Isolement de sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts adipeux intra-abdominaux murins

Le protocole permet aux chercheurs d’isoler des sous-populations fonctionnellement et moléculairement distinctes de cellules stromales de tissu adipeux blanc périgonadique à partir de modèles murins d’intérêt. L’avantage de cette technique est que tous les outils et réactifs sont largement disponibles. Lavanya Vishvanath, analyste de recherche principale du laboratoire du Dr Rana Gupta, fera la démonstration de la procédure.

Après l’isolement de cellules vasculaires stromales à partir de tissu adipeux blanc gonadique, ou WAT, remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de tampon de lyse des globules rouges pour une incubation d’une à deux minutes à température ambiante. Arrêtez la lyse avec 10 millilitres de FBS et de PBS à 2 % et filtrez les cellules à travers une crépine de 40 microns dans un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres. Recueillir les cellules par centrifugation et remettre en suspension la pastille dans 400 à 800 microlitres FBS et PBS, complétés par un bloc FC.

Après une incubation de 10 minutes à quatre degrés Celsius, transférez 400 à 800 microlitres de cellules dans le nombre approprié de tubes pour la coloration des anticorps conjugués à la fluorescence et étiquetez les cellules avec les anticorps témoins et expérimentaux d’intérêt à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, granulez les cellules par centrifugation et lavez les cellules dans 400 microlitres de FBS et PBS frais par tube. Après le lavage, mettez les granulés en suspension dans 400 à 800 microlitres de FBS et PBS frais par tube, et filtrez les cellules à travers des capuchons filtrants de 40 microns dans des tubes à fond rond en polystyrène de cinq millilitres pour FACS.

Régler les portes de compensation et expérimentales pour obtenir les cellules présentatrices d’antigènes et les progéniteurs fibro-inflammatoires. Après le tri cellulaire, collectez et lavez les cellules par centrifugation, et remettez les granulés en suspension dans 500 microlitres de milieu de culture cellulaire présentateur d’antigène gonadique par fraction. Pour la séparation immunomagnétique des fractions cellulaires adipogéniques et non adipogéniques, remettre en suspension la pastille vasculaire stromale dans 10 millilitres de tampon MS et filtrer les cellules à travers une passoire de 40 microns.

Après le comptage, prélever les cellules par centrifugation et les remettre en suspension à raison d’une fois 10 à la huitième cellule par millilitre de concentration de tampon MS. Ensuite, n’ajoutez pas plus de 0,25 gramme d’anticorps conjugués à la biotine anti-CD31 et anti-CD45 par une fois dix sur les six cellules pour une incubation de 15 minutes sur glace. À la fin de l’incubation, laver les cellules dans quatre millilitres de tampon MS par centrifugation, et remettre en suspension la pastille dans 100 microlitres de tampon MS frais.

Ajoutez 10 microlitres de nanobilles de streptavidine dans les cellules pour une incubation de 15 minutes sur de la glace, suivie d’un autre lavage dans quatre millilitres de tampon MS. Remettez la pastille en suspension dans 2,5 millilitres de tampon MS frais et transférez les cellules dans un tube en polypropylène de cinq millilitres. Placez le tube sur un aimant pendant cinq minutes avant de décanter les cellules non marquées dans un nouveau tube à centrifuger de 15 millilitres.

Répétez le lavage deux fois de plus, comme démontré, en retirant les cellules non marquées après chaque lavage, et collectez les cellules appauvries de la lignée endothéliale et hématopoïétique par centrifugation. Remettez la pastille en suspension dans un tampon MS de 100 microlitres et étiquetez les cellules avec pas plus de 0,25 microgramme d’anticorps Ly6C et CD-9 par fois 10 des sixièmes cellules pendant 15 minutes sur glace. À la fin de l’incubation, prélever les cellules adipogéniques négatives Ly6C négatives CD-9 non liées comme nous venons de le démontrer avant de collecter les cellules non adipogènes positives Ly6C.

Ensuite, collectez les deux populations cellulaires par centrifugation et remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de milieu de culture cellulaire présentateur d’antigène gonadique par fraction. Pour mettre en place des cultures cellulaires pour la différenciation, plaquez chaque fraction à quatre fois 10 des quatrièmes cellules par puits en concentration dans des puits individuels d’une plaque de culture de 48 puits et placez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant sept à 10 jours. Les cellules précurseurs des adipocytes commenceront à se différencier en adipocytes à mesure qu’elles approchent de la confluence, tandis que les progéniteurs inflammatoires des fibroïnes résisteront à l’adipogenèse.

En utilisant ce protocole, des populations distinctes de cellules stromales peuvent être isolées à partir de dépôts WAT intra-abdominaux de souris adultes par FACS ou séparation immunomagnétique des billes, comme démontré. Avec la séparation immunomagnétique des billes, les cellules adipogènes et non adipogènes peuvent être isolées de la fraction vasculaire stromale gonadique WAT. Comme observé par cytométrie en flux, 75 % des cellules de la fraction adipogénique sont des cellules précurseurs adipocytaires CD-9 négatives Ly6C, tandis que plus de 75 % de la fraction non adipogénique, des cellules progénitrices fibro-inflammatoires positives Ly6C.

Les cellules précurseurs d’adipocytes isolées de l’une ou l’autre méthode se différencient en adipocytes contenant des lipides avec une grande pureté dans les sept à 10 jours suivant l’ensemencement. En revanche, les précurseurs non adipogéniques restent fibroblastes et ne deviennent pas adipocytes dans les mêmes conditions de culture. Le protocole fonctionne pour l’isolement de sous-populations de cellules stromales adipogéniques et fibro-inflammatoires à partir de tissu adipeux blanc périgonadique.

Des populations cellulaires similaires peuvent être trouvées dans d’autres dépôts adipeux de souris. Cependant, leur sélection reposera sur l’utilisation de différents anticorps. Les populations cellulaires isolées par FACS et séparation magnétique peuvent être utilisées pour des essais in vitro de différenciation cellulaire ou caractérisées par une analyse de l’expression génique.