie comprend la thérapie photodynamique (PDT), la thérapie photothermique (PTT) et les thérapies basées sur la photochimie1.
La photoimmunothérapie proche infrarouge (NIR-PIT) est une méthode de photothérapie antitumorale récemment développée qui combine une thérapie photochimique et une immunothérapie1,2. NIR-PIT est une thérapie moléculairement ciblée qui cible des molécules spécifiques de surface cellulaire par la conjugaison d’un colorant phtalocyanine de silicium proche infrarouge, IRdye 700DX (IR700), à un anticorps monoclonal (mAb). La membrane cellulaire de la cellule cible est détruite lors de l’irradiation avec une lumière NIR (690 nm)3.
Le concept d’utilisation de la luminothérapie ciblée en combinant des photosensibilisants conventionnels et des anticorps ou une PDT ciblée est vieux de plus de trois décennies4,5. Des études antérieures ont tenté de cibler les agents PDT conventionnels en les conjuquant à des anticorps. Cependant, le succès a été limité car ces conjugués ont été piégés dans le foie, en raison de l’hydrophobicité des photosensibilisants6,7. De plus, le mécanisme du NIR-PIT est complètement différent de celui du PDT conventionnel. Les photosensibilisants conventionnels génèrent un stress oxydatif qui résulte d’une conversion d’énergie qui absorbe l’énergie lumineuse, se disloque à un état excité, passe à l’état de base et provoque l’apoptose. Cependant, NIR-PIT provoque une nécrose rapide en détruisant directement la membrane cellulaire en agrégeant des photosensibilisants sur la membrane par une réaction photochimique8. Le NIR-PIT est supérieur au PDT ciblé conventionnel à bien des égards. Les photosensibilisateurs conventionnels ont de faibles coefficients d’extinction, nécessitant la fixation d’un grand nombre de photosensibilisateurs à une seule molécule d’anticorps, ce qui réduit potentiellement l’affinité de liaison. La plupart des photosensibilisants conventionnels sont hydrophobes, ce qui rend difficile la liaison des photosensibilisants aux anticorps sans compromettre leur immunoréactivité ou leur accumulation de cible in vivo. Les photosensibilisateurs conventionnels absorbent généralement la lumière dans la gamme visible, ce qui réduit la pénétration des tissus.
Plusieurs études sur le NIR-PIT ciblant les tumeurs intrathoraciques telles que le cancer du poumon et les cellules malignes du mésothéliome pleural (MPM) ont été rapportées9,10,11, 12,13,14,15,16,17. Cependant, seuls quelques rapports ont décrit l’efficacité de NIR-PIT dans les modèles pleuraux disséminés de MPM ou de cancer du poumon9,10,11,12. On pense que les modèles de xénogreffe de tumeurs sous-cutanées sont des modèles tumoraux standard et sont actuellement largement utilisés pour évaluer les effets antitumoraux des nouvelles thérapies18. Cependant, le microenvironnement tumoral sous-cutané n’est pas permissif pour le développement d’une structure tissulaire appropriée ou d’une condition qui récapitule correctement un véritable phénotype malin19,20,21,22. Idéalement, des modèles de maladie orthotopique devraient être établis pour une évaluation plus précise des effets antitumoraux.
Ici, nous démontrons une méthode d’évaluation de l’efficacité dans un modèle murin de cancer du poumon disséminé pleural, qui a été traité à l’aide de NIR-PIT. Un modèle murin de dissémination pleurale est généré par injection de cellules tumorales dans la cavité thoracique et confirmé à l’aide de la luminescence de la luciférase. La souris a été traitée par une injection intraveineuse de mAb conjuguée à l’IR700 et à une irradiation NIR dans la poitrine. L’effet thérapeutique a été évalué en utilisant la luminescence de la luciférase.

<table><tbody><tr><td>0,25w/v % Trypsine-1mmol/l EDTA 4Na Solution avec Rouge de Phénol</td><td>Wako</td><td>209-016941</td><td>pour culture cellulaire</td></tr><tr><td>Seringue de 1mL</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T</td><td>pour</td></tr> expérience de souris <tr><td>Aiguille 30G</td><td>Nipro</td><td>1907613</td><td>pour expérience de souris</td></tr><tr><td>BALB/cSlc-nu/nu</td><td>Japon SLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloration au bleu de collision</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td>utilisation pour la coloration des protéines de gel</td></tr><tr><td>Coomassie (bradford) Plus</td> dosage des protéines <td>Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)</td><td>PI-23200</td><td>pour la mesure de la concentration APC</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Wako</td><td>043-07216</td><td>utilisation pour la conjugaison de l’IR700</td></tr><tr><td>D-Luciferin (sel de potassium)</td><td>Cayman Chemical</td><td>14681</td><td>pour l’imagerie par bioluminescence et DLIT</td></tr><tr><td>GraphPad Prism7</td><td>Logiciel GraphPad</td><td>pour l’analyse statistique</td>Image Studio Li-Cor Biosciences pour l’analyse d’images fluorescentes 700 nm IRDye 700DX Ester Infrared Dye LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)929-70011 isoflurane Wako 095-06573 pour souris anesthésie IVIS Spectrum CT PerkinElmer pour la capture <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> image bioluminescente et DLIT</td></tr><tr><td>Living Image</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>pour l’analyse de l’image bioluminescente et DLIT</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)</td><td>S9763</td><td>utilisation pour la conjugaison de l’IR700</td></tr><tr><td>NIR Laser</td><td>Changchun New Industries Optoelectronics Technology</td><td>MRL-III-690R</td><td>pour l’irradiation NIR</td></tr><tr><td>Novex WedgeWell 4 à 20 %, Tris-Glycine, 1,0 mm, Mini Protein Gel, 12 puits</td><td>Utilisation XP04202BOX Invitrogen</td><td></td><td>pour SDS-PAGE</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (x4)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td>Utilisation pour SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Capteur de puissance optique</td><td>Thorlabs (Newton, NJ, USA)</td><td>PM100</td><td>pour la mesure de la sortie du laser NIR&nbsp ;</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie Pearl Trilogy</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>pour la capture d’une image fluorescente de 700 nm</td></tr><tr><td>Solution de péniciline-streptomycine (x100)</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td>pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Puromycine Dihydrochloride</td><td>ThermoFisher</td><td>A1113803</td><td>pour la transfection de la luciférase</td></tr><tr><td>RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS960002</td><td>pour la transfection de la luciférase</td></tr><tr><td>RPMI-1640 avec L-glutamine et Phenol Red</td><td>Wako</td><td>189-02025</td><td>pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Colonne Sephadex G25 (-10)&nbsp ;</td><td>GE Healthcare (Piscataway, NJ, États-Unis)</td><td>17-0851-01</td><td>utilisation pour la conjugaison de l’IR700</td></tr><tr><td>UV-1900i</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>pour la mesure de la concentration APC</td></tr></tbody></table>

photoimmunothérapie proche infrarouge pour des modèles murins de dissémination pleurale

Near Infrared Photoimmunotherapy for Mouse Models of Pleural Dissemination

L’efficacité de la photoimmunothérapie peut être évaluée plus précisément avec un modèle murin orthotopique qu’avec un modèle sous-cutané. Un modèle de dissémination pleurale peut être utilisé pour l’évaluation des méthodes de traitement des maladies intrathoraciques telles que le cancer du poumon ou le mésothéliome pleural malin.
La photoimmunothérapie dans le proche infrarouge (NIR-PIT) est une stratégie de traitement du cancer récemment développée qui combine la spécificité des anticorps ciblant les tumeurs avec la toxicité causée par un photoabsorbeur (IR700Dye) après exposition à la lumière NIR. L’efficacité de NIR-PIT a été rapportée à l’aide de divers anticorps; cependant, seuls quelques rapports ont montré l’effet thérapeutique de cette stratégie dans un modèle orthotopique. Dans la présente étude, nous démontrons un exemple d’évaluation de l’efficacité du modèle de cancer du poumon disséminé pleural, qui a été traité à l’aide de NIR-PIT.

L’anticorps anti-podoplanine NZ-1 a été conjugué avec IR700 pour générer NZ-1-IR700. Nous avons confirmé la liaison de NZ-1 et IR700 sur une SDS-PAGE (Figure 8). H2373 exprimant la luciférase (H2373-luc) a été préparé en transfectant des cellules malignes du mésothéliome (H2373) avec un gène de luciférase10.
Nous avons anesthésé des souris nues homozygotes femelles de 8 à 12 semaines et injecté 1 ×10 cellules H2373-luc dans la ca...

La photoimmunothérapie dans le proche infrarouge (NIR-PIT) est une stratégie thérapeutique émergente contre le cancer qui utilise un conjugué anticorps-photoabsorbeur (IR700Dye) et une lumière NIR pour détruire les cellules cancéreuses. Ici, nous présentons une méthode pour évaluer l’effet antitumoral de NIR-PIT dans un modèle murin de cancer du poumon disséminé pleural et de mésothéliome pleural malin en utilisant l’imagerie par bioluminescence.

Photoimmunothérapie proche infrarouge pour des modèles murins de dissémination pleurale

The efficacy of photoimmunotherapy can be evaluated more accurately with an orthotopic mouse model than with a subcutaneous one. A pleural dissemination ...

Cette méthode peut être utilisée pour évaluer les effets thérapeutiques du NIR-PIT sur les tumeurs thoraciques dans un modèle tumoral cliniquement pertinent. Les procédures NIR-PIT utilisant le modèle de cancer disséminé pleural sont faciles à comprendre et à réaliser. Pour mettre en place un modèle de dissémination de souris, utilisez de la mousse de polystyrène pour fabriquer un bouchon et désinfectez-le avec de l’éthanol à 70%.Fixez l’aiguille au bouchon avec la pointe s’étendant à cinq millimètres du bouchon. Pliez la pointe d’une aiguille de calibre 30 avec une pince propre ou contre un objet dur nettoyé à 70% d’éthanol, et remplissez une seringue avec une fois 10 aux six cellules tumorales cibles dans 100 microlitres de PBS. Confirmer un manque de réponse au réflexe de pédale chez une souris nue anesthésiée, de 19 à 21 grammes, âgée de huit à 12 semaines, femelle, homozygote, athymique nue.Insérez l’aiguille dans la poitrine à travers l’espace intercostal, en déplaçant l’aiguille de haut en bas pour éviter de contacter les côtes. Lorsque la pointe a traversé l’espace intercostal, positionnez la seringue de manière à ce qu’elle soit pressée contre la souris et injectez tout le volume des cellules cibles. Après l’injection, roulez la souris deux à trois fois pour répartir les cellules dans toute la cavité thoracique et ramenez la souris dans sa cage avec surveillance jusqu’à récupération complète.24 heures après l’injection de cellules et tous les jours par la suite, injecter aux souris anesthésisées injectées dans des cellules tumorales 200 microlitres de 15 milligrammes par millilitre de D-luciférine. Après 10 minutes, placez les souris dans un imageur de bioluminescence et ouvrez le Panneau de configuration d’acquisition dans le logiciel d’imagerie. Sélectionnez Luminescent, Photographie et Superposition.Réglez le temps d’exposition sur Auto, le Binning sur Small, le F/Stop sur un pour Luminescent et sur huit pour Photograph, et le champ de vision sur C.Click Acquire pour imager la bioluminescence. Définissez le format d’affichage sur Radians et sélectionnez le cercle dans les outils De région d’intérêt du panneau Palette d’outils. Cliquez sur Mesurer les régions d’intérêt pour mesurer l’intensité bioluminescente de surface, puis utilisez Configurer la mesure pour sélectionner les valeurs pertinentes pour l’expérience.Exportez cette table de données sous forme de fichier csv. Utilisez ensuite les valeurs de flux total pour la quantification de l’intensité bioluminescente dans le fichier. Avant d’effectuer une photothérapie dans le proche infrarouge des souris injectées dans la tumeur, utilisez un capteur de puissance pour mesurer la dose de lumière d’un laser de longueur d’onde de 690 nanomètres et ajustez la sortie à 100 milliwatts par centimètre carré.24 heures avant le traitement, injecté par voie intraveineuse 100 microgrammes de conjugué photosensibilisant d’anticorps dans 50 à 200 microlitres de PBS via la veine caudale de l’animal injecté dans la tumeur. Le jour du traitement de photothérapie, placez la souris anesthésiée injectée par conjuguée et chargée de tumeurs en position couchée et protégez les sites non ciblés avec du papier d’aluminium. Lorsque tous les boucliers ont été placés, utilisez un laser de 100 joules par centimètre carré pour irradier la cavité thoracique avec une lumière proche infrarouge pendant environ 30 secondes.Lorsque l’irradiation est terminée et que la souris s’est réveillée, ramenez l’animal dans sa cage et mesurez quotidiennement la bioluminescence comme démontré. Dans cette analyse représentative, la conjugaison de l’anticorps anti-podoplanine avec l’IR700 a été confirmée par l’analyse SDS-PAGE. Après l’injection de cellules tumorales, l’imagerie par bioluminescence et la tomographie par imagerie par luminescence diffuse doivent être effectuées pour déterminer quelles souris expriment une activité suffisante de la luciférase dans la cavité thoracique pour une étude plus approfondie.Au cinquième jour après l’injection, les souris injectées par anticorps anti-podoplanine IR700 présentent une fluorescence IR700 élevée et une activité de la luciférase dans les tumeurs thoraciques, ce qui indique que l’anticorps conjugué IR700 injecté par voie intraveineuse atteint les sites tumoraux pleuraux disséminés. Notamment, les souris disséminées pleurales traitées par photoimmunothérapie dans le proche infrarouge démontrent une diminution de l’activité de la luciférase, tandis que les unités lumineuses relatives du groupe témoin présentent une augmentation progressive de l’intensité. Étant donné que l’énergie d’irradiation NIR requise dépend de la lignée cellulaire et des anticorps, assurez-vous de vérifier les conditions à l’avance in vitro.

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Médecine

La thérapie photodynamique (PDT) est une méthode non invasive et non chirurgicale pour le traitement du cancer du poumon. Les photosensibilisants s’accumulent sélectivement dans le tissu tumoral et entraînent la mort des cellules tumorales en présence d’oxygène et de la bonne longueur d’onde de la lumière. Cette vidéo décrit l’analyse de l’efficacité antitumorale in vivo à l’aide d’un photosensibilisant contenant des nanoparticules chez une souris porteuse d’une tumeur, afin de déterminer le...

Analyse in vivo de l’efficacité antitumorale de la PDT : une technique pour déterminer le potentiel phototoxique d’un photosensibilisateur chez des souris porteuses de tumeurs

Cette vidéo démontre une méthode pour générer un modèle murin de dissémination pleurale en injectant une suspension de cellules cancéreuses du poumon dans la cavité thoracique d’une souris immunodéficiente.

Établissement d’un modèle murin de cancer du poumon pleural disséminé

Cette vidéo présente une technique de photoimmunothérapie proche infrarouge pour traiter le cancer du poumon dans un modèle murin modifié présentant des cellules tumorales exprimant la luciférase. Lors de l’injection d’un conjugué anticorps-photosensibilisateur (APC) qui se lie à des antigènes spécifiques sur les cellules tumorales, la souris est exposée à un rayonnement proche infrarouge, induisant des changements photochimiques dans l’APC et conduisant à la mort nécrotique des cellules...

Une technique de photoimmunothérapie dans le proche infrarouge pour traiter le cancer du poumon dans un modèle murin

Cette vidéo présente une technique permettant d’extraire sélectivement des cellules spécifiques d’une culture cellulaire 3D mixte par photoimmunothérapie dans le proche infrarouge. Dans cette méthode, les cellules ciblées sont identifiées avec précision à l’aide d’un anticorps conjugué à un photoabsorbeur NIR. L’irradiation ultérieure à la lumière infrarouge induit la mort cellulaire, éliminant efficacement les cellules ciblées de la culture 3D.

Photoimmunothérapie proche infrarouge pour l’élimination ciblée de cellules dans des cultures 3D mixtes

Éliminer des cellules spécifiques sans endommager d’autres cellules est extrêmement difficile, en particulier dans les tissus établis, mais il existe un besoin urgent d’une méthode d’élimination cellulaire dans le domaine de l’ingénierie tissulaire. Ici, nous présentons une méthode d’élimination cellulaire spécifique à partir d’une culture cellulaire 3D mixte en utilisant la photoimmunothérapie proche infrarouge (NIR-PIT).

Selective Cellule élimination de Mixed Culture 3D en utilisant une technique proche infrarouge Photoimmunotherapy

Recherche sur les stratégies de traitement pour les tératomes de dérivés de cellules souches pluripotentes est importante pour la traduction clinique de la thérapie de cellules souches. Nous décrivons ici un protocole visant, en premier lieu, générer des cellules souches dérivées de tératomes chez la souris et, ensuite, à cible sélectivement et traiter ces tumeurs in vivo à l’aide d’un irradiateur de petits animaux.

Traitement ciblé et sélectif des tératomes de dérivé de cellules souches pluripotentes à l’aide de radiothérapie externe dans un modèle de petits animaux

Cet article décrit la génération d'un modèle orthotopic de souris du mésothéliome pleural humain par l'implantation des cellules de mésothéliome de H2052/484 dans la cavité pleurale des souris athymiques immunocompromised. La surveillance longitudinale du développement des tumeurs intrapleural a été évaluée par la tomographie multimodal non-invasive[18F]-2-fluoro-2-deoxy-deoxy-D-glucose positron et la formation image de tomographie calculée.

Implantation et suivi par PET/CT d'un modèle orthotopic du mésothéliome pleural humain chez les souris athymiques

Ce protocole présente un ensemble d’expériences adoptées pour l’évaluation de peptides anticancéreux photocommutables, qui peuvent être utilisés dans le criblage préclinique de tels composés. Cela comprend l’évaluation de la cytotoxicité dans des cultures cellulaires 2D et 3D, l’évaluation de l’efficacité de la photoisomérisation ex vivo (tissu modèle) et l’efficacité in vivo .

Évaluation in vitro et in vivo de composés biologiquement actifs photocontrôlés - candidats médicaments potentiels pour la photopharmacologie du cancer

Nous présentons une méthode d’étude de la rediffusion des cellules tumorales à partir de métastases pulmonaires impliquant un protocole chirurgical de photoconversion sélective des métastases pulmonaires, suivi de l’identification des cellules tumorales redisséminées dans les organes tertiaires.

Suivi de la dissémination des cellules tumorales à partir de métastases pulmonaires à l’aide de la photoconversion

L’application des résultats de la microscopie intravitale est mise à l’épreuve par sa faible profondeur de pénétration dans les tissus. Nous décrivons ici un modèle de souris à chambre de fenêtre dorsale qui permet le co-enregistrement de la microscopie intravitale et des modalités d’imagerie cliniquement applicables (par exemple, CT, IRM) pour une corrélation spatiale directe, rationalisant potentiellement la traduction clinique des résultats de la microscopie intravitale.

Modèle murin de tumeur à chambre fenêtre de pli cutané dorsal pour la microscopie intravitale combinée et l’imagerie par résonance magnétique dans la recherche translationnelle sur le cancer

Ce protocole présente les techniques et la méthodologie nécessaires à la thérapie hyperthermique ciblée dans des modèles de tumeurs solides. L’approche exploite la conversion photothermique de la lumière proche infrarouge par des nanotiges d’or injectées intratumorale pour induire un réchauffement localisé dans le microenvironnement tumoral.

Induction d’une légère hyperthermie ciblée dans des modèles de tumeurs murines par conversion photothermique de la lumière proche infrarouge par des nanotiges d’or intratumorales

Découvrez la photoimmunothérapie proche infrarouge pour évaluer les effets antitumoraux sur des modèles murins de dissémination pleurale. Cette méthode utilise l'imagerie de bioluminescence pour surveiller les résultats thérapeutiques en temps réel.

Photoimmunothérapie proche infrarouge pour des modèles murins de dissémination pleurale

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