Génération de bibliothèques d’insertion transposon dans les bactéries gramnégatives pour le séquençage à haut débit

Cette méthode est significative parce qu’elle peut être utilisée chez diverses espèces bactériennes pour identifier les gènes essentiels, les gènes de résistance aux antibiotiques et les gènes importants pour la condition physique in vivo pendant l’infection. Le principal avantage de cette technique est le partage mécanique de l’ADN génomique et de l’édition Poly-CTL, qui éliminent le besoin d’enzymes de restriction coûteuses, de rayonnement adaptateur et de purification du gel. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie des infections bactériennes problématiques, parce que les gènes identifiés comme importants pour l’infection ou la résistance aux antibiotiques, pourraient servir de cibles pour de nouvelles thérapeutiques anti-microbiennes.

Cette méthode peut fournir un aperçu des relations complexes de génotype, de phénotype entre les espèces bactériennes gramnégatives et gram-positives, et améliorer notre compréhension actuelle de la génétique bactérienne. Pour commencer, transférez les cultures du jour au lendemain vers des tubes coniques de 50 millilitres, et granulez les cultures des receveurs et des donneurs à l’aide de centrifugation à 5 000 fois G pendant 7 minutes. Jeter le surnatant.

Utilisez une pipette sérologique de 10 millilitres pour suspendre à nouveau la pastille de souche du donneur dans 4,5 millilitres de LB complétées par de l’acide diaminopimelique. Transférer la souche de donneur re-suspendue dans le tube de souche du receveur. Et distribuez immédiatement la suspension d’accouplement sous forme de gouttelettes individuelles de 100 microlitres sur des plaques d’agar LB, complétées par de l’acide diaminopimelique Incuber les assiettes à température ambiante pendant 30 minutes.

Ensuite, transférez soigneusement les plaques à l’incubateur de 37 degrés Celsius et laissez les cultures s’accoupler pendant une heure. Après l’incubation ajouter 1,5 millilitres de LB sur chaque plaque et récolter les bactéries dans un tube conique de 50 millilitres. Pelleter les cellules acolées à l’aide d’une centrifugation à 5000 fois G pendant sept minutes.

Ensuite, jetez le supernatant et re-suspendre les cellules en 10 millilitres de LB, pour enlever l’acide diaminopimelique résiduel Pellet les cellules à nouveau, et répéter le lavage avec LB. Une fois terminé, utilisez une pipette sérologique de 10 millilitres pour suspendre à nouveau la pastille dans 10 millilitres de LB, complétée par 25% de glycérol. Étendre les cellules sur des plaques, selon les instructions manuscrites. Puis, incuber les plaques à 37 degrés Celsius, pendant la nuit.

Créez un millilitre aliquots des bactéries restantes et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Verser un aliquot de l’accouplement gelé sur la glace. Ensuite, utilisez des perles de verre stériles pour étendre 150 microlitres de la dilution, sur chaque plaque d’agar Luria-Bertani de 30 par 150 millimètres, complétée par de la kanamycine.

Disposer du tube usé contenant un excès d’accouplement et incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 14 heures. Après le compte d’incubation, la colonie forme des unités sur chaque plaque pour estimer le nombre total de mutants dans la bibliothèque du transposon. Comptez 20 % d’au moins trois plaques pour déterminer l’estimation du nombre de colonies pour l’ensemble du groupe de plaques.

Après avoir calculé le rendement estimatif de la colonie, ajouter de trois à cinq millilitres de LB à chaque plaque et racler les bactéries à l’aide d’un outil stérile de raclage. Tirez les suspensions bactériennes de toutes les plaques dans des tubes coniques de 50 millilitres, et granulez les suspensions en centrifugant à 5000 fois G, pendant sept minutes. Jeter le supernatant et suspendre à nouveau la pastille en cinq millilitres de LB, complétée par 30% de glycérol.

Ensuite, faites un millilitre aliquots de la bibliothèque transposon en cryovials et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Diluer le gDNA avec tampon TE à une concentration de 250 nanogrammes par microlitre, dans un volume total de 200 microlitres, et le placer dans le sonicateur bain d’eau. Sonicate l’ADN pour produire des fragments d’environ 300 nucléotides.

Confirmez que l’ADN est cisaillé en exécutant 10 microlitres d’ADN non cisaillé et 10 microlitres d’ADN cisaillé, sur un gel rôti de porc de 1%. Répétez la sonication, si nécessaire. Pour ajouter la queue de graine polly à l’extrémité principale de l’ADN, configurer la réaction politique telle que décrite dans le manuscrit du texte et incuber les tubes de réaction pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Pour purifier la réaction politique, ajoutez 40 microlitres de perles paramagnetic de sélection de taille à chaque échantillon et vortexez le tube de réaction. Incuber des échantillons à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, centrifugez-les brièvement pour recueillir le liquide au fond du tube.

Transférer les tubes sur une grille magnétique et les incuber à température ambiante pendant deux minutes ou jusqu’à ce que la solution soit claire. Retirer soigneusement le supernatant et ajouter 200 microlitres de 80% d’éthanol fraîchement préparé, sans déranger les perles. Incuber les échantillons jusqu’à ce que la solution soit claire.

Retirez ensuite le surnatant et répétez le lavage à l’éthanol. Centrifugez brièvement les tubes et remets-les dans la grille magnétique, pour enlever tout liquide restant. Incuber les échantillons à température ambiante, pendant deux à cinq minutes, pour leur permettre de sécher.

Et ajouter 25 microlitres d’eau à chaque tube. Vortex pendant environ cinq secondes ou pipette de haut en bas. Ensuite, centrifugez les tubes pour recueillir le liquide au fond.

Transférer les tubes sur la grille magnétique et les laisser reposer pendant environ deux minutes jusqu’à ce que la solution soit claire. Ensuite, transférez le supernatant dans un nouveau tube sans déranger les perles. Ce protocole a été utilisé pour générer une bibliothèque de transposon à haute densité dans la souche A-baumannii ATCC 17978, par conjugaison bactérienne à l’aide d’E-coli MFD DAP auxotroph, qui reproduit le pJNW684 plasmide.

La bibliothèque mutante transposon A-baumannii tirée a été utilisée pour identifier les facteurs de forme physique, importants pour la résistance à la colistine sous des concentrations sous-inhibitrices de l’anti-microbien. Après avoir appauvri la bibliothèque mutante de gènes qui contribuent à la résistance à la colistine, l’ADN total de l’attraction restante de la bibliothèque a été isolé des cultures de contrôle et expérimentales. Le gDNA a été fragmenté avec le cisaillement mécanique et une queue de politique a été ajoutée aux fragments d’ADN en préparation pour le séquençage.

Les concentrations d’ADN ont été calculées et les échantillons ont été analysés à l’aide d’électrophoresis capillaires à base de copeaux, afin de confirmer le succès des constructions de bibliothèques. La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est d’ajuster le volume d’accouplement, en fonction du nombre de CFU pour des souches cibles spécifiques pour générer une bibliothèque mutante haute résolution. En outre, la souche du receveur doit être sensible au marqueur de résistance aux antibiotiques, en utilisant le transposon avant la mutagenèse.

À la suite de cette procédure, la suppression génétique ou la méthode de dicton sonore peut être effectuée pour assommer les têtes individuelles obtenues à partir des résultats de séquençage et valider les gènes d’intérêt dans des conditions difficiles.