Criblage à haut débit des composés chimiques pour élucider leurs effets sur la persistance bactérienne

Le protocole décrit ici permet d’identifier les conditions qui peuvent avoir un impact significatif sur la persistance bactérienne de manière à haut débit. Cette méthode est facilement adaptable pour dépister divers domaines, tels que les panels de médicaments, les bibliothèques de gènes et plus encore. Comme la méthode comprend diverses sous-étapes, qui doivent être menées simultanément, la démonstration visuelle peut aider les chercheurs à gérer leur calendrier pour obtenir des résultats précis.

Commencez par préparer des cultures de cellules de puces à ADN. Transférer 250 microlitres de cellules de phase exponentielle à 25 millilitres de milieu LB modifié frais dans un tube de centrifugation de 50 millilitres. Ensuite, mélangez doucement la suspension cellulaire pour la rendre homogène.

Transférer la suspension de cellules diluées dans un réservoir stérile de 50 millilitres. À l’aide d’une pipette multicanal, transférer 150 microlitres de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque de microréseau contenant divers produits chimiques. Les puces à ADN peuvent également être générées manuellement en suivant la méthode décrite dans le manuscrit de texte.

Couvrez la plaque de microréseau avec une membrane de plafond perméable aux gaz et incuber dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius et 250 tr / min pendant 24 heures. Pour fabriquer des plaques d’analyse de persister, préparer 25 millilitres de milieu LB modifié contenant cinq microgrammes par millilitre d’ofloxacine dans un tube de centrifugation de 50 millilitres et transférer ce milieu dans un réservoir stérile. Transférer 190 microlitres du milieu LB modifié dans chaque puits d’une plaque générique à fond plat de 96 puits.

Après l’incubation de 24 heures, retirer le microréseau du shaker et transférer 10 microlitres de cultures cellulaires du microréseau vers les puits de la plaque d’essai du persister contenant du milieu LB modifié avec de l’ofloxacine. Prenez 10 microlitres de suspensions cellulaires de la plaque d’essai du persister et diluez-la en série trois fois dans 290 microlitres de solution PBS à l’aide d’une plaque de puits à fond rond de 96 et d’une pipette multicanal. Ensuite, repérez 10 microlitres de toutes les suspensions cellulaires diluées en série sur des plaques de gélose fraîche sans antibiotiques.

Couvrez la plaque d’essai du persister avec une membrane de plafond perméable aux gaz et incuber dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius et 250 tr / min pendant six heures. Après l’incubation de six heures, répéter la dilution en série et le repérage sur les plaques de gélose. Incuber les plaques de gélose pendant 16 heures à 37 degrés Celsius.

Comptez ensuite les unités formant colonies ou UFC. Utilisez les niveaux d’UFC avant et six heures après le traitement antibiotique pour calculer la fraction persistante dans chaque puits. Le dénombrement de l’UFC avant le traitement ofx aide également à évaluer les effets des osmolites sur la viabilité d’E coli.

Transférer 250 microlitres de cellules de phase exponentielle à 25 millilitres de milieu LB modifié frais contenant l’osmolite identifiée à partir du criblage de microréseau. Incuber le ballon dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après 24 heures, retirer le ballon du agitateur et transférer 250 microlitres de la culture cellulaire dans 25 millilitres de milieu LB modifié frais dans une fiole déconcertée de 250 millilitres.

Ajouter 25 microlitres de solution mère d’ofloxacine à la suspension cellulaire et agiter doucement le ballon pour rendre la culture d’essai homogène. Incuber le ballon dans un agitateur à 37 degrés Celsius et 250 tr / min. À chaque heure pendant le traitement, y compris un point de temps avant l’addition d’ofloxacine, transférer un millilitre de la culture d’essai du ballon dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre et le centrifuger à 17 000 fois G pendant trois minutes.

Retirer 950 microlitres de surnageant et laver les cellules trois fois avec 950 microlitres de PBS. Après le lavage final, re-suspendre le culot cellulaire dans 100 microlitres de solution de PBS. Prenez 10 microlitres de la suspension cellulaire et diluez-la en série six fois avec 90 microlitres de PBS à l’intérieur d’une plaque inférieure ronde de 96 puits.

Repérez 10 microlitres des suspensions de cellules diluées sur une plaque de gélose sans antibiotiques. Pour augmenter la limite de détection, plaquez les 90 microlitres restants de suspension cellulaire sur une plaque de gélose fraîche. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 16 heures, puis compter les UFC.

Une image représentative des plaques de gélose utilisées pour déterminer les niveaux de UFC des cultures cellulaires avant et après le traitement OFX est montrée ici. La première colonne est le groupe témoin. La deuxième colonne contient des cellules qui ont été cultivées dans du nitrate de sodium 100 millimolaire et la troisième colonne contient des cellules qui ont été cultivées dans du nitrate de sodium 60 millimolaire.

Par souci de simplicité, seuls deux osmolites sont ciblés ici. Une représentation graphique des données de l’UFC provenant des plaques et des fractions persistantes des cultures cellulaires testées dans 96 plaques de puits est présentée ici. Pour calculer les fractions, les comptes de persister ont été normalisés aux comptes de cellules obtenus avant le traitement antibiotique.

Pour générer des courbes de mise à mort aléatoires, les cellules ont été cultivées dans 25 millilitres de milieu LB modifié avec les osmolites indiquées et les flacons déconcertés pendant 24 heures, puis transférées dans des flacons d’essai de persister pour le dénombrement de persister. En essayant ce protocole, gardez à l’esprit que repérer les cellules sur la plaque de gélose est laborieux et nécessite une concentration. Une erreur au cours de l’étape peut entraîner une contamination croisée entre les conditions testées.

Il est donc important de s’entraîner à repérer plusieurs échantillons simultanément avant l’expérience. Suivant ce protocole, les panels de médicaments et les bibliothèques de cellules mutantes peuvent être examinés pour étudier les impacts sur la persistance. Grâce à ce dépistage, nous avons identifié un certain nombre d’osmolites et d’affections de SP qui ont un impact significatif sur la persistance bactérienne.