Une procédure ChIP-Seq semi-automatisée pour les études épigénétiques à grande échelle

Ce protocole est important en ce sens qu’il permet l’analyse ChIP-Seq à haut débit d’échantillons primaires afin de mieux comprendre les mécanismes cis-régulateurs et leur implication sur la maladie. Les principaux avantages de cette méthode sont la reproductibilité des données et la réduction drastique du temps passé en laboratoire. Pour le cisaillement de la chromatine, ajoutez 70 microlitres de tampon de lyse complet, frais et à température ambiante, à une pastille d’intérêt fixée à la glycine, congelée et décongelée, pour une incubation d’une minute à température ambiante, suivie d’une minute de remise en suspension sans bulles.

Incuber l’échantillon pendant une autre minute à température ambiante, avant de placer les cellules sur de la glace. Transférez la pastille remise en suspension dans un tube de 0,65 millilitre à faible fixation sur de la glace, avant de charger le tube sur le support de tube d’un sonicateur. Remplissez tous les espaces avec des tubes d’équilibrage contenant 70 microlitres d’eau et laissez les cellules se stabiliser dans le bain-marie pendant environ une minute avant de commencer la sonication.

Après trois cycles, retirez les échantillons du sonicateur pour un vortex doux, et pulsez les tubes avant de les remettre dans le support. Pour la modification des histones, ajoutez 100 microlitres de tampon tC1 complet à chaque tube de deux bandes de huit tubes de puce, et transférez 20 microlitres de chacun des 16 échantillons partagés par la chromatine dans des tubes individuels des bandes de huit tubes de la puce. Laver les tubes de chromatine avec 80 microlitres de tampon tC1 complet, et regrouper les lavages dans les tubes appropriés des bandes de puces à huit tubes pour un volume final de 200 microlitres de solution par tube.

Ajoutez le volume approprié d’anticorps à 500 microlitres de tampon TBW1, et faites rapidement un tourbillon et une impulsion de spin. Ajoutez ensuite 70 microlitres de tBW1 et 30 microlitres de solution d’anticorps dans chaque tube d’une nouvelle puce à huit tubes. Ensuite, manipulez soigneusement un récipient de solution de billes de protéine A et ajoutez cinq microlitres de billes pour 0,5 microgramme d’anticorps dans une nouvelle bande de tube.

Faites tourner la bande de billes par impulsion et remplissez la dernière rangée du manipulateur de liquide à puces avec des bandes de huit tubes de puces vides étiquetées. Suivez ensuite les spécifications du programme chip 16-I pure 200 D pour le placement du reste des bandes, et chargez les tampons dans les positions correctes. Après le séquençage, capturez les billes dans une bande magnétique à huit tubes et transférez 25 microlitres de tampon de marquage dans chaque tube.

Une fois les tubes retirés de l’aimant, mélangez doucement, jusqu’à ce que les solutions de billes soient homogènes, avant de placer les tubes rebouchés dans un ThermoMixer préchauffé pendant trois minutes. À la fin de l’incubation, retirez les bandes de huit tubes de la dernière rangée du manipulateur de liquide à puces et ajoutez deux microlitres de Rnase A à chaque échantillon. Ensuite, faites tourner les tubes rebouchés et mélangez doucement, jusqu’à ce que les solutions de billes soient homogènes.

Pour une purification des fragments d’ADN marqués, transférez 100 microlitres d’échantillons d’ADN réticulé D dans des tubes individuels de 1,5 millilitre, et lavez les tubes avec 100 microlitres de tampon de liaison à l’ADN par tube. Pulsez les lavages dans les tubes appropriés et chargez les échantillons sur des colonnes. Placez les colonnes dans de nouveaux tubes de collecte de 1,5 millilitre et ajoutez neuf microlitres de tampon Tris-EDTA à 55 degrés Celsius directement dans les matrices de colonnes.

Au bout d’une minute, centrifugez les colonnes et transférez les neuf microlitres d’éluat de chaque colonne dans une nouvelle bande de huit tubes sur de la glace. Éluer à nouveau les fragments d’ADN comme démontré, mais avec huit microlitres de tampon Tris-EDTA, et regrouper l’éluat avec la solution de fragments d’ADN précédemment récoltée. Pour amplifier les échantillons de fragments d’ADN purifiés, mélangez les échantillons à l’aide d’une pipette multicanaux et effectuez un programme d’amplification avec le nombre de cycles approprié.

Après l’amplification, utilisez une plaque magnétique pour capturer les billes et jetez le surnageant. Lavez les billes trois fois avec 200 microlitres d’éthanol frais à 80 % par lavage, sans perturber la pastille de bille. Après le dernier lavage, utilisez une pointe de pipette de 20 microlitres pour enlever tout excès d’éthanol et laissez les billes sécher pendant 10 minutes, ou jusqu’à ce que des fissures apparaissent dans les granulés de billes.

Ajoutez 40 microlitres d’eau préchauffée à chaque échantillon séché et scellez la plaque avant de tourbillonner complètement, et de faire tourner brièvement par impulsions. Quantifiez ensuite l’ADN, à l’aide d’un test de quantification par fluorescence, selon les protocoles standard. Les mesures de la taille des fragments de chromatine cisaillés démontrent une grande reproductibilité, plus de 70 % des échantillons étant observés entre 100 et 500 paires de bases pendant 14 cycles.

Comme illustré, le cycle auquel l’intensité de l’échantillon marqué est la moitié du maximum moyen est optimal pour la détermination du cycle. Les meilleures données de séquençage sont obtenues lorsque plus de 85 % des fragments d’ADN varient entre 200 et 1000 paires de bases. Dans ces pistes d’enrichissement représentatives pour quatre loci de gènes, les pistes individuelles de chaque échantillon montrent une qualité de cartographie élevée et un rapport signal/bruit élevés.

Les deux premiers loci hébergent des gènes bien exprimés dans ces types de cellules, tandis que les gènes des deux derniers loci ne sont pas exprimés et servent de contrôles de fond. Pour la majorité des comparaisons par paires, les indices de corrélation de Pearson montrent une corrélation de plus de 90 %, ce qui suggère un haut niveau de cohérence entre les réplicats biologiques. Alors que les loci spécifiques au type cellulaire présentent un enrichissement élevé dans les cellules appropriées, un gène de maintien montre une modification très cohérente des histones.

L’analyse de corrélation entre l’ensemble de données ChIP-Seq réalisée à partir d’échantillons de moins de 100 000 cellules démontre toujours une reproductibilité élevée et une corrélation jusqu’à 10 000 cellules. Cependant, il y a une augmentation du bruit de fond à mesure que le nombre de cellules diminue, ainsi qu’une diminution de leurs coefficients de corrélation. Une bonne lyse des cellules est essentielle pour générer des données de haute qualité, car nous avons constaté qu’une lyse cellulaire incomplète affecte le reste du protocole.

En utilisant cette méthode, de nombreuses modifications d’histones et facteurs de transcription différents peuvent être testés sur divers types de cellules d’intérêt pour approfondir notre compréhension des éléments cis-régulateurs.