Name: Criblage à haut débit des composés chimiques pour élucider leurs effets sur la persistance bactérienne (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Découvrez un criblage à haut débit pour identifier des composés chimiques affectant la persistance bactérienne. Cette méthode adaptable permet d'évaluer des panels de médicaments et des bibliothèques de gènes avec précision.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à remercier les membres d’Orman Lab pour leurs précieuses contributions au cours de cette étude. Cette étude a été financée par le nih/niaid K22AI125468 prix de transition de carrière et une subvention de démarrage de l’Université de Houston.

1. Préparation du milieu de croissance, de la solution d’ofloxacine et des stocks de cellules D’E. coli
<ol><li>Milieu régulier Luria-Bertani (LB) : Ajouter 10 g/L de tryptone, 10 g/L de chlorure de sodium (NaCl) et 5 g/L d’extrait de levure dans de l’eau désionisée (DI). Stériliser le milieu par autoclavage.</li>
	<li>Plaques de gélose LB : Ajouter 10 g/L de tryptone, 10 g/L de NaCl, 5 g/L d’extrait de levure et 15 g/L de gélose dans de l’eau DI et stériliser le milieu par autoclavage. À la température désirée (~55 °C), verser ~30 mL de milieu de gélose dans des plaques carrées (10 x 10 cm). Sécher les assiettes et conserver à 4 °C.</li>
	<li>Milieu LB modifié : Ajouter 10 g/L de tryptone et 5 g/L d’extrait de levure dans de l’eau DI. Stériliser le milieu par autoclavage.</li>
	<li>Milieu LB modifié comprenant un osmolyte : Mélanger 2x milieu LB modifié avec une solution 2x osmolyte en volumes égaux. Pour préparer 2x milieu LB modifié, ajouter 20 g/L de tryptone et 10 g/L d’extrait de levure dans de l’eau DI et stériliser par autoclavage. Pour préparer la solution d’osmolyte 2x, dissoudre l’osmolyte d’intérêt (2x quantité) dans de l’eau DI, puis filtrer stériliser la solution. NOTA : L’osmolyte d’intérêt et ses concentrations peuvent être déterminés à partir des tests de dépistage des puces à adn phénotypique (voir le protocole 4). Cependant, l’osmolyte testé et la concentration 2x associée peuvent être ajustés en fonction de la nature de la recherche. Par exemple, pour étudier l’impact du chlorure de sodium 1 mM, une solution d’osmolyte 2x serait une solution de chlorure de sodium 2 mM.</li>
	<li>Solution mère d’ofloxacine (5 mg/mL) : Ajouter 5 mg de sel d’ofloxacine (OFX) dans 1 mL d’eau DI. Ajouter 10 μL d’hydroxyde de sodium 10 M pour augmenter la solubilité de l’OFX dans l’eau, puis filtrer stériliser la solution. Préparer les aliquotes et conserver à -20 °C. REMARQUE: L’ofloxacine est un antibiotique quinolone qui a été largement utilisé pour les cellules bactériennes en croissance et non en croissance14,21. La concentration inhibitrice minimale (CMI) d’OFX pour les cellules E. coli MG1655 se situe dans la plage de 0,039 à 0,078 μg/mL19,20. Notez également que d’autres antibiotiques tels que l’ampicilline et la kanamycine sont couramment utilisés dans la recherche sur les persistants. Le choix des antibiotiques dépend de la nature de l’étude.</li>
	<li>
E. coli Stocks de cellules MG1655 : Inoculer 2 mL de milieu LB régulier avec une seule colonie dans un tube à essai de 14 mL (encchique) et faire la culture des cellules dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 °C. Lorsque les cellules atteignent la phase stationnaire, mélanger 500 μL de la culture cellulaire avec 500 μL de glycérol à 50 % (stérile) dans un flacon cryogénique et conserver à -80 °C.</li>
</ol>2. Propagation des cellules pour éliminer les persistants préexistants
<ol><li>Pour préparer une culture pendant la nuit, grattez une petite quantité de cellules d’un stock de cellules congelées avec une pointe de pipette stérile (ne décongelez pas le stock de cellules de glycérol) et inoculez les cellules dans 2 mL de milieu LB modifié dans un tube à essai à bouchon cassé de 14 mL. Culturer les cellules dans un agitateur orbital à 250 rpm et 37 °C pendant 12 h.</li>
	<li>Première propagation<ol>
<li>Après 12 h, transférer 250 μL de culture pendant la nuit dans 25 mL de milieu LB modifié frais dans une fiole déconcertée de 250 mL recouverte d’une feuille d’aluminium stérile.</li>
		<li>Cultiver la culture cellulaire dans un agitateur orbital à 250 tr/min et à 37 °C jusqu’à ce que les cellules atteignent la phase exponentielle moyenne (DO600 = 0,5).</li>
		<li>Mesurer la densité optique à 600 nm (OD600)à l’aide d’un lecteur de microplaques toutes les 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deuxième propagation<ol>
<li>À600 DO = 0,5, diluer 250 μL de culture cellulaire de la première fiole dans 25 mL de milieu LB modifié frais dans une fiole déconcertée de 250 mL.</li>
		<li>Cultiver la deuxième culture cellulaire dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 °C jusqu’à600DO = 0,5.</li>
		<li>Mesurer la densité optique toutes les 30 minutes. REMARQUE: Une culture de nuit peut avoir une quantité importante de cellules persistantes4,5,22. La méthode du cycle de dilution/croissance5 décrite ci-dessus peut être utilisée pour éliminer ces persistants préexistants avant de transférer les cellules dans des puces à ADN. Leur élimination peut être validée en quantifiant les niveaux de persistance des cultures de nuit avec le dosage décrit dans le protocole 3. Cette méthode a déjà été validée dans une étude précédente19.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Validation de l’élimination des cellules persistantes préexistantes
<ol><li>Après la deuxième multiplication (voir étape 2.3), diluer 250 μL de la culture cellulaire (DO600 = 0,5) dans 25 mL de milieu LB modifié frais dans une fiole déconcertée de 250 mL. NOTA : Pour les témoins, diluer 250 μL de culture pendant la nuit (voir l’étape 2.1) dans 25 mL de milieu LB modifié frais dans une fiole déconcertée de 250 mL. Avant de transférer les cellules dans le ballon, la densité cellulaire de la culture de nuit doit être ajustée dans un milieu LB modifié frais pour obtenirla DO 600 = 0,5.</li>
	<li>Ajouter 25 μL de solution mère OFX (5 mg/mL) dans la suspension cellulaire et agiter doucement le ballon pour rendre la culture d’essai homogène. La concentration finale d’OFX est de 5 μg/mL dans la culture d’essai.</li>
	<li>Incuber la culture d’essai dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 °C.</li>
	<li>À chaque heure pendant le traitement (y compris 0 h, le point de temps avant l’ajout d’OFX dans la culture d’essai), transférer 1 mL de la culture d’essai du ballon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifuger la culture d’essai dans le tube de microcentrifugation à 17 000 x g pendant 3 min.</li>
	<li>Retirez soigneusement 950 μL du surnageant sans perturber la pastille cellulaire.</li>
	<li>Ajouter 950 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le tube à microcentrifugation.</li>
	<li>Répétez les étapes de lavage 3.5-3.7 pour 3x au total jusqu’à ce que la concentration d’antibiotique soit inférieure à la concentration minimale inhibitrice (MIC).</li>
	<li>Après le lavage final, ressusciter la pastille cellulaire dans 100 μL de solution de PBS, ce qui donne un échantillon concentré 10 fois.</li>
	<li>Prendre 10 μL de la suspension cellulaire et diluer en série six fois dans 90 μL de solution de PBS à l’aide d’une plaque inférieure ronde à 96 puits.</li>
	<li>Repérez 10 μL de suspensions de cellules diluées sur des plaques de gélose fraîches sans antibiotiques. Pour augmenter la limite de détection, plaquez les 90 μL restants de suspension cellulaire sur une plaque de gélose fraîche.</li>
	<li>Incuber les plaques de gélose à 37 °C pendant 16 h, puis compter les unités formant colonies (UFC). Tenir compte des taux de dilution lors du calcul du nombre total d’UFC dans 1 mL de culture d’essai. Les courbes de mise à mort sont générées en traçant les valeurs logarithmiques de l’UFC par rapport à la durée du traitement antibiotique. REMARQUE : Un traitement OFX de 6 h est suffisant pour obtenir une courbe de mise à mort biphasique pour les cellules E. coli 19,20. Le niveau de persistance des cellules propagées (tel que mesuré par le nombre d’UFC à 6 h) devrait être significativement inférieur à celui de la culture de nuit. Les procédures décrites dans les protocoles 2 et 3 peuvent être effectuées avec un LB régulier selon le plan de recherche.</li>
</ol>4. Criblages de plaques de microréseaux 
<ol><li>Préparation de cultures de cellules de puces à ADN<ol>
<li>Transférer 250 μL de cellules en phase exponentielle vers 25 mL de milieu LB modifié frais dans un tube de centrifugation de 50 mL. Mélangez doucement la suspension cellulaire pour la rendre homogène. Remarque : les cellules de phase exponentielle (OD600 = 0,5) sont obtenues à partir de la deuxième étape de propagation (voir étape 2.3).</li>
		<li>Transférer la suspension de cellules diluées dans un réservoir stérile de 50 mL.</li>
		<li>À l’aide d’une pipette multicanal, transférer 150 μL de la suspension cellulaire dans chaque puits d’un microréseau, c’est-à-dire une plaque de 96 puits contenant divers osmolytes. Remarque : les puits qui n’ont pas d’osmolytes servent de contrôles.</li>
		<li>Couvrez la puce à ADN avec une membrane d’étanchéité perméable aux gaz.</li>
		<li>Incuber la plaque dans un agitateur orbital à 37 °C et 250 tr/min pendant 24 h. NOTA : Dans le cadre de ces expériences, des plaques disponibles dans le commerce ont été utilisées, comme des puces à adn phénotypiques (PM-9 et PM-10) qui comprennent une vaste gamme d’osmolytes, de tampons de pH et d’autres produits chimiques à l’état séché à diverses concentrations. Ces puces à ADN sont dans des formats de plaque de puits demi-zone 96. Les volumes de culture doivent être ajustés en fonction du type de plaques utilisées. Les puces à ADN peuvent également être générées manuellement (voir ci-dessous).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation manuelle de plaques de puces à ADN<ol>
<li>Transférer 75 μL de solutions d’osmolyte 2x dans les puits d’une plaque de puits de 96 demi-surface.</li>
		<li>Transférer 500 μL de cellules en phase exponentielle vers 25 mL de milieu LB modifié 2x dans un tube à centrifuger de 50 mL. Mélangez doucement la suspension cellulaire pour la rendre homogène. NOTA : Le taux d’inoculation a été ajusté pour être conforme au protocole de dépistage des puces à ADN décrit à la section 4.1.</li>
		<li>Ajouter 75 μL de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque de puits 96 demi-zone contenant 2x solutions d’osmolyte.</li>
		<li>Incuber la plaque dans un agitateur orbital à 37 °C et 250 tr/min pendant 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de plaques d’essai de persister<ol>
<li>Préparer 25 mL de milieu LB modifié contenant 5 μg/mL d’OFX dans un tube centrifuge de 50 mL et transférer ce milieu dans un réservoir stérile.</li>
		<li>Transférer 190 μL de milieu LB modifié avec OFX du réservoir dans chaque puits d’une plaque générique à fond plat de 96 puits (plaque de dosage persistant) à l’aide d’une pipette multicanal.</li>
		<li>Retirez la puce à ADN du shaker (après culture pendant 24 h) et transférez 10 μL de cultures cellulaires de la puce à ADN vers les puits de la plaque d’analyse du persister, contenant du milieu LB modifié avec OFX.</li>
		<li>Prendre 10 μL de suspensions cellulaires de la plaque d’essai du persister et diluer en série trois fois dans 290 μL de solution de PBS à l’aide d’une plaque de puits à fond rond de 96 et d’une pipette multicanal.</li>
		<li>Après la dilution en série, placez 10 μL de toutes les suspensions cellulaires diluées en série sur des plaques de gélose fraîches sans antibiotiques à l’aide d’une pipette multicanal.</li>
		<li>Incuber la plaque d’essai du persister (préparée à l’étape 4.3.3) dans un agitateur orbital à 37 °C et 250 tr/min pendant 6 h après avoir recouvert la plaque d’une membrane d’étanchéité perméable aux gaz.</li>
		<li>Après 6 h d’incubation dans un agitateur, retirez la plaque de dosage du persister et répétez les étapes 4.3.4-4.3.5.</li>
		<li>Incuber les plaques de gélose pendant 16 h à 37 °C, puis compter les UFC. Les niveaux de CFU avant et 6 h après le traitement antibiotique permettent de calculer la fraction persistante dans chaque puits. Le dénombrement de l’UFC avant le traitement ofx aide également à évaluer les effets des osmolytes et sur la viabilité d’E. coli.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Validation des conditions identifiées
<ol><li>Transférer 250 μL des cellules de phase exponentielle de l’étape 2.3 à 25 mL de milieu LB modifié frais contenant l’osmolyte identifié lors du criblage des puces à ADN (voir le protocole 4).</li>
	<li>Incuber le ballon dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 °C pendant 24 h.</li>
	<li>Après 24 h, retirer le ballon du agitateur et transférer 250 μL de la culture cellulaire dans 25 mL de milieu LB modifié frais dans une fiole déconcertée de 250 mL.</li>
	<li>Ajouter 25 μL de solution mère d’OFX (5 mg/mL) dans la suspension cellulaire et agiter doucement le ballon pour rendre la culture d’essai homogène. Incuber le ballon dans un agitateur à 37 °C et 250 tr/min.</li>
	<li>À chaque heure pendant le traitement, transférer 1 mL de la culture d’essai du ballon dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifuger la culture d’essai dans le tube de microcentrifugation à 17 000 x g pendant 3 min.</li>
	<li>Retirer 950 μL de surnageant et ajouter 950 μL de PBS.</li>
	<li>Répétez les étapes de lavage 5.6 et 5.7 pour 3x.</li>
	<li>Après le lavage final, ressusciter la pastille cellulaire dans 100 μL de solution de PBS.</li>
	<li>Prendre 10 μL de la suspension cellulaire et diluer en série 6x dans 90 μL de solution de PBS à l’aide d’une plaque inférieure ronde de 96 puits.</li>
	<li>Repérez 10 μL des suspensions de cellules diluées sur une plaque de gélose fraîche sans antibiotiques. Pour augmenter la limite de détection, plaquez les 90 μL restants de suspension cellulaire sur une plaque de gélose fraîche.</li>
	<li>Incuber la plaque de gélose à 37 °C pendant 16 h, puis compter les UFC.</li>
</ol>

<ol><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells%2C+dormancy+and+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li>
<li>Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+Mechanism+of+Action+of+Penicillin%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Observations on the Mechanism of Action of Penicillin.</a> Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).</li>
<li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).</li>
<li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li>
<li>Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells+and+tolerance+to+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Persister cells and tolerance to antimicrobials.</a> FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).</li>
<li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li>
<li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+Strains+Producing+High+Levels+of+Persister+Cells+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li>
<li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).</li>
<li>Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite-enabled+eradication+of+bacterial+persisters+by+aminoglycosides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides.</a> Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).</li>
<li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li>
<li>Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+antibiotic+resistance+development+from+fluoroquinolone+persisters+after+a+single+exposure+to+antibiotic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.</a> Nature Communications. 10 (1), 1177(2019).</li>
<li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persistence+promotes+the+evolution+of+antibiotic+resistance+by+increasing+survival+and+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates.</a> ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).</li>
<li>Dörr, T., Lewis, K., Vulić, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOS+response+induces+persistence+to+fluoroquinolones+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli.</a> PLoS Genetics. 5 (12), 1000760(2009).</li>
<li>Völzing, K. G., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary-phase+persisters+to+ofloxacin+sustain+DNA+damage+and+require+repair+systems+only+during+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery.</a> mBio. 6 (5), (2015).</li>
<li>Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+bacterial+persisters+with+antibiotic-generated+hydroxyl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).</li>
<li>Gerdes, K., Maisonneuve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Persistence+and+Toxin-Antitoxin+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).</li>
<li>Orman, M. A., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+stationary+phase+respiration+impairs+persister+formation+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli.</a> Nature Communications. 6 (1), 7983(2015).</li>
<li>Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+hipA7+allele+of+Escherichia+coli+and+evidence+that+high+persistence+is+governed+by+%28p%29ppGpp+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis.</a> Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).</li>
<li>Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+effects+of+osmolytes+and+environmental+ph+on+bacterial+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393(2020).</li>
<li>Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Metabolic+Inhibitors+to+Reduce+Bacterial+Persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 472(2020).</li>
<li>Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dose-response+study+of+antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).</li>
<li>Luidalepp, H., Jõers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+The+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008(2006).</li>
<li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li>
<li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157%3AH7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’essai de persistance à haut débit décrit ici a été mis au point pour élucider les effets de divers produits chimiques sur la persistance de E. coli. En plus des plaques de particules commerciales, les puces à ADN peuvent être construites manuellement comme décrit à l’étape 4.2. De plus, le protocole présenté ici est flexible et peut être utilisé pour filtrer d’autres puces à ADN, telles que les panneaux de médicaments et les bibliothèques cellulaires, qui sont dans 96 formats de plaques de puits. Les condition...

Les cultures bactériennes contiennent une petite sous-population de cellules persistantes qui sont temporairement tolérantes à des niveaux anormalement élevés d’antibiotiques. Les cellules persistantes sont génétiquement identiques à leurs parents sensibles aux antibiotiques, et leur survie a été attribuée à l’inhibition transitoire de la croissance1. Les cellules persistantes ont été découvertes pour la première fois par Gladys Hobby2, mais le terme a été utilisé pour la première fois par Joseph Bigger lorsqu’il les a identifiées dans des cultures de Staphylococcus pyogenes traitées à la pénicilline3. Une étude séminale publiée par Balaban et al.4 a découvert deux types de persister : les variantes de type I qui sont principalement formées par le passage à travers la phase stationnaire, et les variantes de type II qui sont continuellement générées pendant la croissance exponentielle. Les persistants sont détectés par des tests de survie clonogènes, dans lesquels des échantillons de culture sont prélevés à divers intervalles pendant les traitements antibiotiques, lavés et plaqués sur un milieu de croissance typique pour compter les cellules survivantes qui peuvent coloniser en l’absence d’antibiotiques. L’existence de persisters dans une culture cellulaire est évaluée par une courbe de mise à mort biphasique4,5 où la décroissance exponentielle initiale indique la mort des cellules sensibles aux antibiotiques. Cependant, la tendance à tuer diminue au fil du temps, conduisant éventuellement à une région de plateau qui représente les cellules persistantes survivantes.
Les cellules persistantes ont été associées à diverses maladies telles que la tuberculose6,la mucoviscidose7,la candidose8 et les infections des voies urinaires9. Presque tous les micro-organismes testés jusqu’à présent se sont avérés pour générer des phénotypes persistants, y compris mycobacterium tuberculosishautement pathogène6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 et Candida albicans8. Des études récentes fournissent également des preuves de l’augmentation des mutants multirésistants dans les sous-populations persistantes11,12. Des efforts considérables dans ce domaine ont révélé que les mécanismes de persistance sont très complexes et divers; des facteurs stochastiques et déterministes associés à la réponse SOS13,14,aux espèces réactives de l’oxygène (ROS)15,aux systèmes toxine/antitoxine (TA)16,à l’autophagie ou à l’auto-digestion17 et à la réponse stricte liée au ppGpp18 sont connus pour faciliter la formation de persister.
Malgré des progrès significatifs dans la compréhension du phénotype de persistance, les effets des osmolytes sur la persistance bactérienne n’ont pas été entièrement compris. Étant donné que le maintien d’une pression osmotique optimale est une nécessité pour la croissance, le bon fonctionnement et la survie des cellules, une étude approfondie des osmolytes pourrait conduire à des cibles potentielles pour les stratégies anti-persister. Bien que laborieux, le criblage à haut débit est une approche très efficace pour identifier les métabolites et autres produits chimiques qui jouent un rôle crucial dans le phénotype de persistance19,20. Dans ce travail, nous discuterons de notre méthode publiée19, où nous avons utilisé des puces à ADN, c’est-à-dire 96 plaques de puits contenant divers osmolytes (par exemple, chlorure de sodium, urée, nitrite de sodium, nitrate de sodium, chlorure de potassium), pour identifier les osmolytes qui influencent considérablement la persistance de E. coli.

<table><tbody><tr><td>Tube à essai de 14 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-1B</td><td></td></tr><tr><td>souche E. coli MG1655</td><td>Université</td><td></td> de Princeton <td>Obtenu du laboratoire Brynildsen</td></tr><tr><td>Plaque à fond plat à 96 puits</td><td>USA Scientific</td><td>5665-5161</td><td></td></tr><tr><td>Membrane d’étanchéité perméable aux gaz</td><td>VWR</td><td>102097-058</td><td>Stérilisé par irradiation gamma et exempt de cytotoxines</td></tr><tr><td>Demi-surface plaque à fond plat à 96 puits</td><td>VWR</td><td>82050-062</td><td></td></tr><tr><td>LB gélose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td>Qualité génétique moléculaire</td></tr><tr><td>Sel d’ofloxacine</td><td>VWR</td><td>103466-232</td><td>HPLC &ge ; 97.5</td></tr><tr><td>Microréseau de phénotypes (PM-9 et PM-10)</td><td>Biolog</td><td>N/A</td><td>Les plaques PM-9 et PM-10 contenaient respectivement divers osmolytes et tampons</td></tr><tr><td>Plaque à fond rond à 96 puits</td><td>USA Scientific</td><td>5665-0161</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Certifié de qualité ACS</td></tr><tr><td>Nitrate de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424345000</td><td>de qualité réactif ACS</td></tr><tr><td>Nitrite de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA186680B</td><td>98 % de pureté</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri carrée</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-500</td><td>Qualité de génétique moléculaire</td></tr><tr><td>Varioskan lux lecteur de microplaques multimode</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VLBL00D0</td><td>Utilisé pour la mesure de la densité optique à 600 nm</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-100</td><td>Grade génétique moléculaire</td></tr></tbody></table>

criblage à haut débit des composés chimiques pour élucider leurs effets sur la persistance bactérienne

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Les bactéries persistantes sont définies comme une petite sous-population de variantes phénotypiques ayant la capacité de tolérer des concentrations élevées d’antibiotiques. Ils constituent un problème de santé important, car ils ont été associés à des infections chroniques récurrentes. Bien que la dynamique stochastique et déterministe des mécanismes liés au stress soit connue pour jouer un rôle significatif dans la persistance, les mécanismes sous-jacents au passage phénotypique à/de l’état de persistance ne sont pas complètement compris. Bien que les facteurs de persistance déclenchés par les signaux environnementaux (p. ex. épuisement des sources de carbone, d’azote et d’oxygène) aient fait l’objet d’études approfondies, les effets des osmolytes sur la persistance n’ont pas encore été déterminés. À l’aide de puces à ADN (c.-à-d. 96 plaques de puits contenant divers produits chimiques), nous avons conçu une approche pour élucider les effets de divers osmolytes sur la persistance d’Escherichia coli de manière à haut débit. Cette approche est transformatrice car elle peut être facilement adaptée à d’autres réseaux de dépistage, tels que les panels de médicaments et les bibliothèques de gènes knock-out.

La figure 1 décrit notre protocole expérimental. Les expériences sur le cycle de dilution/croissance (voir protocole 2) ont été adaptées d’une étude menée par Keren et al.5 pour éliminer les persistants provenant des cultures nocturnes. La figure 2A est une image représentative des plaques de gélose utilisées pour déterminer les niveaux d’UFC des cultures cellulaires avant et après le traitement ofx. Dans ces expériences, les cellules ont...

Dans ce document de méthode, nous présentons une stratégie de criblage à haut débit pour identifier les composés chimiques, tels que les osmolytes, qui ont un impact significatif sur la persistance bactérienne.

Criblage à haut débit des composés chimiques pour élucider leurs effets sur la persistance bactérienne

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Le protocole décrit ici permet d’identifier les conditions qui peuvent avoir un impact significatif sur la persistance bactérienne de manière à haut débit. Cette méthode est facilement adaptable pour dépister divers domaines, tels que les panels de médicaments, les bibliothèques de gènes et plus encore. Comme la méthode comprend diverses sous-étapes, qui doivent être menées simultanément, la démonstration visuelle peut aider les chercheurs à gérer leur calendrier pour obtenir des résultats précis.Commencez par préparer des cultures de cellules de puces à ADN. Transférer 250 microlitres de cellules de phase exponentielle à 25 millilitres de milieu LB modifié frais dans un tube de centrifugation de 50 millilitres. Ensuite, mélangez doucement la suspension cellulaire pour la rendre homogène.Transférer la suspension de cellules diluées dans un réservoir stérile de 50 millilitres. À l’aide d’une pipette multicanal, transférer 150 microlitres de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque de microréseau contenant divers produits chimiques. Les puces à ADN peuvent également être générées manuellement en suivant la méthode décrite dans le manuscrit de texte.Couvrez la plaque de microréseau avec une membrane de plafond perméable aux gaz et incuber dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius et 250 tr / min pendant 24 heures. Pour fabriquer des plaques d’analyse de persister, préparer 25 millilitres de milieu LB modifié contenant cinq microgrammes par millilitre d’ofloxacine dans un tube de centrifugation de 50 millilitres et transférer ce milieu dans un réservoir stérile. Transférer 190 microlitres du milieu LB modifié dans chaque puits d’une plaque générique à fond plat de 96 puits.Après l’incubation de 24 heures, retirer le microréseau du shaker et transférer 10 microlitres de cultures cellulaires du microréseau vers les puits de la plaque d’essai du persister contenant du milieu LB modifié avec de l’ofloxacine. Prenez 10 microlitres de suspensions cellulaires de la plaque d’essai du persister et diluez-la en série trois fois dans 290 microlitres de solution PBS à l’aide d’une plaque de puits à fond rond de 96 et d’une pipette multicanal. Ensuite, repérez 10 microlitres de toutes les suspensions cellulaires diluées en série sur des plaques de gélose fraîche sans antibiotiques.Couvrez la plaque d’essai du persister avec une membrane de plafond perméable aux gaz et incuber dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius et 250 tr / min pendant six heures. Après l’incubation de six heures, répéter la dilution en série et le repérage sur les plaques de gélose. Incuber les plaques de gélose pendant 16 heures à 37 degrés Celsius.Comptez ensuite les unités formant colonies ou UFC. Utilisez les niveaux d’UFC avant et six heures après le traitement antibiotique pour calculer la fraction persistante dans chaque puits. Le dénombrement de l’UFC avant le traitement ofx aide également à évaluer les effets des osmolites sur la viabilité d’E coli.Transférer 250 microlitres de cellules de phase exponentielle à 25 millilitres de milieu LB modifié frais contenant l’osmolite identifiée à partir du criblage de microréseau. Incuber le ballon dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après 24 heures, retirer le ballon du agitateur et transférer 250 microlitres de la culture cellulaire dans 25 millilitres de milieu LB modifié frais dans une fiole déconcertée de 250 millilitres.Ajouter 25 microlitres de solution mère d’ofloxacine à la suspension cellulaire et agiter doucement le ballon pour rendre la culture d’essai homogène. Incuber le ballon dans un agitateur à 37 degrés Celsius et 250 tr / min. À chaque heure pendant le traitement, y compris un point de temps avant l’addition d’ofloxacine, transférer un millilitre de la culture d’essai du ballon dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre et le centrifuger à 17 000 fois G pendant trois minutes.Retirer 950 microlitres de surnageant et laver les cellules trois fois avec 950 microlitres de PBS. Après le lavage final, re-suspendre le culot cellulaire dans 100 microlitres de solution de PBS. Prenez 10 microlitres de la suspension cellulaire et diluez-la en série six fois avec 90 microlitres de PBS à l’intérieur d’une plaque inférieure ronde de 96 puits.Repérez 10 microlitres des suspensions de cellules diluées sur une plaque de gélose sans antibiotiques. Pour augmenter la limite de détection, plaquez les 90 microlitres restants de suspension cellulaire sur une plaque de gélose fraîche. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 16 heures, puis compter les UFC.Une image représentative des plaques de gélose utilisées pour déterminer les niveaux de UFC des cultures cellulaires avant et après le traitement OFX est montrée ici. La première colonne est le groupe témoin. La deuxième colonne contient des cellules qui ont été cultivées dans du nitrate de sodium 100 millimolaire et la troisième colonne contient des cellules qui ont été cultivées dans du nitrate de sodium 60 millimolaire.Par souci de simplicité, seuls deux osmolites sont ciblés ici. Une représentation graphique des données de l’UFC provenant des plaques et des fractions persistantes des cultures cellulaires testées dans 96 plaques de puits est présentée ici. Pour calculer les fractions, les comptes de persister ont été normalisés aux comptes de cellules obtenus avant le traitement antibiotique.Pour générer des courbes de mise à mort aléatoires, les cellules ont été cultivées dans 25 millilitres de milieu LB modifié avec les osmolites indiquées et les flacons déconcertés pendant 24 heures, puis transférées dans des flacons d’essai de persister pour le dénombrement de persister. En essayant ce protocole, gardez à l’esprit que repérer les cellules sur la plaque de gélose est laborieux et nécessite une concentration. Une erreur au cours de l’étape peut entraîner une contamination croisée entre les conditions testées.Il est donc important de s’entraîner à repérer plusieurs échantillons simultanément avant l’expérience. Suivant ce protocole, les panels de médicaments et les bibliothèques de cellules mutantes peuvent être examinés pour étudier les impacts sur la persistance. Grâce à ce dépistage, nous avons identifié un certain nombre d’osmolites et d’affections de SP qui ont un impact significatif sur la persistance bactérienne.

high-throughput-screening-chemical-compounds-to-elucidate-their

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : Venkateswaran, S., et al. Identification à haut débit de polymères répulsifs pour les dispositifs médicaux. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo présente une méthode à haut débit pour identifier les polymères répulsifs aux bactéries à l’aide d’une lame de microréseau exposée à des cultures bactériennes mixtes. La liaison bactérienne est évaluée par fluorescence DAPI, où un signal réduit indique des polymères avec une fixation de surface minimale.

Identification à haut débit de polymères répulsifs contre les bactéries par criblage de microréseaux

Dans cette vidéo, nous montrons une méthode pour évaluer l’effet des osmolytes sur la formation de persistants bactériens. Les cellules bactériennes sont d’abord exposées à des osmolytes pour induire un stress osmotique, déclenchant la formation de persistants, puis traitées avec des antibiotiques pour énumérer les persistants.

Essai in vitro sur persistance : une méthode pour évaluer l’effet des osmolytes sur la persistance bactérienne

Ici, nous décrivons un test de gène rapporteur basé sur des cellules comme un outil précieux pour cribler les bibliothèques chimiques à la recherche de composés modulant les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel exercés par 3' UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Cet article décrit le dosage à haut débit qui a été établi avec succès à l' écran de grandes bibliothèques de petites molécules pour leur capacité potentielle à manipuler les niveaux cellulaires de cyclique di-GMP chez Pseudomonas aeruginosa, fournissant un nouvel outil puissant pour la découverte de médicaments antibactériens et les tests de composé.

Mise en place d&#39;un programme d&#39;installation à haut débit pour le criblage de petites molécules qui modulent c-di-GMP Signalisation dans<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Le charcoal agar resazurin assay (CARA) est une méthode semi-quantitative à débit moyen pour évaluer l’activité des agents d’essai contre les mycobactéries qui se répliquent, qui ne se répliquent pas ou qui sont les deux.  Le CARA permet d’évaluer rapidement l’activité dépendante du temps et de la concentration et de déterminer les paramètres à suivre à l’aide d’essais d’unités formant colonies (UFC).

Visualisation de l&#39;Agar Charcoal résazurine Essai pour semi-quantitative, Moyen-débit Enumération des mycobactéries

Un test en temps réel à haut débit a été mis au point pour identifier simultanément (1) les antimicrobiens à pénétration de cellules eucaryotes ciblant un pathogène bactérien intracellulaire, et (2) évaluer la cytotoxicité des cellules eucaryotes. Une variante de la même technologie a ensuite été combinée à la technologie de distribution numérique pour permettre des études faciles, à haute résolution, dose-réponse et en synergie bidimensionnelle et tridimensionnelle.

High Throughput, en temps réel, à double lecture Test de intracellulaires activité antimicrobienne et eucaryotes cytotoxicité cellulaire

Nous avons mis au point un système modulaire de criblage à haut débit pour la découverte de nouveaux composés contre la tuberculose Mycobacterium, ciblant les bactéries à croissance intracellulaire et en bouillon ainsi que cytotoxicité contre la cellule hôte mammifère.

Système d&#39;efficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Nous décrivons ici un protocole qui est un hôte adaptable, entier, outil de dépistage de la forte teneur qui peut être utilisé pour étudier les interactions hôte-pathogène et être utilisé pour la découverte de médicaments.

Un haut débit et haute teneur, liquide à base de c. elegans pathosystème

Les tests d'interaction de co-culture présentés dans ce protocole sont peu coûteux, haut débit, et simple. Ces essais peuvent être utilisés pour observer les interactions microbiennes dans la co-culture, identifier les modèles d'interaction et caractériser le potentiel inhibiteur d'une souche microbienne d'intérêt contre les agents pathogènes humains et environnementaux.

Tests de co-culture à haut débit pour l'étude des interactions microbiennes

La persistance des antibiotiques décrit la capacité de petites sous-populations au sein d’une population isogénique sensible à tolérer transitoirement de fortes doses d’antibiotiques bactéricides. Le présent protocole combine des approches pour caractériser le phénotype de persistance des antibiotiques aux niveaux moléculaire et cellulaire après exposition d’Escherichia coli à des doses létales d’ofloxacine.

Analyse de population et de cellules uniques de la persistance des antibiotiques chez Escherichia coli

Cette étude a mis au point un test de criblage à haut débit contre Mycobacterium abscessus avec une souche à double rapporteur récemment créée, en utilisant la fluorescence et la luminescence pour évaluer rapidement la viabilité bactérienne. Ce protocole sera pertinent pour les chercheurs qui souhaitent cribler de nouveaux médicaments contre cette bactérie résistante aux médicaments.

Développement d’un test pour le criblage de médicaments à haut débit contre les mycobactéries

Découvrez un criblage à haut débit pour identifier des composés chimiques affectant la persistance bactérienne. Cette méthode adaptable permet d'évaluer des panels de médicaments et des bibliothèques de gènes avec précision.

Criblage à haut débit des composés chimiques pour élucider leurs effets sur la persistance bactérienne

Explorer plus de vidéos